万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
０引言
骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。
１材料和方法
设计：开放性实验。
单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。
材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。
设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：
骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适
５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。
骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。
骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。
统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。
２结果
２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。
图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０）
２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。
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人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
作者：赵凌云， 钱淑琴， 赵廷宝， Zhao LY， Qian SQ， Zhao TB
作者单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科,山东省济南市,250031
刊名：
中国组织工程研究与临床康复
英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
年，卷(期)：2007，11(28)
被引用次数：1次
参考文献(18条)
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相似文献(10条)
1.学位论文袁军正常及再障模型小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定2007
目的：骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干细胞之外的另一类干细胞。它具有极高的横向分化和复制能力，在不同诱导条件下具有多向分化潜能。目前常用于培养骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓培养法和密度梯度分离法。前者简单易行，将骨髓全部接种，利用干细胞贴壁时间短，通过换液达到分离、纯化的目的；后者是将淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞接种。目前尚无一种标志物能作为MSCs的身份特征，国际上通常采用多种CD分子的组合综合界定。MSCs是正常造血功能赖以存在和发挥功能的必要支持，因而在再生医学领域中有着广泛的应用前景。本实验以小鼠骨髓为MSC来源，旨在摸索有效、可行的骨髓间充质干细胞的分离、培养方法，对所培养的BMMSC进行鉴定，并检测这种培养法的产率。
临床上恶性血液病患者经反复放、化疗，常出现骨髓造血恢复延迟，有较长时间的低细胞期。研究表明：骨髓恢复延迟可能与骨髓基质损伤有关。BMMSC是骨髓基质的组成之一，故我们利用小鼠研究BMMSC损伤时的分离、培养，并观察此时小鼠BMMSC的状况，为临床治疗方面提供新的思路。
方法：
1、动物：选用清洁级4～6周龄BALB/c(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为骨髓细胞来源。清洁级4～6周龄DBA/2(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为免疫细胞来源，饲养于无菌层流柜中。
2、MSC的分离和培养
全骨髓培养贴壁筛选法：将BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，超净台内无菌分离小鼠股骨及胫骨，以CCM(完全培养基，为F12-DMEM培养液，含青霉素
100μg/ml、链霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)冲洗骨髓腔，轻柔吹打冲洗液，制成单细胞悬液，直接接种于25cm<'2>一次性无菌塑料培养瓶中，为P0(Passage 0)代。每瓶培养基体积补足至5ml。细胞终浓度约为1×10<'8>/L，37℃，5％CO<,2>饱和湿度培养。所用小鼠只数与接种瓶数比例为1∶1。
密度梯度离心法：以同上方法获得骨髓细胞，离心，用CCM重悬沉淀，缓慢加于Ficoll分离液(p=1.077g/ml)上，常温离心(1500rpm，15min)，吸取界面层细胞，无菌PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，以CCM调整细胞浓度至7～8×10<'6>L培养为PO’代。培养及传代条件同前。
全骨髓培养贴壁筛选法72小时首次全量换液；密度梯度离心法72小时首次半量换液。此后根据细胞生长状态、培养基颜色等客观条件，约每2～3天适时换液。细胞逐渐贴壁、融合。当细胞生长达到80～90％融合时，0.25％胰蛋白酶消化、传代。第一代为P1，第二代为P2，以此类推。
每种方法组种植5瓶细胞，分别选取两组生长好的不同代细胞，MTT法测定细胞活力，绘制生长曲线。
3、MSC的鉴定
3．1倒置显微镜下直接观察活体细胞形态，适时留取照片；
3．2选取不同代数的MSC制作细胞爬片，瑞氏-吉姆萨染色，显微镜下观察细胞形态及不同传代数对其影响； 3．3选取抗鼠CD34、CD414、CD45三种单抗，用流式细胞仪进行MSCs细胞免疫表型测定；
3．4诱导分化
