实验六植物病毒病及其传染方式
一、实验目的
认识植物病毒形态和病毒病主要症状类型，通过植物组织汁液的摩擦接种和蚜虫传播试验了解病毒病的主要传染方式。
二、讲解要点
1．病毒颗粒很小，必须用电子显微镜才能观察到。植物病毒颗粒可以分为圆球状（或等边多面体）、炮弹状、长杆状和线条状4种。这些在课堂和本次实验课上只能通过观看电镜照片或幻灯片来了解。
2．植物病毒病的主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑坏死、畸形。应该注意：一方面这些症状类型的分辨在病毒病鉴定上具有比起它病害更重要的意义，另一方面在实际观察中，也会发现同一种病毒病在发病过程中或在不同环境条件下会有不同的表现（不同病状甚至隐症）。
3．病毒病多为系统性侵染，没有病征，易与非侵染性病害相混淆，往往需要通过一定方式的传染试验证实其传染性。植物病毒病的传染方式有：机械（摩擦）接触传染、嫁接传染、介体（包括昆虫、线虫、真菌、螨类和菟丝子）传染、花粉及种子传染等。由于病毒是专性寄生物，它的侵染来源都与活体（活的动、植物体或介体）有关，传染要使病毒接触活体。例如汁液摩擦接种，要用新鲜的病毒汁液，摩擦的目的是造成寄主植物体表面的微伤，使病毒有可能进入活的细胞，过重的损伤造成组织坏死并不利于病毒的传染。蚜虫、飞虱等刺吸式口器昆虫取食植物汁液的方式更容易满足植物病毒传播的两方面要求。
4．大白菜病毒病的症状为幼苗受侵后首先心叶出现明脉即沿叶脉失绿，继呈花叶及皱缩。成株被害，出现不同程度的叶片皱缩、变硬而脆，后期出现褐色斑点或褐色坏死条纹；植株矮化。我国十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒（简称TuMV）、黄瓜花叶病毒（简称CMV）和烟草花叶病毒（简称TMV）所致，前两种病毒能由蚜虫和汁液传染，第三种只能以汁液传染。
马铃薯病毒病主要是皱缩花叶病和卷叶病两种。前者的症状为叶片皱缩、变小；叶尖向下弯曲，全株矮化，叶片色泽深浅不均，以后出现黑褐色坏死斑，质地变脆，严重时全株发生坏死性叶斑，自下而上枯死。马铃薯皱缩花叶病是由马铃薯X病毒（简称PVX）和马铃薯Y 病毒（简称PVY）两种病毒复合侵染引起的。PVX只能由汁液传染，昆虫不传染。PVY的传染方式有汁液与蚜虫传染。马铃薯卷叶病的症状为叶缘向上卷曲，病重时呈圆筒状。叶片色泽较浅，有时叶背面呈红色或紫色。叶片变厚变脆，病叶不出现萎蔫下垂的现象，矮化亦
不甚明显。其病原物是马铃薯卷叶病毒（简称PLRV），只能由蚜虫传染，而汁液接触无传毒效果。
三、实验材料及用具
1．病毒颗粒的电镜照片或幻灯片、病毒病各类症状的照片或幻灯片。
2．毒源：温室种植或田间采到的大白菜病毒病植株，或由带毒的马铃薯块茎培育的幼苗和田间病株。
3．在隔离的病毒温室或防虫纱笼内培育的无毒健壮苗：1～4片真叶的大白菜幼苗（品种如小白口）或3～4片真叶的普通烟草及心叶烟幼苗，4片真叶的千日红幼苗或4片真叶的洋酸浆幼苗。
4．传毒介体昆虫：室内防虫笼内饲养的无毒桃蚜（无翅蚜）。
5．磷酸缓冲液，配方为：KH2PO4 5.445g NaHPO4·12H2O 21.49g 蒸馏水1000mL。配制方法为两种药品分别溶于水后，加足水量混和。
6．磷酸皂制备，配方为：洗衣肥皂20份，Na3PO4 5份，水100份。制备方法为，先将洗衣皂切成薄片，溶解在沸水中，然后加入磷酸钠，全部溶解搅匀呈糊状，放在定型容器内使其自然干固备用。
7．病毒试验温室及防虫笼病毒试验温室一般都有隔离条件较好的小房间，通气窗要安装40筛目纱网，工作人员进出都要注意不能带进昆虫。养虫笼和防虫笼往往是同一设备，为方形或圆筒形框架上复以40筛目纱网，或在侧面或在顶部设开口，装上袖套以便操作。
8．其他：400～600筛目金刚砂，放在带网口的瓶中或纱布袋内、研钵、剪子或刀片、纱布、洗瓶、毛笔、培养皿、蒸馏水、40%乐果乳剂。
四、实验步骤
1、观察照片或幻灯片、病害标本，认识病毒形态及病毒病症状的主要类型。
2、病毒汁液磨擦接种
（1）取大白菜病毒病症状典型的病叶（或马铃薯病毒病叶片）去掉大的叶脉，剪碎置于研钵中，加适量的磷酸缓冲液，研磨成泥浆状，用双层纱布滤出汁液，作为接种用病毒汁液。
（2）用磷酸皂洗手并用清水冲净，取健康的大白菜幼苗及千日红幼苗（或洋酸浆幼苗及心叶或普通烟幼苗，作马铃薯病毒病传染试验用），作好标记，在每株上选已展开的生长正常
的两片叶，先在叶正面撒少许金刚砂，左手托叶背，右手食指沾病毒汁液在叶面轻轻往返磨擦4次，立即用洗瓶内的清水冲洗。
（3）用磷酸肥皂洗手并用清水冲洗，按与（2）相同的程序进行，只是手指不沾病毒汁液而只是沾磷酸缓冲液磨擦叶面，作为未擦病毒的对照。
（4）将处理过的幼苗移入无虫的温室内培育，经过4-7天和2-3星期后观察发病情况并分析结果。
