《微生物检测实验》课程教学大纲
一、制定实验教学大纲的依据
参考其它院校相关专业的实验内容，参照国家最新标准和本课程的基本技术，结合我系专业课程的设置而制定，便于学生掌握和学习最新的检验方法。
二、本课程实验教学在培养能力中的地位和作用
《微生物检测》是国内许多高等院校为食品、制药、微生物等专业的本科生和大专生开设的专业课，同时在食品和药品生产及科研工作中应用广泛，主要通过实验使学生得到微生物学检测实验技技能的训练，使他们了解或掌握国内外先进的技术和方法，与迅速发展的学科前沿接轨，同时可以适应将来实际工作的需要。《微生物检测实验》是辅助微生物检测课程而开设的一些常规实验技术，用以培养学生的实验操作能力的重要教学环节，着重训练学生的基本操作技能。总之，通过微生物检测实验，培养了学生独立动手能力和科学观察能力，明确实验是科学研究工作之本，树立严谨的科学态度和端正的科学作风，为今后正走向社会，走上工作岗位奠定良好的基础。
二、实验目的与应达到的实验能力标准：
本课程安排了以下几个实验：（1）口服活菌制剂的微生物检测；（2）MPN法测定大肠菌群；（3）ELISA定量测定食品中的AFB1。
通过上述实验可达到如下实验目的和标准：
1. 掌握食品检样的采集和处理；
2. 掌握测定菌落总数和大肠菌群的国标法；
3.掌握ELISA测定微生物毒素的原理和步骤。
三、教学文件及教学形式：
教学文件：《微生物学实验》（第三版）沈萍、范秀容主编高等教育出版社
教学形式：预习、讲授、演示、学生动手实践
五、实验成绩评定：
侧重平时实验要求，占总成绩30%，平时实验报告占70% 六、实验教学项目表
《微生物检测实验》讲义
实验一、口服活菌制剂的微生物检测
一、实验目的
掌握乳酸菌饮料的卫生学的微生物检测方法，通过检测菌落总数、酵母菌数、霉菌数，了解产品的卫生质量，通过对乳酸菌的数量的检测，了解该产品的质量。
二、实验原理
1．菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
2. 霉菌和酵母广泛分布于自然界，并可作为食品中正常菌相的一部分。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成产品的腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
3．乳酸菌 lactic acid bacteria：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。乳酸菌菌落总数lactic acid aerobic bacteria是指检样在一定条件下培养后，所得1 mL(g)检样中所含乳酸菌菌落的总数。检测乳酸菌饮料中乳酸菌的含量是检查产品质量的标准。
三、实验器材
1.培养基：营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、改良TJA琼脂培养基、MC培养基。
2.仪器：电子天平、超净工作台、灭菌锅、烘箱、培养箱、试管架、电炉子、记号笔、吸管、试管、接种针、接种环、酒精灯、脱脂棉、石棉网、精密试纸、三角瓶、培养皿、
3.菌种：大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌。
四、实验步骤
1.菌落总数的检验步骤和方法
图1 菌落总数检测步骤图
检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》；SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》
(1) 样品制备：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。
（2）梯度稀释：用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。根据标准要求或对污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
(3) 倾注平板：将凉至46℃(应以皮肤感受较热而不烫为宜)营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
(4) 培养计数：待琼脂凝固后，翻转平板，需氧菌落总数置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。
(5) 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。
（6）选取菌落数在30－300之间的平板进行计数。
2.霉菌和酵母的检验步骤和计数方法
测定步骤同菌落总数。采用孟加拉红培养基，20-25℃温箱内培养72h～120h。具体检测标准参见：GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》。
3.乳酸菌的检验步骤和计数方法
测定步骤同菌落总数。培养基采用改良TJA和MC培养基。36士1℃培养72±3h，具体检测标准参见：GB/T 4789.35—2003，中华人民共和国国家标准。
选取菌落数在30－300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取五个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样104的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，则1mL检样内乳酸菌数为35×4／5×104=2.8×105
五、微生物检查实验记录
结论：
检验人：复合人：
实验二多管发酵法测定大肠菌群
