乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测
YLNB 3.2
1、引用依据：GB/T4789.3-2003
2、术语和定义
大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。
3、仪器及器材
3.1 恒温培养箱：36±1℃；
3.2 冰箱：0-4℃；
3.3 恒温水浴锅：46±1℃；
3.4 天平；
3.5 显微镜；
3.6 均质器或乳钵；
3.7 灭菌平皿：直径90mm；
3.8 灭菌试管：18×180和20×200；
3.9 灭菌吸管：1 ml和10 ml；
3.10 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml；
3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm；
3.12 载玻片； 3.13 酒精灯； 3.14 试管架；
3.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 4、培养基和试剂
4.1 乳糖胆盐发酵管； 4.2 伊红美兰琼脂平板； 4.3 乳糖发酵管； 4.4 生理盐水； 4.5 革兰氏染色液。 5、检验程序 大肠菌群检验程序:
产气
大肠菌群阴性
革兰氏阳性
革兰氏阴性无芽孢杆菌
大肠菌群阳性
不产气
大肠菌群阴性
革兰氏染色
报告
乳糖发酵管 36±1℃，24±2h
伊红美兰琼脂平板
36±1℃，18~24h
大肠菌群阴性
不产气
产气
稀释
检样 乳糖胆盐发酵管 36±1℃，24±2h
6、方法
6.1 检样稀释
6.1.1 以无菌操作将检样25ml（或g）放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量
的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000～10000r/min 的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。
6.1.2 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。
6.1.3 另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
6.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
6.2 乳糖发酵实验：（通常所说的假定试验：其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌）
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
6.3 分离培养：（目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内，有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在）
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃培养箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并
做革兰氏染色和证实实验。
6.4 证实实验（复发酵实验）: (目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体)
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃培养箱内，培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阴性。
6.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数查MPN检索表,报告每100ml （g）大肠菌群的最可能数（见表1）。
7、注意事项
7.1 初发酵和证实试验
乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性，因此，必须作进一步证实试验。
7.2 产气量与倒管
试验表明，大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正相关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产气量多者可充满整个倒气管，少者可产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问，可用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。另外，产气量与倒气管有一定的关系，倒气管口
不完整，有利于气体的进入；管口周围有沉淀等物质能影响气体的进入。
7.3 挑选菌落
在平板呈现紫黑色，有或无金属光泽，检出率最高；粉红色、粉色检出率最低。另外，只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率，当菌落不典型时，应挑取2～3个菌落作证实试验，以免出现假阴性。
7.4 抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。
7.5指示剂
溴甲酚紫属于酸碱指示剂，其pH变色范围为：黄5.2～6.8紫，当料管中培养基（pH=7.4±0.1）的颜色由紫色变为黄色时，证明培养基中有酸性物质产生，此时培养基的PH ≤5.2，培养基呈酸性。
7.6 MPN检索表
MPN为最大可能数的简称，表示样品中活菌的密度，是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。MPN检索表只给出了三个稀释度，如果改用不同的稀释度，则表内数值应相应
降低或增加10倍。
7.6.1 用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡，有气泡时就不能使用，接种之后，要用同批未接种的发酵管置于温箱内，同时培养，作为空白。
7.6.2 检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存在时，应以产气为主，产酸仅作参考。因为培养基中所用的指示剂为溴甲酚紫，其有效PH为5.2-6.8，变色点为6.0，如果产酸未能达到使下降至6.0以下时，变色就不显著。7.6.3 检查发酵管中小导管内气泡时，即使只有微量气泡出现，亦应判定为阳性。有时小导管的管口被样品颗粒封住，气体未能进入导管，如加以振摇，管低有小气泡上升，亦应视为阳性。
7.6.4 大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰结合而成黑色物，故菌落呈紫黑色（大肠杆菌）或褐色（产气克雷伯氏菌等），前者有时还产生有金属光泽。
表 1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表
阳性管数MPN
100ml(g
) 阳性管数MPN
100ml(g
)
1 10-1 10-
2 1 10-1 10-2
0 0 0
1
＜30
30
2
2
1
90
140
0 0 0
2
3
60
90
2
2
2
3
200
260
0 0 0 0 1
1
1
1
1
2
3
30
60
90
120
2
2
2
2
1
1
1
1
1
2
3
150
200
270
340
0 0 0 0 2
2
2
2
1
2
3
60
90
120
160
2
2
2
2
2
2
2
2
1
2
3
210
280
350
420
0 0 0 0 3
3
3
3
1
2
3
90
130
160
190
2
2
2
2
3
3
3
3
1
2
3
290
360
440
530
1 1 1 1 0
1
2
3
40
70
110
150
3
3
3
3
1
2
3
230
390
640
950
1 1 1 1 1
1
1
1
1
2
3
70
110
150
190
3
3
3
3
1
1
1
1
1
2
3
430
750
1200