3．4．1成骨分化诱导体系：地塞米松(10<'-7>mol/L)、β-甘油磷酸钠(10mmol/L)、维生素C(50mg/L)，以CCM为溶剂，诱导培养。倒置显微镜下观察，待细胞形态发生改变，可见钙化结节时，ALP染色，证实分化效果。
3．4．2成脂分化诱导体系：地塞米松1μmol/L、胰岛素10mg/L，以CCM为溶剂，诱导培养。倒置显微镜下观察，待细胞形态发生改变，出现脂肪空泡时，油红O染色，证实分化效果。
4、免疫介导再障模型小鼠的构建，分三组进行：
单纯照射组：BALB/c小鼠，lO只，雌雄各半，<'60>Co γ射线8Gy照射。
脾细胞组：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射线8Gy照射后4h内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠脾脏的单细胞悬液0.2ml(细胞数为
1×10<'6>)。
假照射组(对照组)：BALB/c小鼠，10只，雌雄各半，<'60>Coγ射线8Gy照射时以铅砖屏蔽，照射后4h内由尾静脉输入0.2ml生理盐水。
三组均于第7、15、30天行血常规检查。
5、选取血象最低时及血象恢复后的存活小鼠，按第一部分中的全骨髓培养法，分离、培养小鼠BMMSCs，与来源于正常小鼠的BMMSC作对照。每日在倒置显微镜下观察活体细胞形态，适时留取照片。MTT法绘制生长曲线。
6、统计学分析：血常规数据用均数±标准差表示，t检验各组间差异，方差不齐者改用非参数检验，取α=0.05。结果1在我实验室条件下，全骨髓培养贴壁筛选法及梯度密度离心法均能成功地培养出BMMSCs。原代细胞生长曲线显示前者细胞贴壁早，生长快，更早达到传代规模。与后者比较有显著差异。达到传代规模时的培养天数均数为D<,P0>∶D<,P0>=9.6±1.14：14.2±1.48(p<0.05)。
MTT法测定细胞活力(贴壁率)：P0/P0’细胞第1～2天变化不大，可能为细胞生长的潜伏适应期；第3天后贴壁显著增加，提示细胞进入对数生长期；第6天起增长缓慢，进入平台期。从P2开始，传代间隔逐渐缩短(P0要约14天，P1约10天，P2约1周，P3约3～4天)。从P4起，约消化传代第2天，细胞就可以贴壁达到60～70％的融合。
2．MSC形态学观察：急性分离的小鼠骨髓细胞接种4小时后，部分细胞贴壁，呈圆形。24小时后呈纺锤形、梭形、多角形等，形态多样，部分细胞形成集落，增殖迅速，集落之间相互靠近。达80～90％融合时细胞形态不规则，有梭形、星形、多角形等。胞体肥大，胞质丰富。P3以后，融合后的细胞呈旋涡状，细胞形态较前均一。
瑞-吉染色MSC形态观察：P0～P2时，MSCs高倍镜下细胞呈梭形、星形、多角形等，胞体肥大，胞质丰富，有细长、分叉的突足，细胞核大而疏松
，核仁明显，可见到处于分裂相的核仁。P3以后细胞形态逐渐趋向均一，呈成纤维样集落状生长并相互融合。P7以后逐渐出现“旋涡”样集落，细胞密度极大。
流式细胞学分析各期MSCs表面抗原：P0表面抗原表达谱为9.03％CD34，1.86％CD44，100％CD45，P3表面抗原表达谱为
0.04％CD34，97.37％CD44，4.29％CD45。多向分化：成脂肪细胞及成骨细胞诱导体系可以诱导P3及以后的培养细胞分别分化为具有脂肪细胞和成骨细胞特点的细胞。
3脾细胞组小鼠于照射后第8天起陆续出现皮毛散乱、体重下降、苍白萎靡。外周血象于照射后开始下降，持续减低15天以上。第7天白细胞水平达到最低点，显著低于正常。单纯照射组小鼠血象在第15天已开始恢复。假照射组小鼠无上述变化。
脾细胞组第7、15天的小鼠骨髓间充质干细胞培养，急性分离的骨髓单个核细胞计数明显低于正常对照组，细胞形态基本与对照组无明显区别。细胞接种后72小时后始有少量细胞贴壁，大部分细胞悬浮、死亡。贴壁细胞形态为圆形或多角形。生长曲线显示其生长明显慢于对照组。
镜下观察细胞形态发现与对照组相比，脾细胞组MSCs集落形成慢，数量少，细胞增殖缓慢。培养2周后，细胞融合不足50％，并且逐渐有细胞漂浮、死亡。培养3周，所剩细胞已不足20％，不能满足传代要求。脾细胞组第30天的小鼠骨髓间充质干细胞培养，与对照组相比，无明显差异。
结论
1、全骨髓培养贴壁筛选法较梯度密度离心法可以更有效地获取小鼠骨髓间充质干细胞：
2、P3～P12 MSCs具有表型均一的特点和多向分化能力；
3、两种方法所培养的细胞形态学、细胞表面免疫表型测定符合MSC特点，均有成脂、成骨等多向间质细胞分化能力；
4、免疫再障模型小鼠BMMSCs活性显著降低，体外细胞培养无法正常增殖、传代；
5、免疫介导的小鼠再障有自限性，骨髓造血功能经过骨髓抑制期后可自行恢复。恢复后的骨髓，间充质干细胞活性亦恢复，可支持正常造血。
2.期刊论文张岩.陈曦海.纪艳超.翟哲.吴波.Zhang Yan.Chen Xi-hai.Ji Yan-chao.Zhai Zhe.Wu Bo贴壁法体外
分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果验证-中国组织工程研究与临床康复2010,14(6)
背景:骨髓中的间充质干细胞含量不高,且随着年龄增加或体质衰弱,骨髓间充质干细胞的数量会逐渐减少.目的:验证贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的效果.方法:大鼠麻醉后取双侧股骨和胫骨,剪去骨骺端,暴露骨髓腔,用含小牛血清的DMEM培养基冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞,反复吹打制成单细胞悬液,接种后置于37 ℃、体积分数为5%的CO_2培养箱内孵育,24 h后全量换液,以后每周全量换液1次,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养.观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪及免疫细胞化学染色鉴定骨髓间充质干细胞表面标志的表达.结果与结论:培养24 h后细胞能够贴壁生长,呈梭形或三角形;第二三天贴壁细胞迅速增殖;培养15 d左右出现致密的贴壁细胞层,呈漩涡状生长或成簇生长.细胞在接种后2 d进入对数生长期,12 d左右进入平台期,约15 d细胞可铺满瓶底.分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞CD90和CD54均呈阳性表达.结果验证了采用贴壁法可在体外成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,操作简单,造成污染的环节和机会较少,不需离心,可以更好的保持细胞活性.
