实验报告
课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊
一、实验目的和要求（必填）
三、主要仪器设备（必填）
五、实验数据记录和处理
七、讨论、心得
二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填）
一、实验目的和要求
掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法；
二、实验内容和原理
以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量
分析。原理如下：
1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取；
2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素
分开；
3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素；
4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光；
5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境
姓名： 吴主光
学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心
装
订 线
三、主要仪器设备
1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等
四、操作方法、实验步骤以及实验现象
定性分析：
鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆
过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。
皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。
取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。
取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。
叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：
皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1）
反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1)
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰.
叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。
五、实验数据记录和处理
OD645 = 0.104 OD652 = 0.147 OD663 = 0.246
Ca(mg/L)=12.7 OD663 - 2.69 OD645 = 2.84 (mg/L)
Cb (mg/L) =22.9 OD645 - 4.68 OD663 = 1.23 (mg/L)
CT (mg/L) = Ca + Cb = 4.07 (mg/L) 或 OD652× 1000 / 34.5 = 4.26 (mg/L) Chla含量(mg/g.FW) = （Ca(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 1.42 (mg/g.FW)
Chlb含量(mg/g.FW) = （Cb(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 0.62 (mg/g.FW)
Chl总含量(mg/g.FW) = （CT(mg/L)/1000）×2/ 0.1×5/ 0.2 = 2.04 (mg/g.FW)
六、实验结果与讨论
1.吸收光谱图谱分析
胡萝卜素吸收波长范围集中在400-500nm的蓝紫光区，其中占主要的440-480区间内出现了两个峰值。
叶绿素吸收波长范围集中在400-500nm的蓝紫光区以及600-700nm的红橙光区，其中蓝紫光区峰值明显大于红橙光区。
2.定量分析
由OD652计算得出的Chl总含量与OD625及OD663得出的值稍存在一定的偏差，经分析可能原因：
1.视觉误差：由于操作者个人视力的因素不可能将仪器刻度盘绝对准确
地调至645nm、652nm以及
663nm，另一方面由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，从而此时对3个数值的调准偏差应尽量减少到最低；
2.实验材料制备的误差：实验制备材料时可能由于叶绿素叶黄素等没有
充分溶解，导致后面测得的数剧偏低。
3.仪器误差：仪器本身造成实验结果产生误差；
七、心得
实验中最重要的部分不是分光光度计对于吸收峰的测定，最重要的部分应该是实验材料的制取，制取材料的时候如果没有制备好，后面测得的数据会有很大的偏差，与标准值差距也会非常大。
植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名
摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。 3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C 55H 72 O 5 N 4 Mg，MW=893.4891 叶绿素b：C 55H 70 O 6 N 4 Mg，MW=907.4727 胡萝卜素：C 40H 56 ， MW= 536.8726 叶黄素：C 40H 56 O 2 ， MW=568.8714 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试 管等 3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、 醋酸铜 三、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵; （2）加入少许石英砂和CaCO 3 ,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml; （3）用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处). 2、纸层析分离叶绿体色素 （1）层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的
! 课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型： + ■■ + I- i实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 ■■ jl + : 姓名： * 专业：学号： ■■ jl 1 同组学生姓名：指导老师： + 装 实验地点：实验日期: 订 一、实验目的和要求线 r 二、实验内容和原理 i三、主要仪器设备 卜 四、操作方法与实验步骤 + 1 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下: 实验报告