一、实验目的
1．学习测定大肠菌群数量的多管发酵法。
2．了解大肠菌群的数量在水中及产品中的重要性。
二、实验原理
1．大肠菌群的定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。以大肠菌群最近似数（most probable number,MPN）来表示。
2．大肠菌群检验方法：
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。国家标准采用三步法，即多管发酵法：包括乳糖发酵试验（初发酵）、分离培养和证实试验（复发酵试验）。
发酵试验：在2个装有50mL的3倍浓缩（三料）乳糖胆盐蛋白胨培养液（含溴钾酚紫指示剂）的大试管或烧瓶中，无菌操作加水样100mL。在10支装有5mL的三料乳糖胆盐发酵管中（内有倒置小管），以无菌操作各加水样10mL,摇匀后，37℃培养24小时（自来水）；样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气（水源水）。
平板分离：将产酸产气及只产酸的发酵管，接种于伊红美蓝（紫黑色有金属光泽）或远滕氏（淡粉红色）、麦康凯（玫瑰红色）琼脂平板上，35-37℃培养24小时。
证实试验：将革兰氏染色阴性无芽孢杆菌菌落接种于单料乳糖发酵管中，35-37℃培养24小时，培养基由原来的紫色变为黄色，倒管中有气泡，为产酸产气，即证实有大肠菌群存在。
报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》
三、实验器材
1．培养基：乳糖蛋白胨发酵管，伊红美蓝（紫黑色有金属光泽）。
2．仪器、耗材：电子天平、超净工作台、灭菌锅、烘箱、显微镜、培养箱、试管架、电炉子、pH计。记号笔、三角瓶、带塞玻璃瓶、培养皿、移液管、吸管、试管、德汉氏小管、载玻片、盖玻片、酒精灯、脱脂棉。
3．试剂：溴钾酚紫、乳糖、蛋白胨、EMB培养基（伊红、美蓝）、磷酸氢二钾、无水亚硫酸钠、碱性复红、乙醇、结晶紫、草酸铵、碘片、碘化钾、番红。
四、实验步骤
图2 大肠菌群的检测步骤
在检测前，在检样水中加入万分之一的硫代硫酸钠来中和余氯。
五、检索MPN表
MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。
饮用水的MPN值检索表
六、实验报告
饮用水的检测报告
实验三、ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）测定AFB1
一、实验目的
了解ELISA的原理。掌握快速测定黄曲霉毒素B1的方法。
二、实验原理
利用固相酶联免疫吸附原理，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测AFB1，适用于食品、饲料及相关原料中AFB1的定量和定性检测。
图3 抗原竞争法原理
三、实验器材
仪器：酶标仪、移液枪（100、200、1000微升）、培养箱、冰箱、天平、灭菌锅、。
耗材：记号笔、滴管、脱脂棉、48孔聚苯乙烯酶标板、25mL容量瓶或具塞试管、分液漏斗、移液管、烧杯、量筒、具塞锥形瓶、蒸发皿
试剂：酶标诊断试剂盒、甲醇、石油醚、三氯甲烷等
食品：面粉或玉米粉或啤酒
四、实验步骤
1.制备样品
啤酒：准确吸取5mL样品于25mL容量瓶，准确加12.5mL甲醇，蒸馏水定容至25mL。震摇10min，即为待测样。
面粉：称取10g面粉于100mL具塞锥形瓶中，准确加入50mL甲醇水溶液（1:1），震摇15min，过滤，收集滤液为样品提取液。准确吸取10mL滤液于分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞轻轻震摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先泳三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的快速定性滤纸过滤于100mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复提取，一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。冷却后，准确加入10mL 甲醇水溶液（1：1），充分溶解得到样品提取液。
玉米粉：称取5玉米粉于100mL具塞锥形瓶中，准确加入25mL甲醇水溶液（1:1），震摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集滤液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂（样品稀释液）将样品提取液进行适当稀释，即为待测样液。
2.试剂配置
（1）每瓶酶标抗原中准确加入1.5mL酶标抗原稀释液，充分溶解。2-8℃保存。
（2）取适量浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍待用。
3.操作步骤：
（1）试剂平衡至室温
（2）小孔编号：设置调零孔、标准对照孔、样品孔
（3）洗涤：每孔加入250μL洗涤液，放置1min，甩掉吸干。
（4）反应组成：
第一步：1号孔加入50μL样品稀释液，2-7号孔加入AFB1标准溶液0-2ng各50μL，其余孔加入相应的待测样液。
第二步：1号孔加入50μL酶标抗原稀释液，其余孔均加入50μL酶标抗原溶液。
第三步：轻轻震摇，使反应物均匀。
（5）反应：将反应板放入37℃恒温箱中孵育30min。
（6）洗涤：取出反应板，甩掉反应液，拍干。每孔加入250μL洗涤液，2min后甩掉拍干，重复4次。
（7）显色：每孔分别加入显色底物液a和b各50μL，放入37℃恒温箱中显色15min。