3、蚜虫传毒实验
（1）用毛笔取无毒桃蚜50-100头，放在干燥的培养皿内，饥饿2小时后，再移到大白菜病毒病株（或马铃薯病毒病侏）上，饲毒24小时。
（2）将饲过毒的桃蚜移到防虫笼中的5株健康的大白菜苗和5株千日红苗（或同样数目的洋酸浆苗和心叶烟或普通烟苗）上，每株5-10头，饲食24小时后喷2000倍40%乐果乳油杀死蚜虫。
（3）取50-100头无病桃蚜，在干燥的培养皿中饥饿24小时后，移到5株健康的大白菜苗和5株千日红苗（或同样数目的洋酸浆苗和心叶烟或普通烟苗）上，每株也是5-10头，饲食24小时后喷2000倍40%乐果乳油杀死蚜虫，以此作为对照处理。
（4）经过上述处理的幼苗，置温室内培育2-3周后观察发病情况。
五、作业
1、参阅教材及有关资料，分析毒源可能含有何种病毒，能以何种方式传染。
2、回答下列问题：
（1）为什么要在试验中安排仅用磷酸缓冲液或无毒蚜虫的处理。
（2）千日红、心叶烟或普通烟草幼苗的发病情况在分析中有什么意义。
3、总结传染试验成功或失败的经验。
植物病毒病的有效防治方法 现在病毒病的危害有日益严重的趋势，发病病毒种类越来越多，常见到的有厥叶病毒，花叶病毒，条斑病毒，银叶病毒，黄化病毒，等几十种，而且混发的现象日趋严重。当前如何解决植物病毒病，是目前农业生产中非常紧迫的问题。植物病毒病的解决也是农民增产增收的保证。 一、病毒病的发病原因 （1）传染源 （2）传媒 （3）高温 （4）干旱 （5）光照过强 （6）品种本身的原因 二、预防措施 （1）切断传染源，措施：种子消毒，接种抗毒免疫剂。选择无毒种苗。利用茎尖脱毒克隆方法繁育种苗。 （2）消灭传媒，做好蚜虫，白粉虱等害虫的防治工作。 （3）尽量控制好温度，最高温度应控制在32度以下，如温度过高，就要采取措施，地面要经常浇小水，叶面多喷喷抗毒免疫剂或灌根。 （4）避免干旱，小水勤浇。要控制合适的湿度。 （5）夏天光照强时要进行适当遮光。 （6）增喷抗毒免疫剂，中药及生物的为最好。 （7）选育抗病毒品种 （8）改进栽培措施，选择先进的有机栽培模式。增强本身抗病毒能力。 三、治疗措施
（1）种子用脱毒剂进行处理，磷酸三钠10倍浸泡10分钟，或高猛酸钾100倍浸泡，或抗毒免疫剂100倍浸种10分钟，冲洗干净后播种或催芽。 （2）用无毒无菌无虫卵基质育苗。 (3)要尽量用有机栽培模式，利于根系发育，提高本身抗病毒能力 (4)出苗后接种抗病毒疫苗三次以上。 (5)移栽后定期喷洒抗病毒疫苗或制剂。 (6)冲施肥要以天然有机肥为主，用生物发酵好的肥料，厌氧菌或放线菌类有益防腐微生物为最好，养根壮根，提高产量的同时提高其抗病毒能力。 关于植物病毒病 植物病毒对寄主的危害，素有“植物癌症”之称，防治上十分困难。病毒在侵染寄主后，不仅与寄主争夺生长所必需的营养成分，而且破坏植物的养分输导，改变寄主植物的某些代谢平衡，使植物的光合作用受到抑制，致使植物生长困难，产生畸形、黄化等症状，严重的造成寄主植物死亡。为了有效地控制植物病毒病，人们采用了各种措施，包括轮作、种子脱毒、病毒间的弱毒株系交叉保护、抗病品种的选用、传毒介体的控制及化学农药的使用等，近年来转基因植物抗病研究也有了新的进展。但这些措施还不能有效克服病毒的危害，且化学农药的使用对环境造成了很大危害，在当前大力提倡绿色食品和环境保护的前提下，加强植物病害的综合防治和减少化学农药的使用已成为植保工作者工作的重点内容之一。为了能开发出有效控制病毒且不会造成环境污染的抗病毒药剂，研究人员不断寻找和筛选天然的生物源抗病毒物质。目前，国内外已报道的天然抗病毒活性物质种类很多，有的已形成产品，在农业生产中发挥着重要作用。 一、改变耕作制度，加强栽培管理，预防植物病毒病的发生和流行 1．轮作套种采用不同作物和品种的轮作和套种，可以减少病原积累，防止病害严重发生。 2．选择适宜播种期播种期的选择对病毒病的发生也有很大影响。 3．加强苗期管理苗床和苗期的管理对预防和控制病毒病的发生十分重要，因为苗床上的病株，可能成为大田发病的重要毒源。因此，要尽力保证幼苗不生病或少生病，加强田间栽培管理，提高植物抗病毒病的能力，铲除田间地头杂草，拔除病株以除掉毒源，及时治虫防病，也能减轻病害。 二、种植抗、耐病品种 采用抗病和耐病品种可以经济有效地防治和减轻病毒病的发生。多数抗病品种可以抵抗病毒复制和扩散，有些蔬菜可以抗传毒介体。
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
高级植物病毒学
高级植物病毒学 第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。