1600
1 1 1 1 2
2
2
2
1
2
3
110
150
200
240
3
3
3
3
2
2
2
2
1
2
3
930
1500
2100
2900
1 1 1 1 3
3
3
3
1
2
3
160
200
240
290
3
3
3
3
3
3
3
3
1
2
3
2400
4600
11000
≥24000
注：①本表采用3个稀释度【0.1g(mL)、0.01 g(mL)、0.001 g(mL)】、每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0. 1 g(mL)、0.01 g(mL)时，表内数字相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL) 时，表内数字相应增加10倍，其余类推。
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
大肠菌群(M.R.N.)的测定 一、实验目的： （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量 二、实验原理： 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most p robable number-简称MPN）表示。最近似数（most probable number-简称MPN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 三、材料 1、样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes） 3、培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、
革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 4、其它设备和材料 温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。 四、实验步骤 (一)检验程序 大肠菌群检验程序见图 (二)操作步骤 1．采样及稀释（具体材料） ①以无菌操作鲜橙多饮料（具体根据实验室提供的确定）25g(或25mL)放于含有225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000r／mjn—10000r／min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。
牛乳中微生物的检测与分析 张月月刘敏王荣峰王君孙鹏郭海萌张帅 （山东农业大学生命科学学院，泰安271000） 摘要：【目的】了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准。学习牛乳的巴斯德消毒法和细菌学检查的方法。【方法】采用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。【结果】微生物显微镜直接计数法随机性大，对茵体数量不能做出较为宏观，全面的反应．优点是计数快速；美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。它不能做为定量检查；平板茵落计数法速度慢，需要平板上长出茵落一段时后才能计数。【结论】由于平板茵落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大．由于是茵悬液涂布，所以比较均匀，能较好的反应茵落的疏密程度。重复性，平行性很好。是经典的计数方法。 关键词：牛乳;微生物;检测;分析 Detection and analysis of microorganisms in milk Yueyue Zhang，Min Liu，Rongfeng Wang，Jun Wang，Peng Sun，Haimeng Guo，Shuai Zhang (College of Life Sciences, Shandong Agricutual University, Tai’an, 271000, China) Abstract:【Purpose】to understand the milk sterilization and bacteriological examination of importance, and its hygienic quality judgment standard. Learning milk Pasteur disinfection method and bacteriological examination method. 【MEFHOD】Uses the microscope count the methylene blue reductase method，the standard plating count method to carry on the determination of the number of bacteria，determined different origin the fresh COWS milk rank，pasteurized milk hygienic standard．【RESULTS】Microorgaism microscope direct countmethod 。It has big ran domness cannot make comparatively macroscopic ，overall comprehensive for milk quantity ．But the advantages are coninung and fast for counting of bacteria ；The methyrlene blue reductases method is used in determining the COW'S milk quality．It is simple．No special equipments needed．But it cannot use for the quantitative examination ；The plating colony count methods is relatively slow，needs the growth of bacteria on the plate and colonies can be counted．【CONCLUSION】Because the plating count method usually makes the gradient to dilution，therefore the counting linear scope is broad ．Because bacterium suspended solution is poured out on the culture of bacterium uniformly ．The bacterial colony density degree can obtain ．The retentiveness，parallelism is very good．It is the classical method of counting bacteria ． Key words: milk ；microbial ；detection；analysis； 前言 牛乳是一种营养全面的液态天然饮料,含有人体所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、各种矿物质和维生素[1] 。其中的细菌会很快繁殖，因此，采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查，比较得出最佳检测方法，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。现今常用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，切入点不同的方法各有优缺。随着人们生活水平的提高,对乳制品的需求亦不断上升。目前