（8）终止与仪器测定：每孔分别加入终止液50μL，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。
（9）样品定量计算：绘制AFB1标准曲线图，横坐标为标准液浓度的常用对数值，纵坐标为各标准液孔A值与0ng/mL标准液孔的A值的比值。计算待测样品孔的A值的比值，查标准曲线可得lgC,求其反对数，可得C,
AFB1含量（ng/g）=C×(V/M) ×D
C: 待测样中AFB1含量（ng/mL）
V：样品提取液体积（mL）
M: 样品质量（g）
D: 样品稀释倍数
附录：
1. 培养基的配置
营养琼脂培养基
成分：
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
制法：上述各成分加入蒸馏水中溶解后，调pH为7.4, 分装后，121℃灭菌20min。
用途：用于需氧菌的计数。
孟加拉红(虎红)培养基
成分：
蛋白胨 5g
葡萄糖10g
磷酸二氢钾1g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g
琼脂20g
1/3000孟加拉红溶液100mL
蒸馏水1000mL
氯霉素 0.1g
制法：上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min。
用途：分离霉菌及酵母。
改良MC培养基（Chalmers Agar , Modified）
成分：
大豆蛋白陈 5.0g
牛肉粉 5.0g
酵母粉 5.0g
葡萄糖 20.0g
乳糖 20.0g
碳酸钙 10.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
1％中性红溶液 5.0mL
制法：将前面7种成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加人中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。用时加热溶化琼脂，冷至50℃,酌情加或不加硫酸多粘菌素B(检样有胖听或开罐后有异味等疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B,混匀后使用)。
用途：在08GB中，MC培养基是用于食品中乳酸菌检测的。
改良番茄汁培养基（Tomato Juice Agar, Modified）
成分：
番茄汁 50mL
酵母抽提液 5g
牛肉膏 10g
乳糖 20g
葡萄糖 2g
磷酸氢二钾(Kz HPO,) 2g
吐温-80 lg
乙酸钠 5g
琼脂 15g
蒸馏水 1000mL
pH6. 8士0. 2
制法:
番茄汁的制作 :将新鲜番茄洗净，切碎(切勿捣碎)，放人锥形瓶，置4℃冰箱8h～12h，取出后用纱布过滤。如一次使用不完，可将其置人0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。
将所有成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.8士0.2。分装，121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。
用途：在08GB中，MC培养基是用于食品中乳酸菌检测的。
乳糖胆盐发酵管（1）
成分：
蛋白胨20g
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
乳糖10g
0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL
蒸馏水1000mL
pH7.4
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
乳糖胆盐发酵管（2）
成分：
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
乳糖 5g
氯化钠 5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g
蒸馏水 1000mL
制法：将蛋白胨、牛肉膏、胆盐及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一
个小倒管，115℃高压灭菌15min。
注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
伊红美蓝琼脂培养基成分:
营养琼脂培养基pH7.4 100mL
2%曙红钠2mL
20%乳糖溶液5mL
0.5%亚甲蓝 1.3～1.6mL
2011年需补充的耗材
电炉子 5
25mL吸量管15支
50mL吸量管15支
营养琼脂培养基250mL 1瓶
虎红培养基250mL 1瓶
霉菌培养基250mL 1瓶
乳糖胆盐发酵培养基250mL 2-3瓶
大肠菌群快速检测纸片30片
细菌总数快速测定纸片30片
热敏打印纸1卷
2011年实验注意事项
1.配培养基时尽量采用成品培养基
2.配培养基时分大组，每组负责自己所使用的全部培养基和耗材，将培养基配置的时
间进行间隔，每组30min，避免混乱，不配培养基的各组，在各自的座位上核算培养基的准确用量，耗材的数量，并进行包裹。
3.在第二次实验课时，虽然同时作菌落总数和大肠菌群的试验，但是也要通过分组和
固定倾注平板的时间区段来控制场面，避免混乱。如一半人先作大肠菌群的检测及倾注EMB，另一半人则倾注菌落总数的平板。然后再转换角色。
4.前两个实验都有镜检的环节，可试具体情况来定。
5.在测大肠菌群时，除了要提醒作阳性对照和阴性对照外，还要记得配一些单料乳糖