植物病害研究法 1.列举五个你熟悉的中英文文献检索数据库。 中文：维普、万方、CNKI三大期刊知识库，超星、书生之家书籍库。 英文：Pubmed、SD、EBSCO、Springer、NPG、Ei Village、CAS、Kluwer、ProQuest、Ovid。 2.谈谈如何做好文献检索工作。 （1）根据题目确定关键词，随着对题目的深入了解，增加关键词，保证文章的查全率。 （2）选择合适的数据库，常用的中文数据库有……英文数据库有…… （3）使用相应的检索技术，如布尔逻辑算符、位臵检索、截词、优先算符等，来提高检索的效率，另外，需要注意of、the、in、she、he、to be、as、because、if、when等为禁用词，在检索时自动忽略。 （4）将检索到的文献进行筛选和归类：分精读与速读两类；只保留重要的资料；精细分类，并录入数据库。 （5）科学合理使用文件管理软件，如Endnote和Reference Manage。 （6）学会走进文献、走出文献，从文献中发现Idea。 3.谈谈文献检索工作对科研工作者的重要性。 第一，有助于利用和掌握文献资料，缩短查找文献资料所花费的时间。在科学研究活动中，搜集、掌握足够的文献资料是研究工作的重要组成部分，往往要耗费较多的时间，而文献数量的成倍增长，各学科的相互渗透导致的文献交叉与分散化，使查找所需文献更加固难。在这种情况下，文献检索的功能和作用，恰恰能解决众多繁杂的文献与研究者特定需要之间的矛盾，能帮助研究者从浩如烟海的文献中迅速、准确地查找出所需专用文献，达到节省时间和精力的目的。 第二，有助于获取最新知识，及时了解研究课题内容所涉及的专业和相关学科的发展动态，指导课题研究的顺利进行。 第三，有助于开阔视野，扩大知识面，借鉴他人之法，指引治学门径，解决研究过程中的疑难问题。通过文献检索，不仅能够较快地获得所必须了解和掌握的知识，获得大量的情报信息，而且还能够比较有关文献的异同优劣，明确学术源流，达到正确鉴别、准确选择所需文献资料的目的。 第四，科学研究是文献检索的主要动机和目的。科学研究工作是探求客观事物的本质规律的活动，是人类能动地认识和改造世界的过程，科学研究一开始就包括了文献检索的环节在内，就要求通过文献检索方法和手段获取所需的情报信息。从科学研究的具体过程讲，要使研究工作取得有创造性价值的成果和有突破性的重大进展，就不能不通过文献检索，了解、掌握前人和今人在某一领域内所进行的探索、所取得的成果和所发生的失误。 4.谈谈你对科技论文写作的认识。 科技论文是科学技术人员或其他研究人员在科学实验（或试验）的基础上，对自然科学、工程技术科学、以及人文艺术研究领域的现象（或问题）进行科学分析、综合的研究和阐述，进一步的进行一些现象和问题的研究，总结和创新另外一些结果和结论，并按照各个科技期刊的要求进行电子和书面的表达。 在进行植物病毒提纯中，作为病毒繁殖寄主应具备哪些条件条件？ （1）能产生较高浓度的病毒；（2）不含有大量的抑制病毒或不可逆的沉淀病毒的物质，如酚类化合物、有机酸、粘液和胶质等；（3）各种寄主成分的大小和物理性质与病毒粒体显著不同，不影响病毒的分离与提纯，也不吸附在病毒粒体表面；（4）易培养，生长迅速；（5）在温室条件下不感染其他病害，对杀虫剂等不敏感；（6）系统发病；（7）病毒易接种与感染。 5.列出植物病毒提纯的一般程序？ （1）病毒繁殖。作为病毒繁殖寄主应具备以下几个条件：①②③④⑤⑥⑦
高级植物病毒学 第一讲 1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。 2.病毒与其他类似生物的区别： ⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuous bilayer membrane）与寄主细胞的细胞质分开 ②病毒中缺少蛋白质合成的系统。 ③病毒的复制是通过先合成许多组分, 随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virus particle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。 ⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。 ②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值, 然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。 ③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。 ⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别： ①大小: 一些痘病毒（pox virus）比衣原体的原体更大。 ②基因组的性质和大小: 许多病毒有像细胞一样的双链DNA, 并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。 ③DNA 和RNA 的存在 ④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。 ⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellular parasite）如衣原体都不能生长。 ⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。 ⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。 3.专著和刊物 《植物病毒学》《植物病毒研究方法》《植物病毒种类的分子鉴定》《Plant Virology》《微生物学报》《植物保护学报》《植物病理学报》Plant Disease、Phytopathology、Molecular Plant Microbe Interactions、Molecular Plant Pathology、Virus Genes、Archives of Virology、Virus Research、Journal of General Virology 第二讲 1.类病毒：不具病毒粒体，而是裸露的RNA，能侵染细胞，进行自我复制，称为类病毒。 2.卫星核酸：是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸，其核酸序
浅析病毒对人类的利于弊 病毒是自然界中最微小的生物，只有在电子显微镜下才能观察到，经过人类100余年的研究历程，逐步揭示了病毒的特性以及病毒与人类、自然界的相互关系。病毒是一种非细胞生物，它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。一旦进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量进行复制、转录和翻译，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。病毒基因同其他生物的基因一样，也可以发生突变和重组，因此也是可以演化的。由于病毒侵染其他生物具有特异性，因此人们常常根据病毒所侵染的不同寄主对病毒进行分类，按宿主不同可分为动物病毒、植物病毒和微生物病毒。 人们往往谈病毒色变，这不是没有道理的。人类的很多疾病确实就是由病毒引起的，使人和其他生物患病并危及其健康。例如：人类的天花、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、流感等，动物的口蹄疫、狂犬病等，以及植物的烟草花叶病、马铃薯退化病等，给人类带来了巨大的损失和灾难。人们比较熟悉的病毒有人类免疫缺陷病毒（即艾滋病病毒）、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒和流感病毒。艾滋病病毒能够引发艾滋病；单纯性疱疹病毒能够引起唇疱疹、水痘和多发性硬化；而人乳头状瘤病毒则是成年女性宫颈癌的根本诱因；流感病毒则是生活中人们最可能感染的病毒。 病毒可以引发人类社会毁灭性流行病的爆发，它的这种能力已经引起了人们对生物战中病毒武器化的关注。在消灭天花病毒之前的整个历史上，它多次对人类社会造成近乎毁灭性的灾难。根据官方说法，现在世界上仅有两个天花病毒储存中心——俄罗斯向量实验室和美国疾病控制中心。令人担忧的是，天花病毒可能被用作生化武器。更让人忧心的是，天花疫苗具有强烈的副作用，在天花消除之前的最后一年中，因为接种天花疫苗而患上天花的人比因天花病毒感染天花
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
植物病毒能否感染人类？ 随着现代文明生物科技与医学的发展，人类对病害的防治与抵抗力逐渐加强。然而，面对细菌、病毒也随之进化的现状，生物科研人员也开始着力研究探索。由于细菌与病毒具有突变率高的特性，研发出某种药物或是疫苗常常不及微生物的变异，因此，着手微生物的突变方向以及可能危害人类的方式成为了某一种研究方向。 在最近的一篇New Scientist里出现的文章中有个话题：Could a plant virus have found a way to infect humans?在该文中，Raoult提出一个观点：The virus does not infect human cells directly. Instead, the naked viral RNA may alter the function of the cells through a mechanism similar to RNA interference, in which the presence of certain RNA sequences can turn genes on and off.