3.学位论文丁洋大鼠骨髓间充质干细胞来源的血管内皮细胞贴附ePTFE的实验研究2008
目的：
应用大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源的血管内皮细胞贴附ePTFE血管壁，并加入肝素共同培养，观察其对细胞贴附效率的影响，探讨提高细胞贴附ePTFE的方法。
方法：
1.MSCs分离和诱导分化培养：在无菌条件下，取SD大鼠长骨骨髓，经密度梯度离心法获取形态均一的梭形细胞；加入10ng/ml内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth facotr，bFGF)共同培养。
2.诱导细胞的鉴定：取传代后第二代实验组和对照组的两组细胞，进行免疫组织荧光染色，观察Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor,vWF)的表达情况，及应用透射电镜观察细胞分化后细胞浆W-P小体的超微结构。
3.细胞贴壁和贴壁率的测定：将诱导的血管内皮细胞分成4组，种植于膨体聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管上并分别加入浓度为0.10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml的肝素培养，每4h检测内皮细胞贴附率，绘制细胞贴壁曲线。
4.统计学分析：实验数据以χ±s表示，采用SPSS13.0软件方差齐性检验和单因素方差分析法进行统计学检测。
结果：
1.经密度梯度离心法获取的MSCs漩涡状生长，形态呈梭形；诱导后细胞的vWF免疫组织荧光染色呈阳性表达，胞浆呈黄绿色，细胞轮廓清晰；电镜下可见血管内皮细胞特征性的W-P小体。
2.诱导的血管内皮细胞在ePTFE的贴附率逐渐升高，于20h时间点达到最高，4组贴比率分别是88.34％、96.48％、91.98％、85.69％。
3.肝素能显著提高血管内皮细胞在ePTFE贴壁率，浓度为20ug/ml肝素的效果最高。
结论：
1.大鼠MSCs具有向血管内皮细胞分化的能力，能够为血管内皮化及组织工程提供理想的种子细胞。
2.肝素对MSCs来源的血管内皮细胞有重要的影响，具有能够有效地提高血管内皮化效率的作用，为人工血管的进一步发展提供了新的思路。
4.期刊论文卢宁.赵龙凤.李红.郝彦琴.黄丽丽.LU Ning.ZHAO Long-feng.LI Hong.HAO Yan-qin.HUANG Li-li应
用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究-山西医科大学学报2010,41(3)
目的 探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期.细胞周期显示81.49%P3代细胞为
G0/C1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性.结论 体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济.
5.学位论文何忠杰大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的实验研究2006
研究背景
目前，肝炎、感染、创伤、肿瘤等引起的晚期终末肝衰竭的患者越来越多，对于肝衰竭或肝功能支持替代方法成为临床的一大难题。现在的临床治疗方法包括肝脏移植、肝细胞移植、肝脏干细胞移植。其中原位肝移植是治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病、代谢性肝病最为有效的方法，但是由于其供体来源极其有限，技术要求高，经济费用大，很难满足众多患者需要，许多患者在痛苦的等待中死亡。肝细胞移植也开展了数十年，其操作简单，价格便宜，曾经颇为流行，但由于其供体缺乏和免疫排斥反应问题而影响到进一步的发展。肝脏干细胞是近几年研究的热点，由于其来源于自体而没有移植后的免疫排斥反应，是合适的肝脏损伤后肝衰竭的移植物并有望成为一种新的临床方法。但经过研究发现，肝脏本身干细胞的数量极其微少，并且其在体外增殖较为困难，限制了这个研究的发展前景。
骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)在一定条件下可以定向分化成为某种成体干细胞、成体细胞或者横向分化为多种组织细胞的潜力被证实了，因而备受人们关注，又有研究发现：它可能是肝脏干细胞的来源之一，也有证据表明MSCs在肝脏损伤的修复中起到非常重要的作用。在此过程中，MSCs的分离、培养和性质鉴定等方面的研究取得了一定进展。骨髓干细胞是成体干细胞中的主要来源部分，它主要由间充质干细胞与造血干细胞组成。造血干细胞在胚胎早期具有分化成内、中、外三个胚层的潜能，以后进一步分化为血系细胞、肌、肝、肺、肾、小肠、皮肤等。它主要存在于骨髓、外周血和脐带血中，可分化为各种血细胞使血液细胞成分得到不断补充，是体内各种血细胞的唯一来源。临床上，造血干细胞移植技术已经成为治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病、多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。伴随造血干细胞的研究进展，MSCs是最近几年被发现的