发酵培养基，以备复发酵使用。
6.菌落总数要提醒大家检测不同的微生物培养的温度和时间不同。
实验细节备注
第一周准备实验一和实验二
第二周实验一和实验二的接菌及培养
1 试剂
乳酸饮料1瓶／组，共需15瓶，或一板思连康梯度稀释及倾注培养基
硫代硫酸钠适量，去除水中余氯
氢氧化钠溶液，调节pH
2 安排
一半人进行多管发酵；一半人进行菌落计数
第三周平板分离及复发酵
第四周实验三实验二的镜检
一半人镜检，一半人测毒素；然后交换
第五周出具全部实验报告
实验1: 显微镜的使用及细菌形态的观察（2学时） 目的要求 (1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。 (2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。 1.基本原理 显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10×）、高倍物镜（4mm，40—45×）和油镜（1．8 mm，95—100×）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大1000—2 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。 使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。
利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示： NA＝n·sinα 式中 NA=数值孔径； n=介质折射率； α=最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图Ⅲ-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，α的理论限度为90°，sin90°=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°=0．87，则： 以空气为介质时： NA=1×0．87=0．87 以水为介质时： NA=1．33×0．87=1．15 以香柏油为介质时： NA=1．52×0．87=1．32 显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。 式中λ=光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0．55μm，假如数值孔径为0．65的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0．42μm。而在0．42μm以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1．25的油镜时，能辨别两点之间的 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=0．65），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有0．42μm。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=1．25），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出0．22μm间的距离。 2.材料及器材 显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、各种细菌微生物制片标本、吸水纸、纱布、瓷盘、酒精灯、接种工具、打火机、试剂瓶、牙签等。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
课程编号： 《微生物学实验》教学大纲 学时数：108讲课：108 学制：四年制本科 适合专业：生物科学相关专业 一、本课程的性质和任务 （一）课程的性质： 微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 （二）课程的任务： 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，要求学生熟悉微生物学方法与技术，掌握无菌操作技能和建立无菌概念是微生物学实验中最重要的内容，重点掌握最基本的无菌操作技能，如接种、纯培养、计数等。 二、本课程与其他课程的联系： 1. 通过教师示范、讲解与学生实际操作相结合方法，使学生牢固树立无菌概念，掌握显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、微生物计数、培养基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等基本操作技能，基本了解常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注意事项，树立严谨求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力，培养勤俭节约、爱护公物和相互协作的优良作风。 2. 本实验课内容包括验证性实验、综合性实验两个部分。验证性实验主要