在其中，Raoult并没用详细指明植物病毒的RNA是通过何种机制使人体的基因发生打开或是关闭。究其植物病毒的运行机制，我这里简要介绍一下植物病毒。 植物病毒（viruses of plants）是指感染高等植物、藻类等真核生物的病毒。早在1576年就有关于植物病毒病的记载，举世闻名的、美丽的荷兰杂色郁金香，实际上就是现在所谓郁金香碎色花病毒造成的。 1892年Д．И．伊万诺夫斯基与1898年M．W．拜耶林克证明，烟草花叶病为比细菌还小的病原体所引起，可通过病叶汁液传染。20世纪初，已经知道昆虫能传播植物病毒病，如叶蝉传播水稻矮缩病。1930年，Н.Н.麦金尼和汤清香发现病毒可以变异，产生致病力强弱不等的毒株,而且不同毒株之间有干扰作用。1935年,美国W.M.斯坦利第一次把烟草花叶病毒(TMV)提纯结晶,F.C.鲍登和N.W.皮里进一步证实结晶物为核酸与蛋白质所构成的核蛋白，从而揭露了病毒的本质。1939年首次在电子显微镜下看到 TMV烟草花叶病毒是杆状颗粒。1956年证明TMV的核糖核酸(RNA)能独立侵染烟草,第一次证明RNA也是遗传信息的载体。60年代将TMV外壳蛋白和 TMV的RNA在试管内重组成完整的、有侵染性的TMV颗粒。TMV的外壳蛋白的一级结构是第一个被完全测定的病毒蛋白。利用 TMV第一次证实病毒核酸的突变反映在外壳蛋白的氨基酸序列上。 植物病毒具有以下特点：植物细胞最外层有以纤维素为材料构成的细胞壁，足以抵抗病毒的侵入，因而植物病毒的特点之一是必须通过寄主的伤口方能侵入。实验室内常用摩擦叶面造成轻微伤口来接种某些植物病毒。农田操作、人口移植、摘心、整枝、打杈时手沾染含病毒的汁液，均可造成病毒传染。病毒也可通过嫁接或植物根在土壤砂砾中伸长时所造成的伤口而传染。但在自然界中，植物病毒最重要的传播媒介是节肢动物门中的昆虫(见昆虫纲)和螨类（见蜱螨亚纲）。已知大约有 400种昆虫可传播200种以上的病毒,其中以叶蝉和蚜虫最为主要，仅桃蚜就能传播约70种病毒。某些昆虫传播植物病毒的一个重要特点是：病毒既能在植物体内、也能在昆虫体内繁殖。传播介体除昆虫外，还有真菌、线虫、兔丝子等。植物病毒的另一特点是植物体内没有象高等动物那样的体液免疫和细胞免疫，感染后病毒能在植物体内无限期地存活，直到寄主死亡，或通过营养繁殖体和块茎、块根、蔓藤、枝条等继续传播。除个别的可通过花粉传染（如大麦条纹花叶病毒）外，一般植物病毒很难进入植物茎尖的分生组织，也不能通过种子传播。绝大多数植物病毒是由核酸构成的核心与蛋白质构成的外壳组成的，极少数还含有脂肪和非核酸的碳水化合物。植物病毒核酸类型有 ssRNA （单链RNA）、dsRNA（双链RNA）、ssDNA（单链DNA）和dsDNA（双链DNA）。但绝大多数含ssRNA，无包膜,其外壳蛋白亚基或呈二十面体对称，或呈螺旋式对称排列，形成球状或棒状颗粒（图1）。大多数植物病毒是由单一种外壳蛋白组成形态大小相同的亚基，多个亚基组成外壳。外壳内含有携带其全部基因的病毒核酸。有的植物病毒的核酸分成1～4段，分别
植物病原病毒 一、概述 1. 病毒定义：病毒是一组（一种或一种以上）DNA或RNA核酸分子，包围在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞借助于寄主蛋白合成体系、物质和能量完成复制，伴随核酸突变发生变异的分子寄生物。简单讲，病毒是一类由核酸和蛋白质组成的非细胞状态的分子生物。 主要特征：①结构简单的（核酸+蛋白或脂蛋白衣壳）；②严格专性寄生的（依赖寄主的核酸和蛋白质合成系统）；③非细胞生物（分子寄生物）。 2. 类群：根据病毒的寄主类型，习惯上将病毒划归为下列几大类群 寄生植物的称为植物病毒 寄生动物的称为动物病毒 医学病毒（人类病毒） 真菌病毒 寄生细菌的称为噬菌体（细菌病毒） 二、病毒与人类的关系 有害方面：引起人类疾病（天花、爱滋病、非典型肺炎、肝炎、流感、小儿麻痺等）。 引起畜禽疾病（狂犬病、口蹄疫、猪瘟、牛瘟、鸡瘟、鸭瘟）。 引起植物病害。 有益方面：用作基因工程的载体或元件。 有害生物控制（害虫、真菌及杂草生防）。 环境保护（利用藻类病毒消除水面藻类污染）。 花卉增色（金心黄杨、金边瑞香、杂色郁金香）。目前已研究和命名的植物病毒达1000多种，其中许多为重要的农作物病原，其所造成的损失仅次于真菌病害。 植物病毒也有利用的价值，如 TMV导致分子生物学的产生； 病毒在开发基因工程的载体、转 基因植物研究等方面，也发挥了 很大作用。 