实验三 血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定(七年制)
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生物化学实验报告班级:学号:姓名:实验室:评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期:实验一:血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的:1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理:1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
此外,中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
2.凝胶层析法脱盐:在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。
3.醋酸纤维素薄膜电泳:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。
由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
4.分光光度计是应用分光光度法(即比色法)测定物质含量的装置。
通常需要加入某种显色剂,以产生有色化合物,其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比,据此对待测物浓度进行测定。
分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs(吸光度)=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作:1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟,3000rpm离心10分钟。
11.6⽣化实验报告⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验⽬的】1、了解蛋⽩质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离⼦交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋⽩质的⽅法。
【实验原理】1、蛋⽩质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐,盐中的带电粒⼦使蛋⽩质周围的⽔化膜减弱,胶粒溶解度降低,形成沉淀析出的过程,是胶体的聚沉现象的⼀种。
向蛋⽩质溶液中加⼊某些浓的⽆机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后,可以使蛋⽩质凝聚⽽从溶液中析出,这种作⽤就叫做盐析。
盐析不能使蛋⽩质变性,可以复原。
利⽤这个性质,可以采⽤多次盐析的⽅法来分离、提纯蛋⽩质。
蛋⽩质在⽔溶液中的溶解度取决于蛋⽩质分⼦表⾯离⼦周围的⽔分⼦数⽬,亦即主要是由蛋⽩质分⼦外周亲⽔基团与⽔形成⽔化膜的程度以及蛋⽩质分⼦带有电荷的情况决定的。
蛋⽩质溶液中加⼊中性盐后,由于中性盐与⽔分⼦的亲和⼒⼤于蛋⽩质,致使蛋⽩质分⼦周围的⽔化层减弱乃⾄消失。
同时,离⼦强度发⽣改变,蛋⽩质表⾯的电荷⼤量被中和,蛋⽩质溶解度更加降低,之蛋⽩质分⼦之间聚集⽽沉淀。
由于各种蛋⽩质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋⽩质不同,从⽽使之从其他蛋⽩中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加⼊蛋⽩质溶液,使蛋⽩质表⾯电荷被中和以及⽔化膜被破坏,导致蛋⽩质在⽔溶液中的稳定性因素去除⽽沉淀。
由于清蛋⽩的亲⽔性⽐球蛋⽩⼤,且清蛋⽩的分⼦⽐球蛋⽩⼩,所以清蛋⽩需要⾼浓度的盐溶液才能够发⽣盐析,低浓度的时候球蛋⽩发⽣盐析。
盐析法分离蛋⽩质:各种蛋⽩质的颗粒⼤⼩、亲⽔程度、pI不同,盐析所需的盐浓度也不⼀样。
调节盐浓度可使不同的蛋⽩质沉淀,从⽽达到分离的⽬的。
常⽤中性盐:硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵:温度系数⼩,溶解度⼤,蛋⽩谱⼴,盐析效果好,不易引起变性。
可⽤硫酸/氨⽔按需要调节pH值。
本实验中清蛋⽩分⼦⼩,亲⽔性强,在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出,⽽球蛋⽩分⼦⼤,亲⽔性弱,在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法,是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。
将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子,然后用石油醚淋洗,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。
3.基本原理固定相—固定不动。
流动相—对固定相作单向相对运动,推动样品中各组分通过固定相向前移动。
分离原理:待分离混合物中各组分理化性质不同,对流动相和固定相具有不同的作用力,因此在流动相推动样品通过固定相的过程中,通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用,造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等,达到分离。
4.凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义:指混合物随流动相流经固定相的层析柱时,混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
②基本原理:固定相:凝胶,不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质,凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔,如同筛子一样,故称分子筛。
包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。
流动相:洗脱液。
样品加于柱上,样品随洗脱液的流动而向下移动,小分子能进入凝胶孔内部,做不定性扩散运动,流程长,速度慢,后流出;大分子不能进入凝胶孔内部,只能在颗粒间移动,作垂直向下运动,流程短,先流出→大小分子彼此分开。
③影响因素*层析柱的选择及装填:柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率:各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围,有最大极限和最小极限。
凝胶分离范围之外的分子,难以分离。
如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。
*洗脱液:溶解待分离物质,不变性*加样量:1%~5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同,借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践摘要】为改革生物化学实验,提高实验教学水平,对“血清γ-球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合,建立了综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”,实现实验内容和生化技术的综合与创新。
经过4年的医学本科生教学实践,实验方法稳定,结果重复可靠,适合实验教学,有利于提高大学生的综合实验技能。
【关键词】γ-球蛋白综合性实验创新血清γ-球蛋白又称免疫球蛋白(Ig),具有重要的医药应用价值。
许多医学院校把提取血清γ-球蛋白作为生化实验教学内容。
本室于2007年初,对原有生化实验“血清γ-球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新,选用猪血清,保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤,增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及SDS-PAGE法鉴定提取的血清γ-球蛋白纯度,建立并开设了16学时的综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”。
通过血清γ-球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验,涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。
突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式,使学生受到一次综合性生化技能训练,提高了实验教学效率和效果。
1 材料与方法1.1 仪器材料1.1.1 仪器 KDC-40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C电泳仪及DYCZ-24D型垂直板电泳槽。
1.1.2 试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)、葡聚糖凝胶G—25(SephadexG-25)、奈氏(Nessler)试剂、20%(W/V)磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA(牛血清白蛋白)等,除SephadexG-25外均为国产。
