郑州大学
硕士学位论文
激素诱导人骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的实验研究
姓名：曹亚伟
申请学位级别：硕士
专业：骨外科
指导教师：吴学建
20060515
郑州大学２００６届硕士毕业论文（正文）激素诱导人骨髓问充质干细胞成骨及成脂分化的实验研究
剧烈震动１５秒，再于１５℃至３０℃温度下孵育２至３分钟。在２℃至８℃温度下，以１２０００“ｍｉｎ将标本离心１５ｍｉｎ。离心后，混合物分离成为下方的红色酚一氯仿相，交界相和上方无色的水相。ＲＮＡ全部留在水相。
４．１．５将上清液转移到一个新管中，以０．５ｍｌ异丙醇／１ｍｌ用于起始均浆的ＴＲＩｚＯＬ的比例加入异丙醇混合，使水相中的ＲＮＡ沉淀。在１５℃至３０℃温度下孵育１０ｍｉｎ，在２℃至８℃温度下以不大于１２０００ｒ／ｍｉｎ将标本离心１０ｍｉｎ。
４．１．６去掉上清。以至少１ｍ１７５％乙醇／ｌｍｌ用于起始匀浆的ＴＲＩｚＯＬ的比例加入７５％的乙醇将ＲＮＡ小球洗一遍。用涡旋器将标本混匀，再于２℃至８℃下以不大于７５００ｒ／ｍｉｎ将标本离心５分钟。
４．１．７最后，将ＲＮＡ小球简单干燥（空气干燥或真空干燥５—１０ｍｉｎ）。将沉淀溶解于５０ＩＩｌＤＥＰＣ水中，保存于一８０℃。备用。
４．２总ＲＮＡ的鉴定
４．２．１纯度鉴定：测０Ｄ２３０、ＯＤ２６０、ＯＤ２７０及ＯＤ２８０，计算ｏＤ２倒０Ｄ２８０、ｏＤ２６０／ｏＤ２７０和ｏＤ２６０／ｏＤ２３０比值，标准为：ｏＤ２６０／ｏＤ２８０应当大于１．８，ｏＤ２６０／０Ｄ２７０应当大于１．２，０Ｄ２６０／０Ｄ２３０应当大于２．Ｏ。ＲＮＡ浓度计算：ＲＮＡ（肛ｇ似１）＝ｏＤ２６０×４０×稀释倍数／１０００。
４．２．２完整性鉴定：本实验采用１．２％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测ｍ噙的完整性。
４．２．２．１配制ｌＯ×和１×甲醛变性琼脂糖凝胶缓冲液：先用２００岫Ｍ的ＭｏＰｓ【３Ｎ．（吗琳代）丙磺酸】，５０ｍＭ的乙酸钠和ｌＯｍＭ的ＥＤｌＡ配成１０×甲醛变性琼脂耱凝胶缓冲液，并用Ｎａ０Ｈ调ｐＨ至７．０。再将１００ｍ１的ｌＯ×甲醛变性琼脂糖凝胶缓冲液、２０ｍｌ的３７％甲醛和８８０ｍ１无ＲＮＡ酶的水混合，制成１×甲醛变性琼脂糖凝胶缓冲液。４．２．２．２１准确称量１．２克琼脂糖加入锥形瓶中，加入ｌＯｍｕＯ×甲醛变性琼脂糖凝胶缓冲液，再加入无ＲＮＡ酶的水至１００恤１。混匀。在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。’
４．２．２．３水浴使溶液冷却至６５℃，加入１．８ｍ１３７％的甲醛和耻ｌ／ｍｇ的髓，充分混匀。
４．２．２．４取ＲＮＡ样品即ｌ与弘ｌ的加样缓冲液混合，６５℃温育５分钟，置于冰上冷却后，用一次性微量移液器慢慢将混合物加至样品槽中。同时，将５ｕ１的ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ加入胶的中间孑Ｌ内。此时凝胶已浸没在缓冲液中。开始电泳。
郑州大学２００６届硕士毕业论文（正文）激素诱导人骨髓间充质干细胞成骨及成脂分化的实验研究
４．２．２．５将电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中观察，如果得到的ＲＮＡ呈现为锐利的条带，而且２８Ｓ带的密度大约是１８Ｓ带的２倍，则表明提取的ＲＮＡ比较完整。如果ＲＮＡ带不锐利，则表明ＲＮＡ样品在制备的过程中有降解。
４．３逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）
４．３．１引物设计：均有北京奥科公司设计并提供，序列分别为：
０ｓｌｅｏｃａｌｃｉｎ：
上游引物：５℃ＡＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡ３’
下游引物：５ｆＡＧＡＧｃＧＡｏ～ＣＣｃｒＡＧＡＣ３，
ＰＰＡＲＶ：
上游引物：５’ＴＣＴＣＴＣＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＣＣ３ｔ
下游引物：５。ＧＣＡｒⅨｒＧＡＧＡＣ』蛔ｒＣＣｃＣＡＣ３?