三、病毒在生物中的地位 生物：细胞生物、分子生物 细胞生物：原核生物（原核生物 界）、真核生物（动物界、植物 界、菌物界、原生生物界） 分子生物：病毒界？：真病毒、 亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病 毒） 四、植物病毒的一般性状 （一）、植物病毒的形态 病毒粒体：病毒的基本存在形 式（形态）。 病毒粒体的形态微小，只有在放 大数万倍的电镜下才能观察到， 其度量单位通常采用纳米（nm， 1nm=10-9m）。 植物病毒粒体形态主要有：球 状、线状、杆状、弹状、双联体 状、丝线状、柔软不定形等。形 态多样性。 ◆许多植物病毒由不只一种粒 体构成。 一些球状病毒也有多种粒体组 分，但这些粒体形态相同，只是 其中所包含的核酸含量不同而 重量存在差异。 这些病毒被称为多分体病毒，必 需有多种病毒粒体组分同时侵 染寄主细胞，才能增殖并完成其 生物学功能。 （二）植物病毒的结构 植物病毒粒体主要含有核酸和 蛋白两大部分。中间为核酸芯 （RNA或DNA），外部有外壳蛋 白（CP）包被形成衣壳，少数病 毒在蛋白衣壳外面还包被一层 那囊膜，称为包膜病毒,如植物弹 状病毒。 1. 杆状或线状病毒：蛋白质亚基 螺旋状排列，中间是一个由核酸 构成的空心管子，核酸也呈螺旋 状排列，嵌入到螺旋状排列的蛋 白质亚基内端。如，TMV杆状 粒体。 TMV：2130个蛋白质亚基；130 圈；16 1/3亚基/圈，3 圈一个周期，49个亚基 /3圈；2.3nm亚基间隔/ 圈。 2. 球状病毒：蛋白质亚基镶嵌在 粒体表面，构成多面体形，内心 是病毒的核酸；球状病毒并非光 滑的球体，而是多面体（多为二 十面体），多个正三角形组合而 成。 （三）植物病毒组分及其生物学 功能 植物病毒的主要成份是核酸和 蛋白质，有些还含有少量的金属 离子、多胺和水等。 1. 核酸 核酸是病毒遗传信息的载体，植 物病毒粒体中的核酸主要是其 基因组，有些含mRNA。一套基 因组含有病毒侵染、复制、运转、 传播等生命活动所需的全部基 因，决定病毒的增殖、生物学特 性及致病性等。 植物病毒基因组所包含的基因 数目从一个（卫星病毒）至十二 个（植物呼肠孤病毒），一般为 4~7个基因，分子量从0.4×106d 到15.5×106d，通常具有外壳蛋 白基因、复制酶基因及运动蛋白 基因等。大部分植物病毒基因组 能编码4~7种蛋白质。 （1）植物病毒的核酸类型 植物病毒的基因组多数为核糖 核酸（RNA），少数为脱氧核糖 核酸（DNA）。 根据核酸性质及功能，可将植物 病毒基因组分为下列5种类型：
80种常见的有毒或致癌植物 1.杜鹃花：黄色杜鹃的植株和花内均含有毒素，误食会中毒；白色杜鹃的花中含有四环二萜类毒素，人中毒后会引起呕吐、呼吸困难、四肢麻木等，重者会引起休克，严重危害人体健康。 2.火殃勒：致癌。
3.射干。致癌。 4.鸢尾。致癌。鸢尾根茎可当吐剂及泻剂，也可治疗眩晕及肿毒，叶子与根有毒，会造成肠胃道郁血及严重腹泻，花苦、平、有毒。
5.红凤仙花：凤仙地上部分含指甲花醯、指甲花醒甲醚和槲草素；全草含羟基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸；茎含山奈酚-3-葡萄糖苷、天丝葵素、矢车菊素等；还含各种花色苷，有矢车菊素、飞燕草素、蹄纹天兰素、锦葵花素、山奈酚、蛋白质、氨基酸及多糖，草酸钙。凤仙花含有促癌物质！促癌物质不直接挥发，但会渗入土壤，长期食用种植在该土壤里的蔬菜，很危险。 6.阔叶猕猴桃：致癌。
7.土沈香：致癌。土沈香的葉、莖的乳汁有強烈的刺激性，可使皮膚發炎，對眼睛黏膜的刺激性更大；在林試所試種時，工作人員雖然很小心，但仍有人過敏而全身發癢。 8.剪刀股：致癌。
9.结香：致癌。结香含有瑞香毒素，有毒，还含有草酸钙晶体，可致皮肤过敏！ 10.狼毒：致癌。有大毒，中毒则腹痛、腹泻，里急后重，孕妇可致流产。冲捣时需戴口罩，否则易引起过敏性皮炎等。
11.含羞草：致癌。含含羞草碱之植物，马、驴等动物食之可致脱毛。含羞草碱可看作一种毒性氨基酸，结构与酪氨酸相似，其毒性作用乃由于抑制了利用酪氨酸的酶系统，或代替了某些重要蛋白质中的酪氨酸的地位所致。人食入含有此碱之植物，可致头发突然脱落。 12.油桐：致癌。该物种为中国植物图谱数据库收录的有毒植物，其毒性为全株有毒，种子毒性较大，树皮及树叶次之，新鲜的毒性较大。种子榨油后的油饼仍然有毒，比桐油毒性大。人食5—6粒种子即可中毒，症状先是腹痛，大吐大泻，然后头昏、口渴，以致虚脱等。
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；