通过光学显微镜镜检观察方法进行教学，综合实验在教师指导下学生根据所掌握的理论基础和实验技能，由学生自己动手完成。实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告。 三、教学内容 （一）实验一实验室安全教育与微生物学实验室常用的器皿 目的要求 掌握实验室安全规则，了解微生物学实验所用的器皿，因其大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此了解其质量、洗涤和包装方法的要求。 实验内容 一、器皿的种类、要求与应用： 1、试管 大试管(约18mm×180mm) :可装倒平板用的培养基；可作制备斜面用；装液体培养基用于微生物的振荡培养 中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用；用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 2、容量瓶 主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。 3、量筒 用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。 4、三角瓶 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。 5、烧杯 呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±5%。 6、烧瓶 通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
口腔微生物学实验指导 （2005年） 前言 口腔微生物学实验课是本课程学习过程中的重要环节。其目的在于加深和巩固对理论知识的理解和体会；掌握和熟悉口腔微生物学研究技术和方法，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，为今后工作打下良好基础。 一、标本的采集与运送 口腔是人体与外界相通的器官，存在多种微生物群。从口腔中可分离培养到各种需氧、微需氧或厌氧、兼性厌氧的细菌。口腔微生物的分离培养是确定各种细菌最常用的方法。（一）口腔标本取材与运送原则 口腔微生物培养检查的临床标本主要有唾液、龈沟液、龈上菌斑、龈下菌斑，感染根管组织，牙槽脓肿的脓液，颌面间隙感染的脓液或分泌物等。 以上标本的采集应根据其培养目的来确定采集方法及注意事项。需氧菌采用棉拭子法，厌氧菌采用厌氧采集技术，尽量减少标本与空气的接触及培养物的放置时间，以提高厌氧菌的检出率。在采取标本中必须无菌操作。 口腔临床标本的微生物学检查，大多数与厌氧菌有关，在标本采集后，要求立即用厌氧方式运送到培养箱中孵育。脓液或唾液标本可直接用注射器针筒运送，大多数标本均应加入具厌氧条件的还原转送液运送到实验室。减少氧敏感细菌在运送过程中死亡，保证厌氧菌的检出。 （二）几种常见标本的采集方法 1.唾液： 最佳采集时间为晨间起床后，刷牙洗漱前或两餐之间。（10：00 am或4：00pm）。在采集标本前令受检者用温开水清漱口中的食物残渣，然后自然排出唾液于无菌容器中，至少采集0.5—1ml。然后塞好管口，立即送检。 2.牙菌斑： 按菌斑的位置可分为龈上菌斑和龈下菌斑两大类。龈上菌斑指牙颈部龈缘以上牙面的牙菌斑，龈下菌斑指牙龈缘内侧被牙龈所覆盖牙面上的菌斑。 （1）龈上菌斑的采集： 适用于牙龈炎和早期牙周炎的细菌分离。受检者用温开水漱口后，用菌斑指示剂显示出龈上菌斑，然后在无菌纱球局部隔湿的情况下，用无菌匙形器采集，转至有还原转移液的无菌试管中送检。 （2）龈下菌斑的采集： ①取菌器采集：有带充气导管的采集器（见图1）及Moore 00取菌器。受检者经温开水漱 口后，用取菌器采集，放入有还原转送液的无菌试管中送检。 ②灭菌纸尖采集法：温开水漱口，刮除龈上菌斑，采集部位用纱球隔湿，用无菌镊子将灭 菌滤纸尖直接插入龈沟或牙周袋内（见图2），放置数秒后取出放入还原转送液，加盖后尽快送检。该法较简便，但易被唾液污染。 ③匙形洁牙器采集：温开水漱口后，用菌斑指示剂显示菌斑，并除去龈上菌斑。在隔湿条 件下，将无菌匙形洁牙器伸入龈沟或牙周袋内，刮取龈下菌斑，然后将菌斑置入盛有小玻璃珠和还原转送液的无菌管中，加盖液体石蜡后立即送检。该方法简捷方便，但不易
微生物学实验教学大纲 课程名称：微生物学实验课程编码：0431030706 英文名称：Microbiological experiment 学时：36学分：2 适用专业：制药工程及相关专业课程类别：必修 课程性质：专业基础课先修课程：微生物学 参考教材：杜连祥，路福平主编。《微生物学实验技术》，中国轻工业出版社，2005，8. 一、制定本大纲的依据 本教学大纲是根据教学目的、要求以及实际教学学时制定的，课程总学时为36学时。在不妨碍教学内容的系统性与逻辑性的前提下（包括前后实验内容的衔接关系），主讲教师可以按照自己的具体教学情况或经验，适当地将某些内容的次序加以变更或调整。 二、本实验课程的具体安排 实验项目的设置及学时分配（表）
三、本实验课在该课程体系中的地位与作用 微生物学实验课是与微生物学理论课同学期开设的一门重要的技术基础课。通过本课程的教学，使学生较熟练的掌握微生物学实验的基本操作技术和初步掌握研究微生物的基本方法。通过对具体微生物材料的观察、分析，进一步加深和巩固对微生物学理论课所学知识的理解并提高学生分析和解决实际问题的能力。 四、学生应达到的实验能力与标准 通过本课程的教学，使学生掌握进行常规常见微生物检测的实验原理和基本方法，具有独立进行微生物学检测实验方案的设计、初步具备利用微生物学手段分析和解决发酵生产过
