植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
收稿日期:2006-09-041 作者简介:刘晓侠(1978- ),女,江苏丰县人,嘉兴学院生物与化学工程学院教师,博士,研究方向为基因工程、发酵工程。 微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进 刘晓侠1 ,林建平2 ,岑沛霖 2 (11嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴314001;21浙江大学生物工程研究所,浙江杭州310027) 摘 要:高质量的微生物基因组DNA 是基因工程的前提。目前国内外关于微生物基因组DNA 提取的方法很多,根据研究对象和目的不同而方法各异。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组 DNA 的方法进行了比较,并对它们进行一些改进,获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便、快速 且高质量基因组DNA 提取方法,并对提取的DNA 进行PCR 特异性扩增检测,获得较清晰的谱带[1],为基因克隆表达研究奠定了基础。 关键词:微生物;DNA 提取;PCR 中图分类号:Q933 Co m par ison and I m prove m en t of Extracti on M ethods for Geno m i c D NA L I U Xiao -xia 1 ,L I N J ian -p ing 2 ,CE N Pei -lin 2 (11School of B i ol ogy and Che m ical Engineering,J iaxing university,J iaxing,Zhejiang 3140001; 21I nstitute of B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310027) Abstract:H igh quality genom ic DNA fr om m icr oorganis m is the p reconditi on of genetic mani pulati on .Now many methods f or the extracti on of genom ic DNA are devel oped according t o different research object and intenti on .Three kinds of methods widely app lied are compared and ref or med in is olati on of genom ic DNA fr om m icr oorganis m.And ef 2fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components .Ge 2nom ic DNA gained by three different methods above is s pecifically a mp lified and clear band is observed by agar ose gel electr ophoresis,which is convenient t o genetic mani pulati on later . Key words:m icr oorganis m;DNA extracti on;PCR (Poly merase Chain Reacti on ) 文献标识码:A 1 文章编号:1008-6781(2007)03-0048-03 1 材料与方法111 试验材料 黄色短杆菌(B revibacteriu m helvolum AT CC11822,G -)从北京微生物所购买;放射形土壤杆菌 (Agr obacteriu m radi obacter ACCC10056,G -)从中国菌种保藏中心购买;金黄色葡萄球菌(G +),枯 草芽孢杆菌(G + )为本实验室保藏。 112 试剂及仪器 [2] 主要试剂为10mg/m l 溶菌酶,20mg/m l 蛋白酶K,2×CT AB (十六氨基三乙基溴化铵)。引物序列为:5π-ggaattcggatccatggacttcgaggcattt (B am H I,EcoR I ),3π-ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H in d III ),由上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器有Lengguang Tech 1Spectrum lab54型分光光度计,L I TT LE GE N I U S (Japan )基因扩增仪。113 聚合酶链式反应(PCR ) PCR 扩增的反应体系为:反应总体积20μl,含10pmole 引物,50ng 基因组DNA,2μl 10×PfuTaq ? 84? 嘉兴学院学报 Jou rna l of J iaxing U n iversity 第19卷第3期2007年5月 Vol .19No .32007.5
1试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 2 DNA提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
1 试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或 NaAc，Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。 2 DNA 提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而 有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS 处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA 在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 A.利用RNA 和DNA 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA 粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA 位于上层水相中,用2 倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B.也可用0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧 核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
一、移液器使用 移液器（也称作“枪”）是所有分子实验操作不可或缺的工具，其正确使用是顺利开展各项实验的先决条件。为保证实验结果的准确性和稳定性，同时延长移液器的使用寿命，请大家细心操作并遵守以下使用规则和注意事项： 1.从未使用移液器或刚进入实验室的研究生，只有完全准确掌握移液器使用 规则后方可独立使用移液器。 2.按需要选用合适量程的移液器，调整刻度时，注意看移液器刻度表，不要 超过最大刻度。 3.装配吸头时，用力不要过猛，以免吸头难以脱卸，同时损坏移液器。 4.吸取液体时，注意要慢慢向上释放控制按钮以免吸入速度过快导致液体进 入移液器内。 5.切忌平放带有残液的吸头的移液器，更不能倒放。 6.使用移液器清洗或溶解固体物质等需反复吸打时，请装配多个叠加的吸 头，且调整刻度不超过移液器最大量程的一半。 7.移液器使用完毕，务必调到最大刻度，并稳妥地放回对应的移液器架上。 8.细心操作，如不小心使移液器表面沾到液体，请及时清洗干净；如不小心 将液体吸入移液器内，应及时清洗。 9.严禁用沾有放射性或腐蚀性物质的手套触摸移液器表面；严禁不熟悉移液 器构造者私自校对移液器刻度。 第一节叶片总DNA的提取 一、取样须知 1. 取样之前一般要先编号（牌子和离心管的编号）和挂牌，务必保证离心管中 的叶片是来自于同一编号单株，编号切勿混淆； 2. 为保证质量，所取样品尽量为幼嫩叶片组织，并尽量保证全程低温（使用冰 袋或碎冰）； 3. 取样时间最好在晴天或阴天上午叶面露水干后进行，尽量使样品不沾水及泥 土。 4. 如使用塑料袋装样品，切记将袋内空气排尽，以免在–70℃保存时塑料袋破裂导致样品混合。 二、试剂的配制 1. Tris-HCl ( 1.0 M/L, pH8.0 ) 121.16g Tris-HCl 和43ml HCl 加dd H2O 定容至1 L. 2. EDTA ( 0.5M/L, pH8.0 ) 186g EDTA和25g NaOH加dd H2O 定容至1 L. 3. 2％CTAB 81.9g NaCl 100ml 1.0 M/L Tris-HCl ( pH8.0 )