精心整理 植物病毒学复习题 1.你是怎么认识病毒的害与益的？请举例说明。 害：病毒危害多种多样：侵害人体，影响人类健康，造成畜、禽等动物的传染疾病；危害农作物使其致病，影响产量和质量。病毒确实有害，特别是经济全球化，人口城市化，加上气候变暖，环境恶化，更加剧了新兴病毒的发生和原有病毒病毒的一些株系，常传播、危害。举例：据报道，马铃薯卷叶病毒和马铃50-80块茎的产量减对生命科学理论研究的意义：对生命的起源的认识益1肿瘤病毒：发现逆转录酶，RN 2逆转录病毒的发现和对中心法则的补充的传递，从而修改和补充了中心法则明遗传信息RNA-DN利用病毒制备疫苗3.生物控制：利用昆虫病毒控制害虫具有专一性、高效性、安全性、流行性4. 和持续性，对农林害虫防治和环境保护具有重要作用； 5.环境保护：利用病毒及其制剂开展有害生物的控制，可使环境免受污染； 6.花卉增色：郁金香观赏；。7.病毒基因元件：启动子、35s 目前国内外植物病毒研究的热点和前沿是什么？2.生物3.病毒基因组及基因功能研究；2.病毒与寄主植物相互关系研究；1. 热点：病毒作为载体及载体元件的研究。技术培养抗病品种；4.精心整理． 精心整理 前沿：由于分子生物学的发展和电子显微镜的进步，对植物病毒
的形态、结构、生物学特性及理化特性都有深入的研究，近年来对植物病毒的研究已进入分子水平。 3.病毒的发现能给我们什么样的启示？ 在科学实践中，仅仅有了新的发现还是不够的，重要的是敢不敢 或能不能面对自己发现的事实，做出客观的分析，提出恰当的新概念、新理论，才对科学发展为有益举例说明植物病毒在农业中的地位及其应用前景4利用昆虫病毒控制害虫具有专一性、高效性、安全性、流行性和持续性，对农1利用真菌病毒有可能防治植物真菌性林害虫防治和环境保护具有重要作用害。例如：采用粟疫病真菌的病原真菌的真菌病毒进行粟疫病的生物防治；噬菌；质型多角体病毒杀虫剂体防治细菌性病害；棉铃虫核型多角体病毒杀虫 环境保护：利用某些病毒及其制剂开展有害生物的控制，可使环境免受污染。3.花卉增色：有些病毒或其类似病原侵染植物后，能使叶片或花瓣变色，增加观4.香石竹杂色花、紫罗兰杂色花赏价值。如：郁金香杂色花、 （植物病毒在农业中有着非常重要的地位，因病毒式农业生产的大地，揭示病毒的致病本质及其发病规律，从而得以有效的控制。例如：烟草蚀纹花叶病毒可一对烟草的侵染。它具有广阔的应用前景。随着对自然界直天仙子花叶病毒和PVY的病毒种类及其分布的深入了解，我们就可以更好的兴利除害，为现代农业和科技进步做出更大的贡献。）为例来论述植物病毒胞间转移和长距离移动分别在病毒系统侵染过 程的作以TMV5. 用方式。精心整理．
植物病毒学复习题 1. 你是怎么认识病毒的害与益的？请举例说明。 2. 目前国内外植物病毒研究的热点和前沿是什么？ 3. 病毒的发现能给我们什么样的启示？ 4. 举例说明植物病毒在农业中的地位及其应用前景 5. 以TMV 为例来论述植物病毒胞间转移和长距离移动分别在病毒系统侵染过程的作用方式。 6. 植物病毒的提取过程中，为了浓缩病毒，采取的是聚乙二醇沉淀法，其试述其大致的浓缩原理。 7. 植物病毒的基因组核酸类型有哪些，并分别列举出其代表性的病毒？同时简述马铃薯Y 病毒基因组翻译的多聚蛋白（polyprotein）如何形成10 个功能蛋白体？ 8. 植物病毒分类的基本依据是什么？ 9. ICVT 第8 次分类报告的主要特点有哪些？与以往分类报告比较，新增了哪些科哪些属？ 10. 类病毒的定义。试述类病毒与植物病毒的异同点。（提示：基因组结构和病毒粒子的结构特点，以及它们所引起症状等方面论述）。 11. 略述植物病毒症状学在病毒诊断上的意义 12. 植物病毒病的外部症状主要有哪些类型，其对应寄主植物的组织病变分别是？ 13. 植物病毒病的复杂性体现在哪些方面？ 14. 某地稻田发生大面积黄化，有人说病毒引起，有人说是生理现象，你应根据
哪些原则加以判断？（病毒病与生理病的区别） 15. 在诊断植物病毒病的过程中，应如何灵活应用柯赫法则？ 16. 在田间应如何区分植物病毒病与其他侵染性病害？怎样判断植物病毒病和非侵染性病害？ 17. 如何利用常用的生物学方法区分TMV/CMV、PVX/PVY？ 18. 枯斑寄主、指示寄主、鉴别寄主的主要区别？ 19. 如何鉴定病毒与类病毒？简述其依据的原理和方法。 20. 植物病毒病常见的实验诊断方法有哪些，任选其中一种简述其原理及步骤。 21. PCR 的中文全称，并试述PCR 的原理及其在植物正单链RNA 病毒（如：马 铃薯Y 病毒）检测中应用。 22. 试述酶联免疫吸附反应（ELISA）间接法的主要实验流程。 23. 试述植物病毒在循回增殖型的传毒蚜虫中的大致循回增殖过程。 24. 抗原、半抗原、抗原决定簇及抗体的各自定义。 25. 如何根据植物病毒的传播方式和传毒特点制定病毒病害控制方案？ 26. 影响植物病毒病流行的因素有哪些？ 27. 球形病毒粒体一般具有正二十面体对称结构，试以水稻矮缩病毒（三角剖分数T=13l）的论述对称结构特点。