(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善，以及抗生素的滥用，人类对病菌的抵抗能力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升的趋势。因此，对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性，常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染，这些方法需要一定的培养时间，少则2～3天，多至数周，才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面，以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 （二）、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下： 1、活细胞计数的改进方法 （1）、旋转平皿计数方法 （2）、疏水性栅格滤膜法（HGMF）或等格法（isogrid method） （3）、血膜系统（Pertrifilm） （4）、酶底物技术（ColiComplete） （5）、直接外荧光滤过技术（DEFT） （6）、“即用胶”系统（SimPlate） 2、用于估计微生物数量的新方法 （1）、阻抗法 （2）、A TP生物发光技术 3、其他方法 （1）、微量量热法 （2）、接触酶测定仪 （3）、放射测定法 （三）、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 （四）、大肠杆菌O157：H7快速检测方法 大肠杆菌O157：H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型，自1982年在美国被分离并命名以来，陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关，是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点，E.coli O157：H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用，可以从多方面对E.coli O157：H7进行检测。 1、E.coli O157：H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 （五）、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈普通串状排列无芽孢，无鞭毛，不能运动。该菌在自然界中分布广泛，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，是最常见的化脓性球菌之一，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的，目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件，近年来
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规 程 1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms ）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number ，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 恒温培养箱：36 C± 1 Eo 冰箱：2 E?5 Eo 恒温水浴箱：46 E± 1 Eo 天平：感量g o 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量500 mLo
无菌培养皿：直径90 mm
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST ）肉汤：见附录A 中。 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中。 无菌生理盐水：见附录 A 中。 无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl ：见附录 A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序 大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min ?10000 r/min 均质1 min ?2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min ?2 min ,制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的 样品匀液。 样品匀液的pH 值应在? 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 ,BGLB 肉汤：见附录A 中。 ,VRBA :见附录A 中。
第三章食品检验样品的采集和处理 一、样品的采集与处理 食品检验样品采集的原则： 1、所采样品应具有代表性 每批食品应随机抽取一定数量的样品，再生产过程中，再不同时间内各取少量样品予以混合。固体或半固体的食品应从表层、中层和底层、中间和四周等不同部位取样。 2、采样必须符合无菌操作的要求，防止一切外来污染 一件用具只能用于一个样品，防止交叉污染。 3、再保存和运送过程中应保证样品中微生物的状态不发生变化 采集的非冷冻食品一般在0—5度冷藏，不能冷藏的食品立即检验。一般在36h内进行检验。 4、采样标签应完整、清楚 每件样品的标签须标记清楚，尽可能提供详尽的资料。 在食品的检验中，所采集的样品必须具有代表性，即所取样品能够代表食物的所有部分。如果采集的样品没有代表性，即使一系列检验工作非常精密、准确，其结果也毫无价值，甚至会出现错误的结论。食品因加工的批号、原料情况（来源、种类、地区、季节等）加工方法、保藏条件、运输、销售中的各环节及销售人员的责任心和卫生认识水平等无不影响着食品的卫生质量，因此要根据一小份样品的检验结果去说明一大批食品的质量或一起食物中毒的性质，就必须周密考虑，设计出一种科学的取样和样品制备方法。而采用什么样的取样方案主要取决于检验的目的，目的不同，取样的方案也不同。检验的目的可以是判定一批食品合格与否，也可以是查找食物中毒病原微生物，还可以是鉴定畜禽产品是否有人畜共患的病原体。目前国内外使用的取样方案多种多样，如一批产品按百分比抽样，才若干个样后混合在一起检验；按食品的危害程度不同抽样等。不管采取何种方案，对抽样代表性的要求是一致的。最好对整批产品的单位包装进行编号，实行随机抽样。 （一）样品的种类 样品可分为大样、中样、小样三种。大样指一整批；中样是从样品各部分取的混合样，一般为200g；小样又称为检样，一般以25g为准，用于检验分析。 （二）样品的采集 采样必须在无菌操作下进行。 采样的工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子和开罐器等，必须是无
乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测 YLNB 3.2 1、引用依据：GB/T4789.3-2003 2、术语和定义 大肠菌群：指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。 3、仪器及器材 3.1 恒温培养箱：36±1℃； 3.2 冰箱：0-4℃； 3.3 恒温水浴锅：46±1℃； 3.4 天平； 3.5 显微镜； 3.6 均质器或乳钵； 3.7 灭菌平皿：直径90mm； 3.8 灭菌试管：18×180和20×200； 3.9 灭菌吸管：1 ml和10 ml； 3.10 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为500ml； 3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm；