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 植物DNA提取经典方法CTAB法 标题:植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 摘要: CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0 7mol L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复…… 关键词:植物DNA提取经典方法CTAB法 最专业的生命科学学术交流论坛 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 一、CTAB提取缓冲液的经典配方： Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 二、CTAB提取缓冲液的改进配方： (1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖； (2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化； (3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化； (4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合； (5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。 三、基因组DNA提取常见问题 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制
DNA提取方法进展综述 2014-05-10 14:18:51 来源：浏览次数：21 网友评论 0 条 [DNA提取方法进展综述] 张宁，王凤山(山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，山东济南250012《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期)摘要：dna的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engi [海洋生物微生物 DNA提取方法进展细胞组织蛋白质] 张宁，王凤山 (山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，山东济南250012 《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期) 摘要：dna的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engineering)各项研究所必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现，本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法进行综述。 关键词：DNA；提取；动物；植物；微生物；海洋生物 Advances of DNA extraction methods ZHANG Ning，WANG Feng-shan (Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs，School of Pharmacy，Shandon g University, Jinan 250012，China) Abstract：DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene eng ineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals，plants，microorga nisms and marine organisms were summarized in this article. Keywords：DNA；ex traction；an imals；plants；microorganisms；marineo rganisms 自20 世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深人，在此基础上产生的基因工程(Genetic Engineering)技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。
（一）细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤： 1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. （三）Chelex法抽提DNA 1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。 2.取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20 分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出 3.12000rpm离心5分钟，弃上清 4.加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL，置50℃水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟， 灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性 5.取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20℃保存备用
v1.0 可编辑可修改 1 各种DNA 提取方法 一，基因组DNA 提取方法 制备基因组DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb 。在DNA 提取过程中应尽量避免使DNA 断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB 方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS 漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA 提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K 使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm 离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L 的LiCL 混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm 离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min 。2500rpm 离心10min 。弃上清。 8、加入倍体积3mol/L 乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min 。 9、12000r/min 室温离心5min 。弃上清。将DNA 溶于适量TE 中。 二，外周血DNA 提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml ，EDTA 抗凝，2500rpm 离心10min 。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min 。 4、2500rpm 离心10min ，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min 。 6、3000rpm 离心10min ，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h ，4℃放置不超过5h ，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA ： 试验试剂： Ligsisbuffer ： 7.12g30.071g ；最后加灭菌去离子水至1000ml ，高压灭菌。ACD 抗凝剂：__________柠檬酸1.68g 柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g ；最后加灭菌去离子水至350ml ，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer ）： 10mMTrisCl(PH=(PH=(PH=(PH=%SDS10%；最后加灭去离子水至100ml ， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm ，离心5min 。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm ，离心5min 。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h 。
D N A提取方法(一) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
各种DNA提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris- cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMED TA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5m MEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm 离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心 12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质