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
俄罗斯科学家：转基因玉米滋生植物病毒致2百万美国人死亡！ 译作者：半解一知半解时间：2012年11月23～25日 序：释意---转毒基因。顾名思义，"转毒基因"就是把有毒有害的基因或抗生素基因转入到农作物的种子里，以便让农作物达到抗病、抗虫、抗除草剂等目的。这类转基因已被最新的科研成果和事实证明对环境、动物和人类危害巨大，是一种慢性巨毒品，是典型的食品投毒！而全球转基因作物中，这类转基因占绝大多数，所以，将其称为"转毒基因"或"毒基因"是恰如其分、名副其实的。转毒基因食品化推手们一直在用10年前、20年前甚至更早的最落后的转毒基因错误假说和弥天大谎来否定最近几年有关转毒基因毒害与毒杀的重大事实和科研成果，不择手段、肆无忌惮地欺骗党和政府、全国人民和世界人民，以便掩盖转毒基因全方位危害人类健康、必然导致断子绝孙、亡国灭种的超严重后果以及他们自己和转毒基因利益集团的滔天大罪，所以，说转毒基因食品化推手们是伪科学骗子、食品恐怖分子、刑事犯罪分子和种族灭绝犯罪分子也是恰如其分、名副其实的。 ------------------------------ 俄罗斯报告称：随着神秘死亡加快，已有超过2百万美国人死亡 欧盟时报2010年4月17日 Russia Reports Over 2 Million Dead In US As Mysterious Die-Off Accelerates EU Times on Apr 17th, 2010 今天，由俄罗斯医学科学院为普金总理编写的一个令人不寒而栗的报告正在克里姆林宫传阅，该报告称：自2008年以来，美国一种"神秘死亡"已经夺去了超过2000000人的生命，这很可能与转基因谷物和粮食滋生的一种"跨物种"植物疾病有关。 A most chilling report circulating in the Kremlin today prepared by the Russian Academy of Medical Science for Prime Minister Putin states that a "mysterious die-off" in the United States has claimed over 2,000,000 lives since 2008 and is "more than likely" linked to a "crossover" plant disease linked to genetically modified grains and foods. 报告说，这种造成大规模死亡、尚不明原因的神秘肺部疾病于2008年春天在美国农业大州艾奥华爆发，很讽刺的是，在州长府参加肺协会会议的人中有36人被感染了。 According to these reports this mysterious, and as yet unidentified, lung disease responsible for this mass die-off began during the spring of 2008 in the US agricultural State of Iowa where (very ironically) at least 36 people attending a Lung Association event at the Governors mansion were stricken. 关于艾奥华州重要的一点是，它是世界上最大的玉米产区之一，在近3200万英亩农田上收获20亿蒲式耳这种经济作物，其中99%是美国农业巨头孟山都研发的转基因品种：商标名称分别为Mon 863、产生杀虫剂的Mon 810和吸收农达除草剂的NK 603。 Important to note about Iowa is that it is one of the largest corn producing regions in the World harvesting over 2 billon bushels of this valuable grain farmed on nearly 32 million acres of its farmland, over 99% of which are genetically modified varieties made by the US agricultural giant Monsanto and identified by their trade names of Mon 863, insecticide-producing Mon 810,