1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?
⑴按生长方式分为二型：
粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）
⑵可分四型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞
2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程
⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：
①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。
以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、
其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂
机制：接触抑制、密度限制
3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.
⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。②促细胞生长因子：多由血清提供
⑵细胞的生存环境：①温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。②气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程，ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度，一般多为开放式培养③培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力④无污染、无毒。
4．什么是细胞培养用液,主要分为哪几类?
⑴培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡盐溶液；培养基；其他培养用液。5．D-Hank’s与Hank’s的主要区别是什么?
D-Hank’s不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶液。
6．简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。
胰酶(trypsin)溶液：浓度一般为0.1％～0.25％，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。
7.细胞培养中血清的主要作用？
(1)提供基本营养物质； (2)提供贴壁和扩展因子 (3)提供激素及各种生长因子； (4)提供结合蛋白 (5)对培养中的细胞提供某些保护作用
8.血清的使用与储存有哪些注意事项？
（1）使用前的处理：使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
（2）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。
9.简述干粉培养基的配制过程。
DMEM培养液的配制（举例）：⑴900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将DMEM 粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。⑵用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2。⑶加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL ⑷用0.22um的滤膜过滤除菌。⑸分装（200 mL 左右）后4℃冰箱保存。
10.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用?
一般包括：准备室、培养室和缓冲室。作用：⑴准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。⑵培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过2.5M。⑶缓冲室：（更衣室）
11. CO2培养箱的作用及使用中的注意事项。
用于维持适当温度、湿度与pH。注意事项：⑴质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度;培养箱的温度设在35～37℃，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。⑵培养容器需与外界保持通气状态。⑶箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）⑷水槽:保持一定湿度
12. 试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。
⑴清洁液 :重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液 63∶1000∶200 ，次强清洗液 120∶ 200∶1000 ，弱清洁液 100∶ 100∶
1000
⑵配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色
13．简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。
⑴物理消毒灭菌法
①紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）；紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。②过滤：0.22μm（适用于液体）
③湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min
各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：
培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟
布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟
④干烤：160℃, 2 小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
⑵化学消毒灭菌法：①7５%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。②1－２‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。③抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。不要在原代培养中加入抗生素。
14. 如何对玻璃器皿进行有效清洗？
玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。⑴浸泡：①初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，
以中和其中的碱性物质。③再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。⑷冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干（或烘干）备用
15．细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么?
青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。
16．什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。
⑴原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称
原代培养。
⑵原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。
主要步骤：
贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。
消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块—对滤过液离心（<1000r/min, <10min）——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养
17．何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。
⑴传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养
瓶的培养。
⑵贴壁细胞传代培养：①选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，
倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。②加入适量0.１％－0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。
③用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。
④以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。⑤观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。
18．收集细胞时一般常用的转速和时间是多少？
转速：1000r/min；时间：5min
19. 什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？
⑴冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。
⑵①冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。
当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。②冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。③复温速率指在细胞复苏时温度升高的速度。
一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。④冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。
分为：渗透性：常用甘油、DMSO
非渗透性
甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
保护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。
20．冻存的细胞一般如何复苏？
1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。
3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。 4)将细胞悬液经800～1000 r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加足培养液进行培养。21．简述培养细胞的非玻璃化冻存过程。
非玻璃化冻存——是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70～-80℃，然后投入液氮进行保存；该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。
冻存过程：(1)待冻存细胞悬液的准备：①按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。②将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。③向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。④按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。⑤在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。
(2)分级冷冻：①先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min。②接着置于普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min。③再于-30℃放置30min 左右（可省略）。④然后在-70～-80℃下过夜。⑤最后将冻存小管投入液氮保存。还有一种简单的方法，就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20 min，再直接投入液氮中保存。第三种方法是，用4℃预冷的冷冻保护液悬浮细胞，分装冻存小管后，将冻存小管放在4℃下30min；然后置于壁厚1 cm以上的泡沫塑料小盒内封好，立刻将小盒放置在-70～-80℃冰箱中24h以上至1周；
再将冻存小管投入液氮中保存。
(3)记录：做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及冻存经手人。
22．DMSO使用时应注意哪些事项？
⑴在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身有灭菌作用。
⑵在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。
⑶由于许多冷冻保护剂(如DMSO))在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。
23. 细胞培养中常见有哪些微生物污染，有何主要特征？
⑴真菌污染：真菌种类多，形态各异，但污染后均不难发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下观察呈丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。⑵细菌污染：污染后大多能改变培养液pH 培养液变混浊，毒性大的细菌很快导致细胞崩解死亡。加用抗生素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。⑶支原体污染：支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的一种污染。
24．运送细胞的比较简便的方法是哪一种，简述其过程。
⑴一是用液氮或干冰保存运输，效果较好，但需用特制容器如小液氮罐等，又因液氮和干冰蒸发均较快，适于空运，比较麻烦;二是充液法运输，比较简便。
⑵充液法运输操作如下：①选生长状态良好的细胞，待达80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部(过满易污染)，保留少许空间，塞紧瓶塞，空气过多运输中气泡运动易使细胞脱落; ②妥善包装和运送；一般在不超过四五天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响; ③到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。
25. 简述细胞污染的概念及种类.