1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙醇或80%勺丙酮提取。 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 COOGH COO MoONMg \ + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH COOCHk COO 3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg+可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ ) 褐色绿色 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值 之间有如下的关系：OD=Ca*k a1+G*k b1 OD=Ca*k a2+G*k b2 查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。 比吸收系数k 波长/nm
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。 解方程（1） （2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)
实验报告 课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法； 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量 分析。原理如下： 1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取； 2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素 分开； 3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素； 4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光； 5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光 学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心 装 订 线
三、主要仪器设备 1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法、实验步骤以及实验现象 定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。 皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。 取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） 反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645
叶绿素的药理功能及特性 ■叶绿素的药理功能 叶绿素是植物中含的绿色色素，植物细胞内的叶绿体吸收太阳光能源，从水和空气中CO2合成糖等有机物。叶绿素结构类似动物血液中的红色素，为维持生命不可缺的重要物质。 叶绿素存在许多类似体，高等绿色植物和绿藻等含叶绿素a和b，褐藻、硅藻等含叶绿素a。为提高稳定性，食品和医药品中用叶绿素诱导体为多。 叶绿素有多种药理效果引起食品界的注目。铜叶绿素、铜叶绿素钠、铁叶绿素钠早在上世纪60年代初就被作为食品添加剂，用于口香糖、蔬菜等加工品的着色。日本研究表明，叶绿素的诱导体可作胃肠药、口臭防止药、洗口液等成分。 具体说，叶绿素有下列重要药理功能： 创伤治愈作用 叶绿素能促进切伤、火伤、溃疡等伤口的肉芽新生、加快治愈作用。对创伤、溃疡局部涂布能使创伤面干燥，加快肉芽及上皮细胞的产生，明显促进创伤治愈。 脱臭作用。叶绿素能除去饮食、香烟及新陈代谢产生的口臭、脚臭、腋下恶臭、饮酒后酒气臭。铜叶绿酸钠有显著抑制口臭的挥发性硫化物的效果。 抗过敏作用。铜叶绿酸钠对治疗顽固性慢性荨麻疹、顽固性慢性湿疹、支气管哮喘及冻疮均有明显效果。叶绿素的抗过敏作用强。 抗溃疡作用。据国外对鼠试验，对幽门结扎溃疡的鼠同时投服叶绿酸作制酸剂和抗胆碱药有明显抗溃疡效果。 肠蠕动功能亢进作用。叶绿素能使肠道蠕动轻度亢进，解消便秘。 抗变异原性。叶绿酸、叶绿素能和发癌物质Trp－p－2的活性体形成复合体，使其不活化，还能抑制黄曲霉素、苯并芘等变异原物质。 制癌作用。叶绿酸钠能使肝癌细胞的增殖消失。叶绿素提取物有抗肿瘤功能及大大提高肿瘤的光导疗法效果。 降血清胆固醇作用。叶绿素的分解物脱镁叶绿素及叶绿酸均有降低胆固醇效果。 叶绿素来自天然植物，安全性高，作为绿色的叶绿素的应用将更加广泛，在食品中作健康与功能食品添加剂。 ■叶绿素的制造及性质 叶绿素制造，以小球藻等为原料，用丙酮等有机溶剂提取，得到叶绿素a、b的混合物。但这种天然的叶绿素受光线（特别是紫外线）和热分解、易褪色。对酸非常不稳定，其中金属镁容易脱离生成脱镁叶绿素，呈褐色。 将叶绿素中的镁用铜、铁等置换，能使稳定化。以酯结合的叶绿醇用碱加水分解得到叶绿酸，叶绿酸的钠或钾盐溶于水。市售的叶绿素，是将叶绿素的镁置换为铜的铜叶绿素，铜叶绿素被钠、铁置换成水溶性的铁叶绿酸钠。 叶绿素为黑绿～浓绿色的油或膏状，易溶于醚、丙酮等有机溶剂和油脂类，微溶于乙醇，不溶于水，因此因乳化剂呈分散性制剂。铜叶绿素外观、溶解性和叶绿素相同，色调呈强绿色。 铜叶绿素酸钠及铁叶绿酸钠是青黑色～暗绿色的粉末。易溶于水或稀酒精溶液中，不溶于油脂类中，但在酸性溶液中钠游离而使不溶于水，在钙镁离子等存在下，生成不溶性的盐，因此用水须非常注意。
叶绿素含量的测定 一.实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 ● 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 ●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： ●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 ●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： ●A663=82.04C a+9.27C b （1） ●A645=16.76C a+45.60C b（2） ●C a=12.7 A663—2.59 A645(3) ●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4) ●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) ●