，它可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、心肌细胞、肝细胞和神经元等。由于MSCs可以向多个胚层、各种组织细胞分化，并且可以通过温和的机械方法获得，故研究其分离培养的方法、进行分化调控，以及培养成为肝细胞具有发展前景，因此它能否最终解决肝脏损伤后肝衰竭的移植物问题成为近来的热点．
研究目的
本实验旨在探讨一种操作简单、费用低廉、结果可靠的大鼠MSCs分离培养方法，为体外增殖提供一种可行的途径。对分离的大鼠MSCs进行体外多细胞因子调控，促使其向有功能的肝细胞分化。对肝损伤模型进行经过诱导的MSCs同种大鼠移植，观察其对损伤肝脏可能的修复作用、探讨修改机制。
本实验研究意义：各种原因引起的肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏损伤疾病的治疗一直是一个全球性难题，骨髓干细胞移植治疗血液系统疾病已积累了几十年的临床经验，而其作为肝基因治疗的细胞载体具有肝细胞不可替代的优势，不仅在于可以替代肝细胞移植，而且还可以在早期即可利用骨髓修复肝脏损伤，并为干细胞工程、肝组织工程提供相应的实验及理论依据。随着人们对MSCs横向分化机制认识的逐步深入，MSCs将替代成熟肝细胞而成为肝细胞移植或体外人工肝脏的一种新来源，将为以上各种原因引起的肝损伤开拓新的治疗途径。
研究方法
1.直接贴壁法分离纯化MSCs，进行体外传代，用免疫细胞化学和流式细胞技术鉴定其性质，用核染技术研究其DAPI和BrdU的标记，流式细胞技术进行细胞周期检测。
2.HGF联合EGF对体外培养的MSCs诱导分化，用倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射和扫描电镜形态学照相，细胞免疫组化、RT-PCR对诱导分化后的细胞进行鉴定。检测诱导分化后MSCs分泌尿素及摄取靛青绿的功能。
3.制造大鼠肝损伤模型，BrdU标记上述诱导与未诱导的MSCs，经门静脉移植至同种D-氨基半乳糖损伤的大鼠，通过血生化检测受体肝功能，组织学、组织免疫组化、组织电镜等方法对移植后的MSCs追踪，评估肝脏修复情况。
上述方法具体内容和过程如下：
1.MSCs分离和鉴定：无菌条件下取大鼠股骨、胫骨，用改良冲洗法抽出骨髓，用直接贴壁法分离纯化MSCs，体外扩增、传代。取第3代行细胞爬片，用抗CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD14、CD34、CD45行免疫细胞化学检查，同时流式细胞技术鉴定它们的定量表达。DAPI和BrdU对分离的MSCs标记，流式细胞技术对分离的MSCs行周期检测。
2.诱导MSCs与鉴定：取上述第3代的MSCs，分为实验组和对照组，实验组按照实验第一部分获得大鼠MSCs，以细胞浓度2×105/ml，接种培养，实验组为特级胎牛血清内添加20ng/mlHGF+10ng/mlEGF培养诱导的MSCs。
3.肝脏损伤的修复：D一氨基半乳糖腹腔注射复制大鼠肝脏损伤模型(400mg/kgD-gal,使大鼠的受到肝脏中等程度的损伤)，分为实验组和对照组，实验组向损伤的大鼠门静脉移植用BrdU标记的HGF联合EGF诱导后的MSCs培养液1ml(每毫升培养液中含细胞数105)，对照组用BrdU标记的未诱导MSCs同浓度剂量对模型行门静脉移植，分别在1、3、7、14天进行抽血查生化(丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST、总胆红素TBi)、切片行常规病理、组织免疫组化法检测CK18、CD34、OV6、BrdU阳性细胞分布迁移情况、透射电镜观察移植后汇管区新增生细胞超微结构，评价类肝细胞在体内移植及修复肝功能结果。
研究结果
1.体外培养的原代MSCs72小时内可见贴壁细胞，7天左右达到汇合，传代后，细胞免疫组化法显示MSCs的CD29、CD44、CD73、CD105、CD166表达阳性，流式细胞仪检测其阳性率分别为64.36％、86.73％、90.21％、74.25％、54.60％；而CD14、CD34、CD45表达阴性，阳性率分别为0.19％、0.17％、0.18％。DAPI标记效率高达100％，BrdU标记率达98％以上，均是较好的标记方法。细胞周期检测结果显示：第3代MSCs中G0/G1期的细胞为89.43％(大约
为36-57道)，G2期的细胞为2.82％(大约在两倍道86-112道)，S期的细胞为7.65％。只有少数细胞处于活跃的增殖期，大部分细胞处于静止期，符合干细胞特征。
2.HGF联合EGF对体外培养的MSCs进行诱导分化：倒置相差显微镜观察显示：实验组诱导培养的MSCs逐渐向类肝细胞形态转变，由刚开始的梭型，变为椭圆型、类圆形，增殖速度减慢，而对照组细胞的形态基本不变。细胞免疫组化鉴定：Alb和AFP蛋白染色，与对照组阴性结果比较，实验组Alb第3天即呈阳性表达，AFP蛋白染色第7天阳性表达。显微荧光观察：实验组MSCs的FITC-AFP为绿色荧光，RPE-Alb为红色荧光。RT-PCR检测：与对照组比较，实验组MSCs细胞的Alb、AFP、CK-18的mRNA都有一定表达，其中AFP的mRNA在第7天阳性表达，14天最强，21天开始减弱，Alb及CK-18第三天即有表达，21天均最强。透射电镜显示：未诱导MSCs具有幼稚细胞的结构特点。
