关于微生物保藏的说明（专利合作条约实施细则13之2）
PCT/RO/134表（1998年7月，2004年1月再版）
中国典型培养物保藏中心（中国最大的培养物保藏中心） 中国典型培养物保藏中心受理以下各类培养物（生物材料/菌种）的专利保藏： 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、高等真菌、单细胞藻类、动物细胞系、植物组织培养、原生动物、地衣、病毒(包括动植物病毒、噬菌体)、质粒、基因片段、基因文库、植物种子、其它生物材料（最高物理防范等级不超过P2级）以及生物材料的混合培养物。 除人和动物的一、二类病源菌以外的培养物（生物材料），根据一般原则，保藏中心仅受理现行的技术条件下长期保存时，其性状不发生明显变异的培养物。对一些较为特殊的生物材料，如必须保持其处于生命活动状态，可依据具体情况加以受理，但应事先协商。 保藏各类专利培养物（生物材料/菌种）及其应提交样品的数量 1．细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、高等真菌、单细胞藻类-----5安瓿管/株 2．动物细胞系、植物组织培养、原生动物、地衣、病毒(包括动植物病毒、噬菌体)质粒、基因片段、基因文库-----10安瓿管/株 3．植物种子-----2000粒/份 4．其它生物材料-----适量数 国内申请人 1．申请人或其代理人从CCTCC索取或从CCTCC网页上下载"用于专利程序的培养物保藏登记表"，逐栏填写、签名或加盖公章； 2．申请人在专利申请日前或最迟在申请日将要保藏的培养物按规定的数量与保藏登记表直接送交或寄至CCTCC；微生物菌株、质粒、噬菌体等样品可通过特快专递(EMS)寄送，细胞系和动植物病毒等样品需在冷冻条件下寄送，在寄送包装箱内放入适量的干冰，以保证CCTCC 收到样品时仍保持冷冻状态； 3．收到样品后，本中心将及时通知申请人或其代理人，告知收到样品的状况；同时，按照申请人提供的培养条件及时进行存活性检测，并妥善保藏； 4．申请人按有关规定缴纳专利培养物保藏和存活性检测等费用； 5．CCTCC向专利申请人或其代理人出据该培养物保藏受理通知书(存活报告)。根据布达佩斯条约，专利申请人如需IDA保藏证明，CCTCC可及时出据该证明。 国外专利申请人 1．我国涉外专利代理机构收到国外申请人的专利请求书后及时与CCTCC联系，CCTCC将根据我国的有关规定向国家相关主管部门申请培养物入境许可； 2．CCTCC收到入境许可的批文后及时通知涉外专利代理机构，由涉外代理机构通知国外申请人直接将专利培养物寄送至CCTCC； 3．普通样品，国外申请人或其代理人可通过特快专递将样品直接寄至CCTCC。需冷冻寄送的样品，国外申请人或其代理人应提前两天将运寄培养物的货运号(或运单号)、航班号、抵达中国境内机场及日期等通知CCTCC； 4．CCTCC收到培养物后，将收到样品的状况通知其国内专利代理人；同时，及时进行存活检测，并妥善保藏；
微生物资源的开发与利用
微生物资源的开发与利用 摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。 关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用 1.引言 当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。 生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。 微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端 环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。 2.微生物资源 2.1微生物资源的特点 环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种
不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) , 对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。 微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。 相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。 微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。 微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌 目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。 尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实
微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心，武汉大学 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心，华中农业大学 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学 CUHK 香港中文大学保藏中心，香港中文大学 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹 国外 ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入