叶绿素含量的测定 绿素含量的绿定叶 一、绿绿目的 1.了解分光光度绿的工作原理～ 2.掌握不同型分光光度绿的操作方绿～号 3.通绿本绿绿的绿掌握绿素含量绿定的一绿常绿的方法学叶------分光光度法。 二、绿绿原理 叶叶体体体叶绿素是脂溶性色素～主要存在于以绿绿首的色素中。在活中～绿绿 素脂蛋白绿合受到绿原系绿的保绿～绿和光是绿定的。与并氧 叶绿素的80%丙绿提取液在波绿663nm～645nm有吸收峰～绿素叶a和绿素叶b 的绿度符合以下公式, C=0.0127A-0.00259A a663645 C=0.0229A-0.00467A绿度绿位是,g/Lb645663 C=12.7A-2.59Aa663645 C=22.9A-4.67A绿度绿位是,mg/Lb645663 叶绿素绿绿度绿, C=C+CTab 若以绿液中色素含量表示～绿来 三、绿器、绿绿和材料 1.绿器 紫外-可绿分光光度绿、、研体25ml容量、璃漏斗、璃棒、皮绿滴管瓶玻玻2. 绿绿
丙绿;分析绿,、85%丙绿、80%丙绿 2.材料 绿绿、石英砂、酸绿碳 四、操作步绿 1. 在遮光件下取出等绿绿品～剪碎～混～取绿绿条匀称0.1-0.5g～ 2. 绿品置于绿～加入少量酸绿和石英砂～加入一定绿的丙绿磨绿绿～再加研内碳体研匀 85%丙绿适量绿绿磨至绿绿白色～研 3. 绿绿有绿绿的漏斗绿液绿入将匀25ml的容量中～用瓶并80%的丙绿分次洗绿和绿绿清研～ 最后用80%的丙绿定容。 4. 以80%的丙绿绿比液～在参663和645nm波绿绿绿定吸光绿;A绿在0.2-0.8范绿～内 绿度绿大绿用80%丙绿适稀绿,。当 五、绿果绿理 按照公式绿算出绿素叶a和绿素叶b的绿度～再绿算出绿素的含量。叶六、 注意事绿 1. 在活～绿合绿绿素是绿定的～绿绿一绿破～绿素易被光解。因此～抽提和绿体内叶坏叶 定工作绿可能避光快速完成。尽 2. 绿含有大量酸性液泡的绿品～绿首先加入微性的绿液～仔绿磨后加入丙绿绿行碱冲研抽提。 3. 分光光度绿的精度绿绿定的绿果有至绿重要的影～使用前绿绿器绿行校正。响七、思考绿
实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75
叶绿素含量测定方法---丙酮法 由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数 叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数 叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。 叶绿素提取方法 提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。
一、实验课题名称：不同环境条件下植物叶绿素a、b含量的比较 二、选题背景或文献综述： 《植物生理学实验指导》（第四版）、《植物生理学》（第六版）、上网查阅相关资料 阴生植物也称“阴性植物”，是在较弱的光照条件下生长良好的植物，但并不是阴生植物对光照强度的要求越弱越好，而是必须达到阴生植物的补偿点，植物才能正常生长。 阳生植物也称“阳性植物”，光照强度对植物的生长发育及形态结构的形成有重要作用，在强光环境中生长发育健壮，在阴蔽和弱光条件下生长发育不良的植物称阳性植物，这类植物要求全日照，并且在水分、温度等条件适合的情况下，不存在光照过强的问题。 阳生植物和阴生植物的区别:关于光的饱和点和补偿点光是光合作用的能量来源，光照强度直接影响光合速率，在其它条件都适宜的情况下，在一定范围内，光合速率随光照强度提高而加快，当光照强度高到一定数值后，光照强度再提高而光合速率不再加快，这种现象叫光饱和现象。开始达到光饱和现象的光照强度称为光饱和点，在光饱和点以下，随着光照强度减弱，光合速率减慢，当减弱到一定光照强度时，光合作用吸收二氧化碳量与呼吸释放二氧化碳的量处于动态平衡，这时的光照强度称为光补偿点。此时植物制造有机物量和消耗有机物量相等，不同类型植物的光饱和点和
补偿点是不同的，阳性植物的光饱和点和补偿点一般都高于阴性植物。 结构和特性的区别:阴生植物的叶片的疏导组织比阳生植物稀疏，以叶绿体来说，阳生植物有较大的基粒，基粒片层数目多的多，叶绿素含量也高，阴生植物在较低的光照条件下充分的吸收光线，叶绿素a/叶绿素b的比值小，能够强烈的利用蓝紫光，阳性植物叶片小而厚，表面具蜡质或绒毛，叶脉密，单位面积内气孔多，叶绿素含量高，体内含盐分多，渗透压高，可以抗高温干旱，阳生植物的气孔一般在叶片下表皮分布的数量多于上表皮，这样可以避免阳光直晒而减少水分散失，阳生植物的呼吸速率高于阴生植物。 区分阳生植物与阴生植物，主要是根据植物对光照强度需要的不同，阳生植物要求充分直射日光才能生长或生长良好，阴生植物适宜于生长在荫蔽环境中，它们在完全日照下反而生长不良或不能生长，阳生植物和阴生植物之所以能适应不同光照，是与它们的生理特征和形态特征不同有关，以光饱和点来说，阳生植物的光饱合点是全光照（即全部太阳光照）的100％，而阴生植物是全光照的10％～50％。因为阴生植物叶片的输导组织比阳生植物的稀疏，当光照强度增大时，水分对叶片的供给不足，阴生植物便不再增加光合速率，以叶绿体来说，阴生植物与阳生植物相比，前者有较大的基粒，基粒片层数目多，叶绿素含量较高，能在较低光照强度下充分地吸收光线。此外，由于叶绿素b含量相对较多，易于吸收遮阴处的光（如
一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸； 2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1.光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2.荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。
植物生理学实验报告实验题目：叶绿素含量的测定 姓名 班级 学号
一、实验原理和目的 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、实验器具和步骤 植物材料：女贞 实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀 试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 三、实验数据和作业
2、计算叶绿素含量 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 由上面的公式进行代入计算，有： Ca=13.95*1.820-6.88*0.953=18.83236 Cb=24.96*0.953-7.32*1.820=10.46448 C类=（1000*1.948-2.05*18.83236-114.8*10.46448）/245=2.8901 则：叶绿素含量=（29.29684*10*0.001*1）/0.1=2.9297 四、数据分析 实验中可能清洗研钵和滤纸不是特别干净可能造成误差 五、思考题 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？答：因为叶绿素存在于叶绿体内囊体上与其上的蛋白质组成色素蛋白复合体，要 分离叶绿素和蛋白质必须有水，叶绿素的头部为极性的，有亲水性