3.诱导MSCs经门静脉移植修复肝脏结果：分别于1、3、7、14天处死大鼠，ALT、AST、TBi三项肝功指标均明显异常，两组均出现逐步下降的趋势(实验组/对照组：ALT：335.67±15.08→45.20±5.89/347.67±22.26→78.00±2.16IU/L。
AST：265.33±15.37→45.00±6.04/267.83±8.80→77.25±6.99IU/L。TBi：7.18±0.37→3.45±0.18/7.60±0.49→4.81±0.23mol/L)，但在同时间段内，实验组下降幅度更大。经过统计学分析，三项指标在两组间有显著差异(F=206.84，P=0.000)，同组内不同时间之间有显著差异
(F=14.289,P=0.000)。说明实验组与对照组对于肝脏功能的保护作用是有差异的，证明了诱导分化的类肝细胞具有修复肝脏功能的作用。组织切片显示：实验组肝细胞变性坏死程度明显轻于对照组，尤以7、14天更明显，免疫组化示BrdU标记的骨髓间充质干细胞随时间延长，逐渐由门脉区向肝内移动，组织免疫组化检测：两组均出现CK18、CD34、OV6阳性细胞结果；与对照组比较，实验组阳性细胞明显增多，形成大量的胆小管，并有部分向坏死区迁移。透射电镜显示：与对照组比较，实验组有新生内源性细胞，小于成熟的肝细胞，细胞器较少，有细胞紧密连接，以数个细胞排列成小胆管，与组织免疫化学检查结果一致。
研究结论
1.本实验表明直接贴壁法分离MSCs简单、易行，对分离的MSCs活性影响较小，值得推广。MSCs能在体外较容易分离培养和扩增，为体内、外研究MSCs提供了很好的来源。BrdU和DAPI标记MSCs敏感性均好，标记效率高，可作为标记细胞的一种有效手段，为细胞移植打下良好的基础。
2.本实验结果显示HGF联合EGF可以诱导MSCs在体外向类肝细胞分化，在实验设置的时间段第7天，可检测到肝细胞标志物和功能表达；形态上在21天更成熟，成为类肝细胞，具有内质网、线粒体、糖原颗粒。
3.本实验将HGF联合EGF诱导后的MSCs移植给受损伤的肝脏，发现其能在一定程度上修复肝脏的损伤，并能激发内源性的卵圆细胞增生，协同恢复损伤的肝功能。对于肝移植、肝细胞移植、肝脏干细胞移植方法上的不足和缺陷，可能会对各种原因的肝损伤患者提供一种新的探索思路。
6.期刊论文李甫强.周鸿鹰.羊惠君.项涛.梅妍.胡火珍.王廷华.LI Fu-qiang.ZHOU Hong-ying.YANG Hui-jun. XIANG Tao.MEI Yan.HU Huo-zhen.WANG Ting-hua差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞-四川大
学学报（医学版）2006,37(2)
目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs).方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、24 h和48 h进行首次全量换液,培养3 d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色.另外,选4 h、8 h、24 h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色.结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少.首次换液时间在接种后2 h的细胞纯度高,但细胞密度低;24 h后的细胞密度高而纯度低;8
h后的细胞密度大具有较高的纯度.传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP.结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10 h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞.
7.学位论文卢宁骨髓间充质干细胞体外培养及脂多糖对其增殖与分泌TNF-α的影响2010
目的：探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法，并观察脂多糖(LPS)对其增殖及分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。
方法：应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs，进行传代培养，倒置显微镜下观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞活力，并采用计数法测定其生长曲线，流式细胞术检测细胞周期，免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45的表达。将BMSCs分为对照组及不同浓度LPS干预组(0μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)，采用噻唑蓝(MTT)比色法观察其增殖情况，酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α的分泌情况。