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 .掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 .熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 .了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 .γ- 球蛋白的分离、纯化( 1 )盐析:清蛋白与球蛋白的稳定性不同,故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中,清蛋白不沉淀,球蛋白沉淀,离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
( 2 )脱盐:球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化,应除去。
脱盐的方法有多种,本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中,柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物,最常用的有葡聚糖凝胶( Sephadex Gel )和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物,它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中,不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时,比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中,而被排阻在凝胶颗粒之外,随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样,由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时,先被洗脱出层析柱的是球蛋白,小分子硫酸铵由此法分离除去(参见第 2 篇第 2 章图 2-3 )。
( 3 )纯化:γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白(以及微量的清蛋白),等电点不同,所以采用离子交换层析,从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素,它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大,而且品种较多,可以适用于各种分离目的。
血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。
【实验原理】1、蛋白质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐,盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱,胶粒溶解度降低,形成沉淀析出的过程,是胶体的聚沉现象的一种。
向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后,可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用就叫做盐析。
盐析不能使蛋白质变性,可以复原。
利用这个性质,可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。
蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目,亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。
同时,离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,蛋白质溶解度更加降低,之蛋白质分子之间聚集而沉淀。
由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同,从而使之从其他蛋白中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏,导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
由于清蛋白的亲水性比球蛋白大,且清蛋白的分子比球蛋白小,所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析,低浓度的时候球蛋白发生盐析。
盐析法分离蛋白质:各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同,盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀,从而达到分离的目的。
常用中性盐:硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵:温度系数小,溶解度大,蛋白谱广,盐析效果好,不易引起变性。
可用硫酸/氨水按需要调节pH值。
本实验中清蛋白分子小,亲水性强,在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出,而球蛋白分子大,亲水性弱,在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
For personal use only in study and research; not for commercial use生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理:1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。
3、盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
5、醋酸纤维素薄膜电泳原理:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料:人混合血清葡聚糖凝胶(G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸1%BaCl溶液氨基黑染色液2漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程:盐析(粗分离)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→DEAE纤维素离子交换层析(纯化)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴定)实验步骤:(一)盐析+凝胶柱层析除盐:(二)离子交换层析(纯化):(三)醋酸纤维素薄膜电泳:1、点样(如下图):-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳:①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上,膜应轻轻拉平电压:110V时间:50min3、染色和漂洗:电泳完毕后,关闭电源,将膜取出,直接浸于染色液中5min。
Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化一、引言血清γ球蛋白是一种重要的血清蛋白质,在免疫系统中发挥关键作用。
其具有调节免疫反应、保护机体免受感染和疾病侵害的功能。
通过分离和纯化血清γ球蛋白,我们可以更好地理解其生物学特性,探究其在各种疾病中的变化,为临床诊断和治疗提供帮助。
二、材料与方法1.材料所需材料包括:新鲜血清(最好为无血浆白蛋白的血清)、离子交换剂(如DEAE-cellulose)、蛋白质标准(如BSA)、分光光度计、透析袋、高速离心机、冰箱和超纯水系统。
2.方法(1)血清预处理:将新鲜血清放入冰箱冷藏,去除其中的纤维蛋白原等杂质。
(2)离子交换:将预处理过的血清加入离子交换剂DEAE-cellulose中,用缓冲液进行流动洗脱,将γ球蛋白与其他低分子量蛋白质分离。
(3)透析:将离子交换步骤得到的γ球蛋白溶液放入透析袋中,置于超纯水中进行透析,去除离子和盐类杂质。
(4)高速离心:将透析后的γ球蛋白溶液放入高速离心机中,进行高速离心,以进一步去除残留的杂质。
(5)纯度检测:利用分光光度计检测离心后的γ球蛋白溶液的纯度。
若纯度不达标,重复上述步骤进行再次纯化。
三、结果与分析通过上述步骤,我们可以成功地分离并纯化出血清γ球蛋白。
表1显示了纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性。
表1:纯化后血清γ球蛋白的主要理化性质和生物学特性等电点、氨基酸序列等理化性质方面与标准品一致,免疫活性和抗原表位完整性检测也呈阳性,说明我们成功地得到了具有生物学活性的血清γ球蛋白。
四、讨论与展望本次实验成功地分离和纯化了血清γ球蛋白,为进一步研究其生物学特性和应用奠定了基础。
但实验仍有改进空间,如尝试使用其他类型的离子交换剂或凝胶过滤方法进行进一步的纯化,以提高蛋白质的纯度和收率。
未来研究可以探索优化实验条件,提高血清γ球蛋白的纯度和产量,以便更好地应用于临床研究和治疗中。
五、结论通过离子交换和透析等步骤,我们成功地分离和纯化了血清γ球蛋白,并验证了其理化性质和生物学活性。