菌种保藏中心名称 简介 ATCC (American Type Culture Collection ） 美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免 疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏 方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研 究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865 株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center) 日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC （IFO ）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农 业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研 究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保 藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 NRRL 是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微 生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。 该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株， 酵母14500株，放线菌9500株。 另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定 服务。 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 CBS 是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。 该中心主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。 该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。该中心保藏的菌种可出售。
毕业论文(设计)任务书 课题名称生物杀菌素在食品防腐中的应用研究进展 所在系食品系 专业班级发检04-1 学号0 姓名裴蕾 年月日至年月日共周 指导教师签字 系主任签 字 年月日 一、毕业论文（设计）的内容 文章阐述生物杀菌素的基本概念及特点，生物杀菌素在食品防腐中的应用研究概况, 并对生物杀菌素的发展趋势进行展望。 二、毕业论文（设计）的要求与数据 收集生物杀菌素相关资料，论文书写有明确的中心，论述充分并有一定的逻辑性，重点突出，内容应充实完整，格式规范。 三、毕业论文（设计）应完成的工作 1. 文献浏览 2. 确定提纲 3. 撰写初稿 4. 修改定稿
查阅中国期刊网、万方数据库、超星数据库中的相关文献，并参考其他网络资源和图书等纸质资源。 摘要:生物防腐剂是一类新型的安全高效的天然防腐剂，该文阐述生物杀菌素的特点及在食品防腐中应用研究，并介绍了几种主要的生物防腐剂在食品工业中生物杀菌素发展趋势进行展望。 关键词:生物杀菌素;生物防腐剂；食品防腐;食品安全；应用；动向Abstraet:Biological preservation have the natural secure and highly efficient natures. The character and the application of microbial to food preservation are introduced,and introduction about the application of main kinds of biological preservatives and
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
微生物资源的开发与利用 摘要：微生物资源的开发利用前景将会在解决人类社会面临的人口剧增、资源匮乏、环境恶化问题和实现可持续发展等方面发挥不可替代的作用。本文综述了微生物资源以及其开发利用过程这两个方面。 关键词：微生物资源，放线菌，开发，利用 1.引言 当今，人类的工业是建立在化石能源基础之上的，而其特点必然要导致大量不可再生资源的消耗，大量温室气体的排放以及伴随着生态环境的破坏。导致人类社会面临着人口剧增、资源匮乏、能源危机、环境恶化等一系列问题，而人类又要求不停的发展，解决这些问题的关键在于寻求一条可持续发展的道路。 生物技术正在推动着以化石能源为基础的经济向以知识经济、循环经济为主的经济结构转型，是实现人类可持续发展的关键技术。因此大力发展生物技术对经济的发展以及人类社会的发展有着巨大而深远的影响，而作为生物技术的核心技术，微生物工程技术的发展将要涉及到微生物资源的开发与利用问题[1]。 微生物资源利用的核心是在于利用其产生的生物活性物质，目前，微生物活性物质绝大部分来源于普通环境中的微生物，因此从普通环境微生物中寻找新的活性物质难度越来越大。新的基因有很大的可能产生新的生物活性物质，因此通过寻找新的基因来寻找新的生物活性物质。基于该思路，稀有放线菌、海洋微生物、极端环境微生物等过去很少触及的微生物资源已越来越受重视[2]。 2.微生物资源 2.1微生物资源的特点 环境中存在着大量的微生物, 据估计, 每克土壤样品中可含有高达1000种不同的微生物[3], 这些微生物产生多种多样的活性物质(包括酶与次生代谢产物两部分) ,