结果：获取的大鼠BMSCs形态呈均一成纤维细胞样，并呈集落样生长，细胞活力可达95％以上。细胞生长曲线显示：在传代后的第4～5天细胞开始明显增殖，进入指数增生期，6天后进入平台期。细胞周期结果显示，81.49％P3代细胞为G0/G1期，符合干细胞的特征。经免疫细胞化学染色结果显示
：CD44表达阳性，CD34、CD45表达阴性，符合间充质干细胞(MSCs)的表型特征。MTT检测结果显示，与对照组(0.190±0.037)相比，0.01μg/ml、
0.1μg/ml及1μg/mlLPS干预组OD值均增高，其中0.01μg/mlLPS干预组(0.253±0.030)增高明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。而10μg/ml、
100μg/mlLPS干预组OD值则较对照组下降，其中10μg/mlLPS干预组(0.159±0.042)明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。ELISA检测结果显示，与对照组(30.373±0.633)相比，各浓度LPS干预组TNF-α浓度均有不同程度增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。其中，0.01μg/mlLPS干预组TNF-α浓度最高，与1μg/ml、10μg/mlLPS干预组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，与0.1μg/ml LPS干预组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：应用全骨髓贴壁法分离培养出的大鼠BMSCs增殖能力强，具有MSCs的细胞表型特征，且此法简单易行、适于推广应用，所培养的细胞可用于进一步研究。LPS对BMSCs的增殖及分泌TNF-α均有影响，其与LPS浓度的关系表现为一定浓度的LPS作用可以促进BMSCs的增殖及分泌TNF-α，但随着LPS浓度的增大，BMSCs的增殖能力及分泌TNF-α均下降。为进一步研究LPS对BMSCs的影响提供了科学的理论基础。
8.学位论文周丽娜成年大鼠许旺细胞与骨髓间充质干细胞相互影响的体外研究2008
目的：许旺细胞(Schwann Cells，SCs)是周围神经的主要结构和功能细胞，神经损伤后它对神经的再生和功能的恢复起着重要的作用，是临床修复周围神经缺损的种子细胞。为了避免免疫排斥反应，临床需要自体来源的SCs，但是自体来源的SCs数量少，体外扩增速度慢，培养条件高，长期传代增殖后SCs纯度下降、细胞活性下降，不能满足临床需要。因此，有必要探索促进SCs增殖的实验条件。骨髓问充质干细胞(Bone Marrow Stromal
Cells，BMSCs)取材方便、易分离、体外培养增殖速度快；能在体外、体内分化成熟，移植后保持生物学活性，并与组织工程材料有良好的相容性；移植入损伤的周围神经后能够改善神经再生环境，基本满足种子细胞的要求，然而BMSCs在体内生物诱导和体外化学诱导后分化的稳定性不够，在细胞移植修复周围神经损伤中作用时间有限，与宿主组织的整合还不能满足临床的需求，因此，仍需要进一步研究BMSCs在各种创伤修复中的机制，研究促进BMSCs向宿主靶细胞分化的方法。综上所述，周围神经缺损后的再生修复一直是显微外科和神经科学关注的问题，SCs作为首选的种子细胞在临床应用上存在不足而受到限制；而BMSCs在修复周围神经损伤方面表现出了巨大的潜能，但其特定分化成许旺细胞，促进神经再生的潜力还有待挖掘。本项目主要研究获得足够量和高纯度成体SCs的实验方法；研究共培养体系中成体BMSCs和SCs能否互相促进、提升彼此作为“种子细胞”的潜能，探究将这两种成体细胞共同作为“种子细胞”治疗神经损伤的可能。为此，我们设计了以下实验，在体外建立成年大鼠SCs和BMSCs共培养体系，观察BMSCs的定向分化能力和SCs的存活增殖情况。旨在为细胞移植和“组织工程化神经”修复周围神经缺损提供最佳的种子细胞。
实验方法：
1.取Wallerian变性一周成年SD大鼠双侧远侧端的坐骨神经和近侧端神经瘤，使用胶原酶／中性蛋白酶双酶消化法分离SCs，用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，1％Penicillin／Streptomycin，2μmol／L forskolin,20 mg/L Pituitary Extract Bovine(BPE)的DMEM／F12培养液在37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中进行培养，待细胞达80％-90％融合时用于共培养。
2.从成年SD大鼠两侧股骨取材，用全骨髓贴壁法在含10％FBS，2μmol/L L-Glutamine，10ng／ml EGF，1％Penicillin／Streptomycin的
DMEM／F12培养液，37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中培养BMSCs，待细胞达80％-90％融合时，进行连续传代，获得P10代BMSCs用于共培养。