程中有关实际问题和从事有关科学研究工作的能力。 要求学生了解实验室的布置以及实验室的规则；使学生熟练掌握显微镜的使用技术并熟悉显微镜的使用技术并熟悉显微镜的构造及保养方法；学会干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱的使用；具有选择和制备培养基的能力；掌握基本染色原理和方法以及制片技术；熟悉细菌、酵母菌、霉菌的基本形态结构、生理生化特征和血清学特性，具有菌种初步鉴定的基本技能；通过实验，使学生学会无菌操作方法，掌握微生物的分离、筛选和育种的基本知识和技能，了解菌种保藏的一般方法。 五、讲授实验的基本理论与实验技术知识 实验一细菌培养基的配制与灭菌 1.实验内容与要求： （1）了解加热灭菌的基本原理，掌握实验室常用的几种加热灭菌技术 （2）了解配制培养基的基本材料，学习配制肉汤培养基的方法并掌握其要点。 2.实验材料： （1）培养基组成牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH值7.2，固体时加琼脂2%。（2）试剂 6mol/lHCl、10%NaOH。 （3）其它工具：台秤、量筒、试管、三角瓶、烧杯、分装架等。 实验二细菌的接种与培养 1.实验内容与要求： （1）掌握无菌操作的概念和基本操作技术； （2）了解细菌常用的培养基以及培养条件； （3）了解平板划线分离菌种的原理和操作要点。 2.实验材料： （1）菌种：大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，八叠球菌(Sarcina sp.)。 （2）培养基：肉汤固体斜面（2个/菌），肉汤液体试管（2管/菌），平板划线接种肉汤固体培养基（10-15ml/皿，2块/菌），平板点接肉汤固体培养基（10-15ml/皿，3支菌用1块），穿刺用肉汤半固体培养基（2管/菌）。 （3）其它工具：接种针，接种环，酒精灯或煤气灯，消毒酒精棉球，镊子，试管架，标签纸，培养箱（37℃）
《微生物检测技术》教学大纲 一、基本信息 二、教学目标及任务 教学目标：通过36个学时的教学，努力使学生了解微生物检验检测中的基本技术体系，了解微生物检测技术在研究工作中的用途和新技术的发展动态，使学生在微生物检验检测方面能够提高认识，并对技术体系有一定的了解，以适应就业后在动植物检验检疫、食品品质检测等方面的微生物检验检测业务的需要，也能适应学生今后在进一步的研究和开发过程中所需要用到的研究性检测业务。 三、学时分配 四、教学内容及教学要求 绪论我国粮食生产、我国农业的发展趋势及其和微生物的关系。 重点介绍我国粮食生产的趋势和供需关系，使学生理解微生物检验检测的重要性 无难点 了解微生物检验技术的重要性
第一章微生物在自然界的分布、作用和特征 第一节微生物在自然界的分布 第二节微生物在自然界的作用 第三节微生物在自然界的特征 本章重点介绍微生物的多样性、微生物分布的普遍性和检测特定的微生物的难点 无难点 了解技术对微生物检验的重要性 第二章微生物检验技术和社会 第一节微生物检验技术和植物检疫 第二节微生物检验技术和食品安全 第三节微生物检验技术和研究 本章重点介绍微生物检验检测技术在植物检疫、食品安全、资源开发以及研究活动中的作用和意义 无难点 理解微生物检验技术对国民经济和国民生活安全的重要性，了解微生物检验技术作用范围 第三章微生物检测技术概述 第一节可培养微生物的检测 第二节VBNC的检测技术 第三节其它的微生物检测技术 针对本课程以各项技术为中心展开，缺乏系统性的特点，本章首先给各种微生物检测技术进行概述，尽量给学生提供一个整体观和一些关键技术的信息。 难点在于理解VBNC的检测 理解各种常用的微生物检验技术和方法 第四章样品的采集和处理 第一节气体的采样和处理 第二节液体的采样和处理 第三节固体的采样和处理 从实际出发，本课程设置了采样技术，对用于微生物检验检测的样品的采集进行细致的介绍。 难点在于理解各种采样设备和工具（缺乏实物） 使学生注意到采样行为对微生物的检测结果带来的误差，并培养学生在自己今后的工作中尽量减少采样造成的误差的意识。 第五章微生物检测技术 第一节可培养微生物的检测 以国标为蓝本，介绍可培养微生物的检测方法 学生实验中有一定的基础，应无难点 使学生了解微生物检测的国家标准在实际工作中的应用，使学生学会如何利用国标。 第二节VBNC的检测技术 以最新的研究或最经典的研究例子为蓝本，介绍VBNC检测的各种方法 难点在于理解检测的理论原理和实际操作之间的差距 使学生了解VBNC的检测的方法及其特征，在必要的时候能选择使用。 第六章微生物分离和培养技术 第一节微生物的分离 介绍可培养以及难培养的微生物的分离方法，着重介绍菌根菌的分离 难点在于对于微生物的分离效果的理解 希望学生能掌握基本的微生物分离方法 第二节可培养微生物的培养 1 病原物的培养 2 非病原物的培养 介绍可培养微生物的培养方法，着重介绍病原菌培养时的注意事项 难点在于对于如何传达培养病原微生物时的临场感
第一章绪论 一、微生物遗传育种 对野生型菌株或低产菌株进行遗传操作和分离筛选，从大量突变体中筛选出性状优良的菌株，并对其发酵条件加以优化，得到适合发酵工业生产的优良菌种（产量、质量、新产物）。 二、微生物遗传育种的具体目标: 1、提高产量生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵首位的目标 2、提高产物的纯度，减少副如色素；提高有效产物组分 3、改变菌种形状，改善发酵过程，如改变和扩大菌种的原料结构；改善菌种生长速率；提高斜面孢子化程度；降低需氧量和能耗；耐不良环境；耐目的产物；改变细胞透性，提高产物分泌 4、遗传性状特别是生产性状稳定 5、改变生物合成途径，获得新产物 三、优良发酵菌株应具备哪些特性 1、遗传稳定 2、易于培养：营养谱广、培养条件易达到 3、易于保存（如孢子丰富或产生休眠体） 4、种子生长旺盛 5、发酵周期短，产量高，产物单一 6、产物易于分离纯化 第二章微生物遗传学基础 一、名词解释： 基因：遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。 转化：受体细胞直接吸收了来自供外源DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。 转导：外源遗传物质通过噬菌体的携带进入受体细胞，并与受体染色体发生基因重