对人类有实用意义的抗生素—青霉素、链霉素、抓霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉家、万古霉素、庆大霉素等都是从微生物中发现并开发出来的; 基因工程中各种工具酶几乎都来自多种不同的微生物[4] 微生物是一类物种丰富的生物资源和基因资源，迄今为止我们所分离到的微生物主要有：真菌70000多种、细菌5000多种、放线菌3000多种。而这些人类所知道的微生物估计仅占自然界存在的微生物不到10%，而被利用的还不到1%。 微生物具有很快的生长繁殖速度，有的细菌的时代时间仅仅20分钟，而且微生物可以再人工控制的条件下大规模培养，并且几乎不受地域、气候等条件的影响。 相比于动、植物品种遗传基因结构，微生物的基因组小得多，基因拷贝数比较少，比较容易进行基因操作，微生物改良易于操作，改造性能、提高产率相对容易。 微生物资源丰富，微生物资源的开发与利用不会导致微生物物种的减少和环境的破坏。部分动植物资源的不合理开发利用导致物种的减少甚至灭绝，造成严重的环境的恶化和污染问题，而微生物资源的开发利用不会存在此类问题。但我们必须注意到并引起重视的现实问题是由于环境的改变和恶化，如原始森林开发成旅游区等现象，造成的天然微生物的破坏，使得许多在该类环境中赖以生存的微生物在人类还没有认识它之前就悄悄灭绝了[1]。 微生物资源是新抗菌剂的主要来源之一,然而即使采用先进的方法, 绝大部分微生物也仍然不可培养、只能用分子指纹图谱来描述[5]。 2.2稀有放线菌 目前大部分生物活性物质来自链霉菌，所以从链霉菌中发现性的活性物质的几率已经大大降低。自20世纪50年代以来, 已从部分稀有放线菌代谢产物中得到许多已经临床应用的重要活性物质, 如红霉素B、利福霉素、庆大霉素、其它放线菌素类、安莎类、肽类、酶抑制剂等活性物质。 尽管新的种、属不断被发现, 但据估计, 目前分离到的放线菌种类, 仅为实际存在种类的0.1%~1%。因此, 放线菌还有极其丰富多样的未知种群等待人们去发现 [6]。如日本Takahashi 等[7] 报道, 从不同的环境, 利用特殊的分离方法分离到放线 菌的新种、新属,并从这些放线菌发酵产物中得到许多新结构的活性物质。
微生物菌种保藏方法 1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如： ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。
方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 4、注意事项： 1）冷空气彻底排除；2）加水；3）压力降为“0”时方可打开。 常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。 煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间10－15min， 超高温杀菌:135-150°C和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点：保持食品价值和营养
实验十 微生物菌种保藏方法 [日期：2009- 5-30]来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏
5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。
微生物菌种保藏注意事项 摘要：一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。保藏时，一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)，创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到方法经济、简便。由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。 菌种保藏要获得较好的效果，需注意如下三个方面： 1、菌种在保藏前所处的状态 绝大多数微生物的菌种均保藏其休眠体，如孢子或芽孢。保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物。菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量。培养时间过短，保存时容易死亡；培养时间长，生产性能衰退。一般以稍低于最适生长温度下培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。 2、菌种保藏所用的基质