3.12 载玻片； 3.13 酒精灯； 3.14 试管架； 3.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 4、培养基和试剂 4.1 乳糖胆盐发酵管； 4.2 伊红美兰琼脂平板； 4.3 乳糖发酵管； 4.4 生理盐水； 4.5 革兰氏染色液。 5、检验程序 大肠菌群检验程序: 产气 大肠菌群阴性 革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢杆菌 大肠菌群阳性 不产气 大肠菌群阴性 革兰氏染色 报告 乳糖发酵管 36±1℃，24±2h 伊红美兰琼脂平板 36±1℃，18~24h 大肠菌群阴性 不产气 产气 稀释 检样 乳糖胆盐发酵管 36±1℃，24±2h
6、方法 6.1 检样稀释 6.1.1 以无菌操作将检样25ml（或g）放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量
SN0169-92代替ZBX09002一88 Methodforexaminationofcoliform，fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2、设备和材料 2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。 2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。 2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿：直径90mm。 2.8 天平：感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11玻璃珠：直径约5mm。 2.12菌落计数器。 3、培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3EC肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。 3.7MR-VP培养基。 3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11生理盐水。 3.12革兰氏染色液。 3.13Kovacs氏靛基质试剂。 3.14甲基红指示剂。 3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。 4、样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。 4.2 不同食品样品匀液的制备 4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。 4.2.2 固体和半固体食品 以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。 5、大肠菌群的测定 5.1 大肠菌群MPN值的测定 5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种1mL。 5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
微生物检测手段及注意事项
微生物检测手段及注意事项 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而
测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 食品商务网 2005-12-14 12:00:00.0 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2 水浴箱：44.5±0.5℃。 2.3 培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿：直径90mm。 2.8 天平：感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3 培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。 3.6 色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不
乳与乳制品微生物检验方法双歧杆菌的检验 YLNB 3.7 1、引用依据：GB/T4789.34-2003 2、术语和定义 双歧杆菌：一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽孢，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。 3、仪器及器材 3.1培养箱：36±1℃； 3.2 恒温水浴：46±1℃； 3.3显微镜； 3.4厌氧培养箱； 3.5离心机； 3.6 天平； 3.7电炉； 3.8吸管； 3.9 广口瓶或三角瓶：容量为500ml； 3.10 平皿：直径约90mm； 3.11 试管； 3.12 酒精灯； 3.13 灭菌刀或剪子； 3.14 灭菌镊子。
4、培养基和试剂 4.1 生理盐水； 4.2 75%乙醇溶液； 4.3 TPY 琼脂培养基； 4.4 BL 琼脂培养基； 4.5 BBL 琼脂培养基； 4.6双歧杆菌生化用基础培养基 ； 4.7 PYG 液体培养基； 4.8革兰氏染色液； 4.9灭菌液体石蜡。 5. 检验程序 36±1℃ 72h ±3h 37℃ 72 h 测定乙酸、乳酸 生化培养观察10天 接受PYG 厌氧培养 分纯 厌氧培养 选择2—3个适当稀释度，各取0.1mL 分别涂布于BL,BBL,TPY 培养基 25g （mL ）检样加225mL 灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的稀释液 菌中鉴定报 菌落计数报告 革兰氏染色，过氧化氢酶试验
6、方法 6.1以无菌操作将充分混匀的检样25g（ml）放入含有225ml 灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内做成1：10的均匀稀释液。6.2 用1 ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml，沿管壁徐徐注入含有9 ml灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，作成1：100的稀释液。 6.3 另取1 ml灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 6.4选取2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取0.1ml分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种～3种培养基（BL、BBL、TPY培养基），同时作灭菌生理盐水空白对照。 6.5待琼脂表面干后，翻转平皿，放置厌氧罐内，操作全过程须在20min内完成。 6.6将厌氧罐置36℃±1℃温箱内培养培养72h±3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选择菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色，显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性，无芽孢，着色不均匀，出现“Y”或“V”型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。
实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定
食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便，易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该菌量为109个／g —1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处： ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主