3.使用插入式培养皿Millicell-HA和六孔板建立共培养体系，使BMSCs和SCs不能相互接触但是共用相同的培养液。采用以下两种共培养方法：①取P10代BMSCs，消化后以1×105密度接种于下层六孔板中；取培养好的SCs，消化后以2×105密度接种于事先安放于六孔板上层的插入式培养皿Millicell-HA中，待上下两层细胞在滤膜和培养板中贴壁伸展后，以10％FBS，2μmol／L L-Glutamine，10ng／ml EGF,1％Penicillin／Streptomycin的
DMEM／F12为共培养液，37℃，5％CO2,和95％湿度的培养箱中培养；设立上层不接种SCs的插入式培养皿Millicell-HA为对照组；②取培养好的SCs消化后以2×105密度接种于事先经多聚赖氨酸包被的六孔板中，取P10代BMSCs消化后以1×105密度接种于事先安放于六孔板上层的插入式培养皿Millicell-HA中，待上下两层细胞在滤膜和培养板中贴壁伸展后，以10％FBS，2μmol／L L-Glutamine，10 ng／ml EGF,1％Penicillin／Streptomycin的
DMEM／F12为共培养液，37℃，5％CO2,和95％湿度的培养箱中培养；设立不接种BMSCs的插入式培养皿Millieell-HA为对照组。该实验中，方法①用于观
察SCs对BMSCs的生物诱导作用和BMSCs的分化能力；方法②用于观察BMSCs对SCs增殖能力的影响。
4.检测SCs增殖能力和BMSCs分化能力的方法：利用流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD44、CD45。共培养4天后，应用RT-PCR，Western blot和免疫荧光细胞化学检测SCs标记物S-100蛋白和神经胶质细胞标志物GFAP的表达水平，评估共培养后BMSCs的分化能力和SCs的增殖能力。实验数据以
Mean±SD表示。采用SPSS11.5统计软件对数据进行分析，以不接种SCs的插入式培养皿Millicell-HA为对照组，比较共培养体系中BMSCs分化情况；以不接种BMSCs的插入式培养皿Millicell-HA为对照组，比较共培养体系中SCs增殖情况。组间比较采用Mann-Whitney检验，P<0.05表示差异有显著性。
结果
1.本实验使用胶原酶／中性蛋白酶双酶消化法，SCs培养中加入forskolin和BPE，培养原代SCs细胞，3-5天即可达80％-90％融合，S-100阳性细胞呈棕黄色，胞体小，有细长的两个突起或少数的三个突起，胞体轮廓清晰呈梭形或三角形。而扁平不规则的成纤维细胞呈S-100阴性反应。原代培养的
SCs细胞达90％融合时，S-100的阳性率为70％±2.1％。
2.成年BMSCs原代培养至6-7天时，细胞融合成单层。原代细胞形态不均一，由小圆形、梭形、宽大的扁平状细胞构成。待细胞达80％-90％融合时连续传代，P4代以后，梭形细胞逐渐增多。流式细胞仪分析显示，本实验培养的P10代BMSCs抗原表达具有较高的均一性，标记间质细胞的CD29和CD44强阳性表达，而标记造血干细胞的CD45为阴性。
3.成年SCs诱导组BMSCs与空细胞对照组相比大部分形态没有改变，但体积缩小，少数细胞呈现多个突起的神经元样或两个或三个突起的类许旺细胞样。免疫荧光显示：诱导组BMSCs表达GFAP的阳性率为92.73％±3.347％，对照组仅为5.68％±5.06％；诱导组BMSCs表达S-100的阳性率为
83.7％±7.797％；而对照组BMSCs仅为3.86％±0.99％。RT-PCR和western blot检测出诱导组BMSCs不仅表达GFAP mRNA也表达GFAP蛋白，而空细胞对照组BMSCs则检测不到GFAP mRNA和GFAP蛋白的表达。
4.与成年BMSCs共培养的成年SCs形态同空细胞对照组，与BMSCs共培养组SCs细胞S-100的阳性率达68.76％±9.218％，显著高于空细胞对照组SCs细胞S-100阳性率42.03％±4.655％。
结论
1.使用胶原酶／中性蛋白酶双酶并联合使用forskolin和BPE两种促分裂剂培养成年SCs，能在短时间内最大程度地获得大量高纯度的成年大鼠原代SCs。
2.使用全骨髓贴壁法，能够在P10代时得到纯度较高的BMSCs，此法优点是简便易行。
3.成年大鼠P10代BMSCs与原代SCs在Millicell-HA的共培养体系中共培养4天后，成年SCs可诱导成年BMSCs向神经胶质细胞和许旺细胞方向分化，同时成年BMSCs可促进成年SCs的存活和增殖。
4.本实验中BMSCs与原代SCs的相互促进作用不是两类细胞直接接触产生的“融合”现象，更不是化学诱导物导致的假象，而很可能是两类细胞分泌的营养因子或营养物质相互作用的结果，此推论有待进一步证实。
9.期刊论文林楚伟.周胜华.杜优优.Lin Chu-wei.Zhou Sheng-hua.Du You-you全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大
鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较-中国组织工程研究与临床康复2010,14(14)
背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况
,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.