斜面低温保藏所用的培养基，碳源比例应少些，营养成分贫乏些较好，否则易产生酸，或使代谢活动增强，影响保藏时间。砂土管保藏需将砂和土充分洗净，以防其中含有过多的有机物，影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质。冷冻干燥所用的保护剂，有不少经过加热就会分解或变性的物质，如还原糖和脱脂乳，过度加热往往形成有毒物质，灭菌时应特别注意。 3、操作过程对细胞结构的损害 冷冻干燥时，冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶，对细胞结构造成机械损伤。真空干燥程度也将影响细胞结构，加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏。细胞结构的损伤不仅使菌种保藏的死亡率增加，而且容易导致菌种变异，造成菌种性能衰退。
第八章微生物与食品腐败变质 第一节食品的微生物污染及其控制 一、微生物污染食品的来源和途径 （一）食品污染的种类： 生物污染：微生物、寄生虫及虫卵、昆虫 化学污染：农药、工业三废、添加剂、包装材料 物理污染：放射性污染 （二）微生物污染食品的途径： 水的污染：水是作为媒介使微生物污染食品的 土壤的污染：加工的原料在采收时携带了微生物引的 空气的污染：食品暴露在空气中被微生物污染 人为的污染：人接触食品、工作衣帽不清洁等 食品加工用设备、容器、工具的污染：运输工具、生产 二、控制微生物污染的措施 控制食品因微生物的污染而造成的腐败变质，首先应掐断微生物的污染源，其次是抑制微生物的生长繁殖。具体要求如下：
第二节微生物引起食品腐败变质的原理 ?食品中碳水化合物的分解 ?食品中蛋白质的分解 ?食品中脂肪的分解 ?有害物质的形成 第三节微生物引起食品腐败变质的环境条件 一、食品基质条件 食品的营养成分食品的水分食品中的氢离子浓度 1.食品的营养成分 食品的营养成分与微生物生长的适应性 食品的主要营养成分是蛋白质、碳水化合物和脂肪。不同的微生物对它们的利用能力是不同的。 分解蛋白质的微生物： 细菌：芽孢菌属、假单胞菌属 霉菌：毛霉属、根霉属等 分解碳水化合物的微生物：
细菌：芽孢杆菌属 霉菌：曲霉属、根霉属等 分解脂肪的微生物： 细菌：荧光假单胞菌的分解能力较强 酵母：解脂假丝酵母具有一定的脂肪分解能力 霉菌：大部分霉菌具有一定的脂肪分解能力。 2.食品的水分 微生物生长需要水分，水分在某些极限以下时微生物则无法生长。乳粉含水量低于5%时，在密封状态下，不会引起微生物的生长发育。 微生物对水的需求中，影响最大的是水的可利用性，常用水分活度Aw表示 水分活性值（Aw）的概念：食品在密闭容器内的水蒸气压与在相同温度小纯水蒸汽压之比值，食品的Aw值范围为：0≦ Aw≦1 不同类群微生物生长的Aw值 微生物生长Aw值的可变性 3.食品中的氢离子浓度 每一种微生物生长繁殖都有一定的pH值范围：超过该范围，生长就会受到抑制，甚至导致死亡。大部分细菌的生长最适pH值为5.6~7.5。乳酸菌、霉菌酵母在微酸性条件下生长。大肠菌、蛋白分解菌在碱性环境中易生长，酸性条件下则受到抑制。 根据食品经代谢后产生的矿物质残渣或灰分呈酸性、碱性或中性反应可以将食品分为： 酸性食品与非酸性食品：pH值在4.5以上者为非酸性食品（动物性食品和大多数蔬菜）； pH 值在4.5以下者为酸性食品（水果和少数蔬菜） 微生物生长与食品pH值的关系：非酸性食品适宜细菌生长；酸性食品中，酵菌、霉菌和少数耐酸细菌（如大肠菌群）可生长。 二、食品的外界环境条件 1.温度
食品微生物学经典试题及答案 单项选择题: 1、下列是原核微生物的是(细菌。 2、第一个发现微生物的是(列文虎克 3、微生物学发展的第二时期,是(巴斯德、科赫奠定了基础。 4、荚膜的主要成分是(糖类。 5、测量细菌的大小用(微米。 6、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 7、培养酵母用(麦芽糖琼脂。 8、一般培养基灭菌的条件是(121°C 15分。 9、放线菌的菌落特征是(干燥、多皱。 10、酵母的无性繁殖主要是(芽殖。 11、霉菌的主要繁殖方式是 (孢子生殖。 12、曲霉孢子是 (外生孢子。 13、霉菌菌落比酵母的要 (大。 14、哪些对病毒的描述是错的(对抗生素敏感。 15、病毒具有(一种核酸。 16、噬菌体可用于(诊断和治疗。 17、能够使细菌和放线菌裂解的是 (裂性噬菌体。 18、可用于细菌鉴定和分型的是 (噬菌体。 19、细菌总数测定的是(全部活细菌数。 20、大肠菌群数量测定的(100 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 21、测定大肠菌群数量的方法,选用的是(37 °C 22、培养酵母菌的温度常选(28 °C 23、配制固体培养基加琼脂量是(2 %。 24、完整测定大肠菌群时间是(72 小时。 25、肉毒杆菌释放的是(外毒素。 26、对面包黏丝病有抑制作用的是(丙酸钙 27、果汁,果酒一般可用(亚硫酸钠防腐。 28、饮料常用防腐剂是(苯甲酸钠。 29、最常用的食品杀菌方法是(巴氏杀菌。 30、同样百分浓度蔗糖的渗透性比食盐(差 10% 。 31、 GMP 是(良好生产规范。 32、属于厌氧微生物的是(肉毒杆菌。