食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响，在部分研究中，将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首 要内容。在食品微生物的检验过程中，我们主要对人体有害微生物进行检验，其中在食品安全检验过程中，因为食品中有多种微生物共存现象，所以在检验前，微生物检验员要把不同的菌体进行分离，这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况，包括生产型食品微生物，如醋酸杆菌，酵母菌等和使食物变质的微生物，如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌，肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安 全的重要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害，像我们在生活中经常吃到的大米，有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售，虽然经加工后，在外表上和普通大米没啥两样，但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌，据可靠信息表明，黄曲霉的危害性十分巨大，如果人们长时间吃这样的大米，出
现癌症的风险要比常人高出很多倍，由此可见，食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检 测技术，所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌，而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。 食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中，由于食品中涉及的微生物种类较多，因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中，食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染，随着微生物种类的增多，检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量，难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视，在各个微生物的测量上，相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高，人们对食品需求不断增加，而食品安全问题却在日益严重，为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时，进一步促进食品安全的保障措施落实，必须加强食品安
第三节乳制品中的微生物及其检验 乳除供鲜食外，还可制成多种制品，乳制品不但具有较长的保存期和便于运输等优点，而且也丰富了人们的生活。觉见的乳制品有奶粉，炼乳、酸乳及奶油等。 一、奶粉中的微生物及其检验 奶粉是以鲜乳为原料，经茫毒，浓缩，喷雾干燥而制成的粉状产品。 可分为全脂奶粉、脱脂奶粉、加糖奶粉、调制萨砷等：在奶粉制作过程中，绝大部分微生物被清除或杀死，再者，奶粉含水量低(一般在于，以下，喷雾干燥奶粉水分在2％～3％左右)，不利于微生物存活，故经密封包装后，细菌不会繁殖。因此，奶粉中含菌量不高，也不会有病原菌存在。 如果原料乳污染严重，加工不规范，奶粉中含菌量会很高，甚至有病原菌出现。 1．奶粉中的微生物夹原又类型 奶粉中的细菌主要来源于以下几方面； 1）奶粉在浓缩干燥过程中，外界温度高达150－200~C，但奶粉颗粒内部温度只有60℃左右，其中会残留一部分耐热菌； 2）喷粉踏用后清扫不彻底，塔内残留的奶粉吸潮后会有细菌生长繁殖，成为污染源； 3）奶粉在包装过程中接触的容器、包装材料等可造成第二次污染； 4）原料乳污染严重是奶粉中含菌量高的主要原因。 奶粉中污染的细菌主要有耐热的芽胞杆菌、微球菌、链球菌、棒状杆菌等。 奶粉中可能有病原菌存在，最常见的是沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。 2．奶粉中的微生物检验 （1）样品的采取 产品按批号取样检验，取样量为1／1000(不足千件者抽1件)，尾数超过500件者增抽一件，每个样品为200g。， (2)奶粉按需要进行细菌总数、大肠菌群MPN测定及致病菌的检验：
二、酸乳制品中的微生物及其检验 酸乳制品是鲜乳制品经过乳酸菌类发酵而制成的产品，如普通酸乳、嗜酸菌乳、保加利亚酸乳，强化酸乳、加热酸乳、果味酸牛奶、酸乳酒、马乳酒等都是营养丰富的饮料，其中含有大量的乳酸菌、活性乳酸及其它营养成分。 酸乳饮料能刺激胃肠分泌活动，增强胃肠蠕动，调整胃肠道酸碱平衡，抑制肠道内腐败菌群的生长繁殖，维持胃肠道正常微生物区系的稳定，预防和治疗胃肠疾病，减少和防止组织中毒，是上好的保健饮料。 1．普通酸乳制品的微生物及其作用 1）普通酸乳一般用保加利亚乳酸杆菌和嗜热脂肪链球菌作为发酵剂。这两种乳酸菌在乳中生长时保持共生关系。 保加利亚乳酸杆菌在发酵过程中对蛋白质有一定的降解作用，产生的缬氨酸、甘氨酸和组氨酸等刺激嗜热脂肪链球菌的生长；而嗜热脂肪链球菌在生长过程中产生的甲酸，可被保加利亚乳酸杆菌所利用；这两株菌同时存在时，生长速度明显加快，乳的凝固时间也比使用单一菌株大大缩短，在40—45℃两株菌混合使用时，乳凝固时间为2～3小时，而使用单一菌株时则需数小时或更长时间。 2）普通酸乳中含有大约1％的乳酸，不适于病原菌的生存。 如沙门氏菌和大肠菌类均被抑制。 3）乳酸菌还能产生抗菌物质，起到净化酸乳的作用。 但如果鲜乳在加热前受到葡萄球菌污染，且乳在20℃常温下贮存，葡萄球菌可在乳中生长繁殖并产生毒素，在制作酸奶加热消毒过程中，葡萄球菌被杀死．而毒素则留在乳中，并于乳发酸成熟过程中稳定存在，从而引起食物中毒。 2．嗜酸菌乳 是利用嗜酸乳杆菌发酵乳而制成的乳制品。 嗜酸乳杆菌可在人和动物的胃肠道内定居，并能产生嗜酸菌素等多种抗菌物质，抑制有害菌类。维持肠道内微生物区系的平衡。人们常用嗜酸菌乳来治疗消化道疾患。但这种酸乳有酸涩味，为了改变适口性，近年来有人研制了甜嗜酸菌乳，其效果和适口性都很好。 3．酸乳酒
微生物快速检测方法及应用进展 随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。 1 即用型纸片法 3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品［4］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［5］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测食品中大肠菌群、大肠杆菌的有关酶的活性，将荧光产物在365 nm紫外光下观察即可。同时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。 2 生物化学技术 2.1 PCR技术PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。 2.2 基因探针技术基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳 定的或链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基 因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的 基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验［7］， 基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。 3 选择、鉴定用培养基法