组 接合：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得新的遗传性状的现象。 菌种衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 二、突变型的种类：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。 三、试质粒的性质及其在基因工程中的应用 性质：自我复制、拷贝数高、不相容性、转移性。 第四章工业微生物诱变育种 一、物理诱变剂基本作用过程 物理过程：能量吸收和传递物理化学作用：分子激发 化学过程：DNA断裂、碱基异构、碱基化学共价交联、碱基脱氨基等 生物学过程：经过DNA修复、复制、细胞分裂、代谢，产生死亡、基因突变、染色体畸变、染色体倍性变化等，使细胞死亡或形成各种突变体 二、紫外线的诱变机制 1、造成NDA断裂、与蛋白质交联、形成胸腺嘧啶二聚体 2、形成胸腺嘧啶二聚体是UV 引起突变的主要原因。形成于单链相邻TT间、或双链间 3、单链上出现TT二聚体，复制可能在此停止，或超越这一点继续复制，使子代DNA形成缺口，碱基错误插入该缺口，造成突变 4、双链间出现TT二聚体造成复制无法进行 三、DNA中TT二聚体的修复方法 1、光复活：90％，可见光，在黑暗下TT与一种光激活酶结合成较稳定的复合物，但在可见光下这种酶吸收光能而解离，二聚体重新分解！！！紫外诱变时照射和分离均应在黑暗或红光下进行 1、切补修复：4种酶参与，识别、内切、外切、延伸、连接。紫外诱变照射后在冰
《食品微生物学实验》课程教学大纲 课程名称：食品微生物学实验 课程编号： 课程组长： 总学分值：1分 总学时数：16学时 适用专业：酿酒工程 一、实验教学课程性质和目的：食品微生物检验技术实验课是与微生物学理论课同学期开设的一门重要的技术基础课。通过本课程的教学，使学生较熟练的掌握微生物学实验的基本操作技术和初步掌握研究微生物的基本方法。通过对具体微生物材料的观察、分析，进一步加深和巩固对食品微生物检验技术理论课所学知识的理解并提高学生分析和解决实际问题的能力。 二、实验教学目的和要求： 1.能够正确制备显微试片，并能独立操作显微镜进行微生物的显微分析； 2.能够通过固体培养的菌落特征，区分真核细胞型微生物和原核细胞型微生物的特点； 3.能在独立进行各种实验材料的准备、实验器皿、培养基的灭菌； 4.能够正确选择符合要求的目的菌株，并进行纯培养和简单的种类鉴定。 5.熟悉从自然界中分离筛选微生物、鉴定微生物的基本方法。 三、实验配套的主要仪器设备及台（套）数
四、实验项目内容和要求
1．考核的内容 ①实验的基本操作； ②实验报告，注重考察学生实验的主动性、分析问题和解决问题的能力； ③实验纪律与实验卫生； ④实验出勤。 2．对实验报告评阅，主要是看学生是否能按实验的要求独立完成实验，报告撰写是否能反映出学生的能力和素质。 3．考核评分，总分100分。 七、实验开出率 实验操作50%，实验报告50% 八、主要教材及参考书 教材：刘素纯，食品微生物学实验，化学工业出版社，2013.4 参考资料： [1] 沈萍，范秀荣，李广武主编．微生物学实验[M].北京:高等教育出版社，1996，6 [2] 周德庆主编．微生物学实验手册[M]．上海：上海科学技术出版社，1986 [3] 林稚兰，黄秀梨主编. 现代微生物学与实验技术[M]．北京：科学出版社，2000 [4] 周阜棣，俞子牛，何绍江主编．农业微生物学实验技术[M]．北京：中国农业出版社，1996 [5] 徐孝华主编．普通微生物学[M]．北京：北京农业大学出版社，1992 [6] 武汉大学，复旦大学生物系微生物教研室编．微生物学（第2版）[M]．北京：高等教育出版社，1987 [7] 徐岩,等译.James M.Jay 编著. 现代食品微生物学[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2001.7 [8] 赵斌，何绍江主编，《微生物学实验》，科学出版社，2002。 执笔人：朱玲审核人： 2017年2月22日
微生物实验教案 实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察 一、实验目的 以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 1显微镜油镜使用的原理 （1）光学部分 : 接目镜、接物镜、照明装置 ( 聚光镜、虹彩光圈、反光镜等 ) 。它使检视物放大 , 造成物象。（ 2）机械部分 : 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转 移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。 2 显微镜的放大倍数和分辨 率（ 1）放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公 式表示为： D=λ /2n ·sin(α/2 ) 式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55 μ m） n:物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。 3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒 精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。 