⑴细胞污染: 凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都视为污染。⑵组织培养污染: 微生物：真菌、细菌、支原体和病毒；
化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分；细胞：不同细胞类型的交叉污染。
26. 细胞培养中污染主要通过哪些途径，一般如何预防？
⑴空气: 培养设施不宜置于通风场所；定期清理净化工作台的过滤层，防止阻塞；操作中应减少空气流动；带口罩；夏季潮湿季节空气中含菌数量多，每立方米内含菌数不应超过1～5个。⑵清洗消毒：培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。⑶操作：实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等；或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎使用同一吸管或培养用液，可能导致细胞交叉污染。⑷血清：血清也是污染细胞的来源，有的市售血清制备水平低、检测不严，常已被支原体和病毒污染。⑸组织：初代培养组织常有污染；有的是在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织(如已发生溃烂的肿瘤组织)；手术用碘酒消毒后，擦拭不净可能混入碘污染。
27．细胞计数的操作要领及计算公式是什么？
⑴具体操作程序如下：①取血细胞计数板和盖玻片，用75%酒精擦净。将盖玻片放于计数板上。②用滴管取混合均匀的细胞悬液，滴入计数室内。要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数。③统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右
⑵计算：一般以每毫升含细胞数来表示，大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml ＝（?四个大格子细胞数/4)?×104?×稀释倍数；计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。
⑶用细胞计数板计数时应注意的事项:①不要漏计，不要重复②细胞悬液应混
合均匀③浓度不可过高也不可过低。
28. 简述细胞生长曲线绘制过程及其应用。
⑴细胞生长曲线(cell growth curve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。
⑵制作方法：①培养细胞：首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。②计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。③绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。
29. 简述MTT比色法的原理及操作过程。
⑴原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将染料MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐)转变为不可溶性的紫色结晶，后者被DMSO（或酸性异丙醇）溶解后所呈现的色度(用OD值表示)反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。
1.MTT溶液的配制
用PBS液(pH7.2)或者生理盐水将MTT配成5mg／m1的溶液。（用0.2μm滤膜过滤）。
保存：于4℃避光保存。可用2周。若暂不用，可冻存。
2.实验过程：（1）、将细胞培养于96孔培养板。（2）、按不同实验要求处理细胞。（3）、每孔加入15-20μlMTT液，继续培养3～4h。（4）吸去培养液，每孔加入200μlDMSO,在微型振荡器振荡5min,充分溶解混匀。（5）在酶标仪上测定光吸收。测定波长为490nm，以只加培养液的的培养皿为空白对照。
3.结果分析：细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值*100％
4.注意事项：(1)高浓度血清可影响光吸收值,常使用含10%血清的培养液,在加入异丙醇溶液或DMSO前尽量吸净培养液。(2)吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。
30. 简述台盼蓝排除检测法原理
原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。最常用的为“台盼蓝排除检测法”
(2)活体染色与细胞计数：①将1滴细胞悬液(贴壁细胞可经0.25％胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成细胞悬液)与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。
②2min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。
注意事项:台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。