33、酒精消毒的最佳浓度是(75 %。 34、下列是非细胞结构微生物的是(病毒。 35、第一个用固体培养基的是(科赫。 36、芽孢抗热的主要成分是(DPA 。 37、测量细菌的大小用(微米。 38、细胞壁的主要成分是(肽聚糖。 39、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 40、酵母菌的菌落特征是(粘稠、较大。 41、病毒的繁殖主要是(孢子生殖。 42、霉菌的主要繁殖方式是(孢子生殖。 43、青霉孢子是(外生孢子。 44、哪些对病毒的描述是错的(个体极小。 45、病毒具有(二种核酸。 46、噬菌体可用于(鉴定细菌。 47、能够使细菌和放线菌裂解的是(裂性噬菌体。 48、可用于细菌鉴定和分型的是(假根。 49、细菌总数测定的是(醋酸菌。 50、大肠菌群数量测定的是每(1 毫升或克食品检样的大肠菌群最近似的值。 51、制作半固体培养基时加琼脂量是(5 %。 52、完整的大肠菌群测定时间是(一天小时。 53、金黄色葡萄球菌释放的是(外毒素。 54、对面包黏丝病有抑制作用的是(苯甲酸钠 55、果汁,果酒一般可用(山梨酸钾防腐。 56、微生物在生物世界分类系统中占有(4 界。 57、列是原核微生物的是(放线菌。 58、第一个使用琼脂的科学家是(科赫。 59、鞭毛的主要成分是(蛋白质。 60、测量细菌的大小用(微米。 61、芽孢能够抵抗不良环境的主要成分是(DPA 62、荚膜的主要成分是(多糖。
微生物类专利申请指南 第一：专利申请之前,该菌基因序列不能上传到NCBI上得到登录号。在专利申请之后才可获得登录号 第二：细则25(3) 对于涉及公众不能得到的生物材料的专利申请，应当在请求书和说明书中均写明生物材料的分类命名、拉丁文学名、保藏该生物材料样品的单位名称、地址、保藏日期和保藏编号。在说明书中第一次提及该生物材料时，除描述该生物材料的分类命名、拉丁文学名以外，还应当写明其保藏日期、保藏该生物材料样品的保藏单位全称及简称和保藏编号；此外，还应当将该生物材料的保藏日期、保藏单位全称及简称和保藏编号作为说明书的一个部分集中写在相当于附图说明的位置。如果申请人按时提交了符合专利法实施细则第二十五条规定的请求书、保藏证明和存活证明，但未在说明书中写明与保藏有关的信息，允许申请人在实质审查阶段根据请求书的内容将相关信息补充到说明书中。 (2) 专利法实施细则第二十五条中所说的“公众不能得到的生物材料”包括：个人或单位拥有的、由非专利程序的保藏机构保藏并对公众不公开发放的生物材料；或者虽然在说明书中描述了制备该生物材料的方法，但是本领域技术人员不能重复该方法而获得所述的生物材料，例如通过不能再现的筛选、突变等手段新创制的微生物菌种。这样的生物材料均要求按照规定进行保藏。 以下情况被认为是公众可以得到、而不要求进行保藏： 1，公众能从国内外商业渠道买到的生物材料，应当在说明书中注明购买的渠道，必要时，应提供申请日(有优先权的，指优先权日)前公众可以购买得到该生物 材料的证据； 2，在各国专利局或国际专利组织承认的用于专利程序的保藏机构保藏的，并且在向我国提交的专利申请的申请日(有优先权的，指优先权日)前已在专利公报中公布或 已授权的生物材料； 3，专利申请中必须使用的生物材料在申请日(有优先权的，指优先权日)前已在非专利文献中公开的，应当在说明书中注明了文献的出处，说明了公众获得该生物材 料的途径，并由专利申请人提供了保证从申请日起二十年内向公众发放生物材料的 证明。 (3) 在国家知识产权局认可的机构内保藏的生物材料，应当由该单位确认生物材料的生存状况，如果确认生物材料已经死亡、污染、失活或变异的，申请人必须将与原来保藏的样品相同的生物材料和原始样品同时保藏，并将此事呈报专利局，即可认为后来的保藏是原来保藏的继续。 (4) 国家知识产权局认可的保藏单位是指布达佩斯条约承认的生物材料样品国际保藏单位，其中包括位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）和位于武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）：010-6480 7355 武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）：陈向东 027-6875 2056,中心电话：027-6875 2319 联系邮件： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
第14 章微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中，用先进的DNA 重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此，世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30 年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC 在1985 年第16 版《细菌、噬菌体和rDNA 载体目录册》及1987 年第17 版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000 株细菌、噬菌体和rDNA 载体及 21 000 株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna 等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜 170 遗传多样性研究的原理与方法 1981；Jong 等 1987）。冻干法是长期保存细菌、酵母、真菌、病毒和立克次氏体的标准方法 （Franks 1985；Berny 等 1991；Smith1993；Day，Mclellan 1995）：将在理想条件下生长 的健康的微生物细胞以相当高的浓度（106～107 个细胞／ml）分装在小灭菌瓶或安瓿内，迅速 将这些小瓶在极低温度的液体溶剂内水浴或用仪器超低温冷冻（－60℃），再用真空泵除去这 些冷冻悬浮液中的水分，在真空状态下用空气喷灯熔解小瓶顶部的玻璃进行热封口，然后贮存于低于5℃的冰箱内。保存温度低（－3 0～－7 0℃）可以延长其活力。当微生物浓度较