2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。 四、实验方法与步骤 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （ 2）调节光亮度。 （ 3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。 （ 4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （ 5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油， 使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （ 6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （ 7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
《临床微生物学及检验》课程实验教学大纲 课程名称：临床微生物学及检验 英文名称：Clinical Microbiology and Inspection 课程编号：22010000实验课性质：专业基础 课程负责人：姚苹、宋艳艳开放实验项目数：13 大纲主撰人：宋艳艳大纲审核人：王志玉 一、学时、学分 课程总学时：80 实验学时：40 课程总学分：4 实验学分：1.5 二、适用专业及年级 预防医学四年级 三、实验教学目的与基本要求 通过实验巩固相关理论知识，实践与理论相结合，达到融会贯通的目的，培养学生主动解决问题和创新意识。 要求每个同学掌握各种临床标本的处理和接种技巧、常见致病菌的分离与鉴定、常规药敏实验方法等；要求每个同学操作规范、基本操作熟练，并能自己设计完成一个完整检验。 四、主要仪器设备 生化培养箱、CO2培养箱、电冰箱、电冰柜、超净工作台、生物安全柜、显微镜、高压灭菌器、微波炉、多媒体幻灯机 五、实验课程内容和学时分配
六、考核方式 （1）试验报告：要求内容完整，书写认真，对试验结果进行合理讨论。 （2）考核方式：采用课堂提问、实验操作、实验报告、笔试。实验课成绩占课程总成绩的20％。 七、实验教科书、参考书 （一）教科书 1．张卓然主编.《临床微生物学和微生物检验》. 人民卫生出版社. 2003年 2．洪秀华主编.《临床微生物学微生物检验实验指导》.人民卫生出版社. 2003年（二）参考书： 1．李影林主编.《临床微生物学及检验》. 人民卫生出版社. 1995年 2．黄贞祥主编.《病毒学基本原理与技术》.人民卫生出版社.1990年 3．巫向前主编.《临床检验结果的评价》.人民卫生出版社.1999年 4．王庸晋主编.《现代临床检验学》.人民军医出版社. 2001年
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
《微生物生理学》教学大纲 一、基本信息 二、教学目标及任务 通过该课程的学习，要求学生能够掌握微生物的基本结构和功能，重点掌握微生物的各种代谢活动规律和代谢调节，掌握微生物的生长、繁殖以及分化的规律，了解微生物生理学的研究方法及目前微生物生理学研究的最新进展。通过本课程的学习使学生认识、了解微生物生命活动特点、基本规律及其本质，初步掌握研究微生物生理活动的一些基本技术与方法，提高分析问题与解决问题的能力。 三、学时分配 四、教学内容及教学要求 绪论 第一节微生物生理学研究的对象 第二节微生物生理学与其他学科的关系 第三节微生物生理学的发展 第三节微生物生理学中常用技术与方法 习题要点：微生物生理学研究的对象，作出重要贡献的人物，微生物生理学常用方法。 本章重点、难点：微生物生理学研究常用方法。 本章教学要求： 了解微生物生理学研究的对象，作出重要贡献的人物，微生物生理学常用方法。 第一章微生物细胞的结构 第一节细胞壁 第二节原生质膜 第三节基因组
第四节微生物细胞表面附属物 第五节核糖体 第六节细胞内膜系统 第七节特殊内含体与贮存物质颗粒 习题要点：各类微生物的细胞壁，细胞膜，基因组的不同，以及鞭毛等表面附属物的组成，及作用机制。本章重点、难点：各类微生物的细胞壁，细胞膜，基因组及鞭毛的组成和功能。 本章教学要求： 了解各类微生物的细胞壁，细胞膜，基因组，以及鞭毛等表面附属物的组成 理解这些细胞结构的特性和功能，并根据这些特性， 掌握一些限制或利用微生物的简单方法。 第二章微生物营养 第一节营养物质及微生物的营养类型 第二节营养物质吸收与运输 1．简单扩散 2．协同扩散 3．主动运输 4．基团转运 习题要点：四种运输方式的代表（注意原核与真核的异同） 第三节大分子营养物质的运输 1．蛋白质定向转运 2．蛋白质的分泌 习题要点：蛋白质的转运及分泌方式。 本章重点、难点：营养物质的运输，蛋白质的转运及分泌。 本章教学要求： 了解微生物的多种运输方式，蛋白质的跨膜运输 理解微生物特有运输方式的特点和作用 掌握微生物中一些重要的运输途径。 第三章微生物的代谢 第一节新陈代谢的概念 1．微生物代谢的特点 2．微生物代谢的研究方法 习题要点：微生物代谢的特点及研究方法 第二节微生物的分解代谢 1．发酵 2．有氧呼吸 3．无氧呼吸 习题要点：微生物的特殊发酵途径，无氧呼吸及意义。 第三节微生物的能量代谢 1．基质水平磷酸化 2．电子传递水平磷酸化 3．光合磷酸化 习题要点：循环式光合磷酸化与非循环式光合磷酸化的异同 第四节微生物的合成代谢 1．二氧化碳的固定 2．脂类物质的生物合成 3．生物固氮 习题要点：共生固氮的调控，固氮酶的作用机制，防氧保护机制 本章重点、难点：各种发酵途径，无氧呼吸，循环式光合磷酸化，生物固氮。