实验一植物叶绿素含量的测定 一、实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子天平；3）研钵；4）棕色容量瓶；5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸；8）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。
测定叶绿素a和b的方 法及其计算 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
实验二十五测定叶绿素a和b的方法及其计算 一目的要求： 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二实验原理： 如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。 图z-4 叶绿素a和b的吸收光谱曲线 横坐标为波长（nm），纵坐标为比吸收系数 根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2） 式中：Ca为组分a的浓度，g/L。 Cb为组分b的浓度，g/L。 OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。 OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。
ka1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值。 kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值。 ka2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值。 kb1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值。 从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下： 将表中数值代入上式（1）、（2），则得： OD663=×Ca+×Cb OD645=×Ca+×Cb 经过整理之后，即得到下式： Ca= OD645 Cb= OD663 如果把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式： Ca= OD645 （3） Cb= OD663 （4） CT= Ca+ Cb= OD663+ OD645 （5） （5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。 利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度 （mg/L）。 [附注]一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的标称波长与实际波长不符，
植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 [原理] 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： A=Kbc 式中： A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 解方程（1）和（2）得： Ca=12.7 A663—2.59 A645 (3) Cb=22.9 A645—4.67 A663 (4) Ca十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要测得叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度，就可计算出提取液中的叶绿素a、b浓度和叶绿素总浓度（a+b）。 [材料、仪器、药品]
实验报告 课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、 实验目的和要求： 1． 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。 2． 掌握定量分析的原理和方法。 二、 实验内容和原理： 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3．取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+装 订
取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、实验材料与试剂 材料：青菜叶 试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸 四、主要仪器设备： 1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2．研具、PE管、酒精灯等 五、操作方法和实验步骤（必填） 1．定性分析： 荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象 O 1ml，分层后观察皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H 2 取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变亮绿色2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD ），在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD ），分别测定叶绿素的吸收峰
叶绿素含量的测定 有谁知道用分光光度计法测定叶绿素含量的具体步骤????谢谢!!!!!! 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百 分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。 （三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。 三、实验步骤 1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙 粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。 四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量： 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。