10.学位论文董佩龙骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内腱—骨愈合效果及示踪的实验研究2009
目的：观察骨髓间充质干细胞对肌腱移植物在骨隧道内愈合的影响，并为干细胞的标记示踪提供实验依据。
方法：采用贴壁分离筛选法获取大鼠的骨髓间充质干细胞（bone mesenchym-al stem cells，BMSCs），用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide，SPIO）和DiI（1，1'-dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate．DiI）对其标记。39只8周龄雄性SD大鼠随机分为两组，实验组21只，对照组18只。实验组在骨隧道内腱-骨结合面注入含双标的BMSCs和Pluronic F-127载体，对照组只注入载体，术后2、4、8周进行生物力学评估愈合效果，实验组2、4、8周组织冰冻切片荧光显微镜和手术后即刻、3、7天行7．0 T MR示踪移植的BMSCs。
结果：SPIO和DiI能有效标记干细胞；实验组2、4、8周荧光显微镜观察在腱骨界面有DiI标记的阳性细胞存在，7．0 T MR未能在实验组腱骨界面观察到明显信号改变；生物力学试验，实验组和对照组在术后2周无统计学差异，在4、8周实验组显著高于对照组（P<0．05）。
结论：移植的骨髓间充质干细胞可以促进骨隧道内腱骨结合部的早期愈合，DiI能有效标记示踪干细胞，SPIO能有效标记干细胞，但在该实验模型中7．0TMR可能不能活体示踪磁粒子标记的干细胞。
引证文献(1条)
1.宋先忠.郑怡章.王俊生.刘海燕.靳中奎.张华.程军涛.史芳涛.王志斌.王宏涛冠状动脉搭桥术同期行自体骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心脏病的临床研究[期刊论文]-郑州大学学报（医学版） 2009(4)
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骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
经验交流 文章编号１００６－８１４７（２０11）０4-0458-03 人骨髓间充质干细胞体外培养模型的建立和表型分析 刘长乐1，李广平1，郑心田1，孟恒星2，邱录贵2，娄建石3 （1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070） 关键词骨髓间充质干细胞；流式细胞术；培养模型中图分类号 Q813 文献标识码 B 骨髓（bone marrow ，BM ） 中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)。MSCs 属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs 作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复 和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异 贴壁法和酶消化法建立MSCs 的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。1材料与方法 1.1材料（1）BM ：39岁男性健康志愿者5mL 。（2）仪器：FACScar 流式细胞仪（Beckman -Coulter ），倒置相差显微镜（OLYMPUS ），荧光显微镜（OLYM －PUS ） ，恒温培养箱（Forma Scientific ），高速低温离心胞系MHCC97-H 的增殖。骨髓间充质干细胞旁分泌物质或许通过分泌细胞因子影响肝癌细胞某一信号通路促进细胞增殖的。 AFP 是CBRH-7919肝癌细胞分泌的一种蛋白，本研究发现随着骨髓间充质干细胞旁分泌物质浓度的升高，AFP 也逐渐升高，表明骨髓间充质干细胞旁分泌物质也增强了7919肝癌细胞分泌AFP 的功能。 骨髓间充质干细胞促进肝癌细胞增殖的具体机制目前尚未明确，目前有以下几种学说：免疫抑制影响肿瘤基因的表达，分泌细胞因子以及参与肿瘤血管形成等[4-7]。邵志红等[5]发现大鼠骨髓间充质干细胞能通过影响Walker-256肝癌细胞VEGF 和nm23的表达,促进肝癌细胞的增殖。Li 等[6]发现人骨髓间充质干细胞是通过分泌细胞因子进而影响TGFβ信号通路促进肝癌细胞增殖的。尽管骨髓间充质干细胞对肝癌增殖的确切机制尚未明确，但有效地抑制骨髓间充质干细胞的促增殖作用具有重要的意义，其有可能成为新的抗癌靶点。笔者将继续研究骨髓间充质干细胞旁分泌物质促进肝癌细胞增殖的内在机制，为肝癌治疗带来新的希望。 参考文献： ［1］Lu YR,Yuan Y,Wang XJ,et al.The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo[J].Can-cer Biol Ther,2008,7(2):245 ［2］乔玲，赵铁军，山长亮，等.人间充质干细胞抑制肝癌细胞增殖 的作用及其基因表达谱分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2007，23(12):1037 ［3］陈双庆，王培军，李铭华，等.磁标记骨髓间充质干细胞对肝细 胞癌的抑制作用[J].临床放射学杂志，2009，28(10):1454 ［4］Djouad F,Plence P,Bony C,et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals [J].Blood，2003,102(10):3837 ［5］邵志红，王培军，李铭华，等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对 Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志，2009，89(7):491 ［6］Li GC,Ye QH,Xue YH,et al.Human mesenchymal stem cells in-hibit metastasis of a hepatocel lular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J].Cancer Sci,2010,101(12):2546 ［7］Zhu W,Xu W,Jiang R,et al.Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo [J].Exp Mol Pathol,2006,80(3):267 ［8］Zheng JF,Liang LJ.Transplanted bone marrow stromal cells are not cellular origin of hepatocellular carcinomas in a mouse model of carcinogenesis[J].World J Gastroenterol,2008,14(19):3015 ［9］Leek RD,Harris AL,Lewis CE.Cytokine networks in solid human tumors:regulation of angiogenesis[J].J Leukoc Biol,1994,56(4):423 ［10］Budhu A,Wang XW.The role of cytokines in hepatocellular carci-noma[J].J Leukoc Biol,2006,80(6):1197 （2011-04-27收稿） 作者简介刘长乐（1979-），男，主治医师，硕士，研究方向：冠心病、心律失常；通信作者：李广平，Email ：tjcardiol@https://www.doczj.com/doc/237189858.html, 。 Ｖｏｌ．１7熏Ｎｏ．4Dec.２０11 天津医科大学学报 Journal of Tianjin Medical University 第１7卷4期２０11年12月 458
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml
骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展 邴爱英宋文刚 (泰山医学院 , 山东泰安 271016 关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性 中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化为多种胚层细胞 [1－2], 更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能 , 进行异体移植时可避免免疫排斥反应 [3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。 20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充质干细胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又称 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分离出BMSCs , 发现其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。近年来 , 人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不同。 1骨髓间充质干细胞的分离与培养 BMSCS 的含量很低 , 约占骨髓有核细胞的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和扩增。目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要有 :贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂 , 纯度不够高。而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验条件要求高 , 需要骨髓量较大。目前最