Ｂ－ａｃｔｉｎ：
．
上游引物：５ｆＡＧＣＣＡＴ叽ＡＣＧＴＴＧ（姒３ｆ
下游引物：５ＩＡＧＴＣＣＧＣＣＩ’ＡＧＪＡＡＧＣＡ３ｔ
Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ产物为３１０ｂｐ的核苷酸，ＰＰ觚Ⅵ产物为４７３ｂｐ的核苷酸，８．ａｃｔｉｎ产物为８００ｂｐ的核苷酸。
４．３．２应用一步法进行Ｒｔ．ＰＣＲ反应。
１．按下列组成配制Ｒｔ．ＰＣＲ反应液
１０×ｏｎｅｓｔ印ＲＮＡＰＣＲＢｕ雎。５“ｌ
Ｍｇａ２（２５ｍＭ）１似ｌｄＮＴＰＭｊｃｔｕ坤（各１０ｍＭ）瓤ｌ
ＲＮａｓｅｌｎｈｉｂｎｏｒ（４０Ｕ恤ＤｈｌＡＭｖＲＴａｓｅｘＷ聊１）¨１ＡＭＶ＊０ｐｔｉｍｉｚｅｄｎｑ（５聊１）１“ｌ
上游特异性引物（２毗Ｍ）１“ｌ
下游特异性引物（２蛳Ｍ）１“ｌ
实验样品（≤ｍｇ）１“１型！坚！！箜些Ｑ！趔—兰坐———————————一一一ｉ竺！！！熙望‘‘。。。。‘＿＿＿＿＿‘＿＿＿＿＿＿＿＿＿－＿－＿－－＿＿＿－－－－??＿－＿＿＿＿＿＿＿＿－?＿＿＿＿＿＿－＿＿＿＿＿－－－＿＿－＿－＿＿?＿＿＿．－＿＿＿＿＿＿＿＿－＿ｌ＿－－－－．－——一——Ｌ＝一一ｒ
按以下条件进行Ｒｔ．ＰＣＲ反应
５０。Ｃ３０ｍｉｎＲＴ反应；９０。Ｃ２ｍｉｎＲＴａｓｅ失活；９４。Ｃ３０ｓｅｃ，５２。ｃ３０ｓｅｃ，７２０ｃ１０ｍｉｎ，ＰＣＲ反应３０个循环。
４．３．３ＰＣＲ产物浓度的半定量测定
６
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将Ｒｔ—ＰｃＲ产物经ｌＯｇ几琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后，凝胶成像分析系统对特异性ＰｃＲ扩增带进行图像扫描测出扩增带曲线下面积的吸光光度Ａ值。紫光灯下观察并用凝胶成像扫描分析系统保存。分别用ＰＰＡ研及０ｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ和Ｂ—ａｃｔｉｎ的吸光度比值表示ＰＰＡＲ丫ｍＲＮＡ和ＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｍＲＮＡ的相对含量。
４．３．４统计学处理：
实验数据经ＳＰＳＳｌ０．Ｏ分析软件包进行统计学分析，结果以均数±标准差（ｉ±ｓ）表示。采用成组设计ｔ检验，取ａ＝Ｏ．０５为显著性检验水准。
结果
１．细胞形态学观察
骨髓细胞经密度梯度离心法后，接种于培养瓶中，随机在倒置显微镜下观察，见到培养液中存在大量的大小不等的圆形细胞，其中造血细胞为主要成分（图１）。随着培养时间的延长，以及更换培养液，造血细胞死亡或被弃去。其余细胞在２４小时后开始贴壁生长，３天后，细胞发生明显变化，贴壁细胞逐渐变为梭形并且体积增大，其形态具有典型的成纤维细胞特点，而且开始增值（如图２）。细胞长至第７天左右，大部分细胞贴壁延伸，体积变大，数目增多，多呈三角形或梭形，细胞开始呈集落生长（如图３）。原代细胞培养第１４天，细胞数目增多，集落生长。部分细胞叠加成漩涡状结构（如图４）。经传代后第８天，细胞成三角形或梭形，形态同原代细胞。细胞数目增多，部分细胞叠加（如图５）。培养液中加入地塞米松后，培养细胞至第５天，细胞形态和原细胞形态相似（如图６）。
２．细胞中提取总ＲＮＡ样品的鉴定
２．１纯度测定：不同波长０Ｄ值之比平均值和分布范围如下表
０Ｄ值之比ｉ±ｓ
ＯＤ２６０／０Ｄ２８０１．８９±０．０７
达到ＲＮＡ规定值，说明ＲＮＡ质量符合要求。
２．２完整性测定：经ＲＮＡ甲醛变性琼脂糖电泳，可见１８ｓ和２８ｓ两条带，２８Ｓ／１８ｓ为２．１１±０．１０，说明ＲＮＡ完整。见图７。
３．ＲＴ－ＰｃＲ结果
应用地塞米松或不用地塞米松处理传第２代细胞６天后，以Ｂ＿ａｃｔｉｎ为对照，ＰＣＲ扩增产物经电泳分离后在紫光灯下观察，可见在３１０和８００ｂｐ以及４７３和８００ｂｐ左右均出现一条带（图８），通过凝胶成像扫描系统做半定量分析，以ＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎｍＲＮＡ