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收稿日期:2006204206 修回日期:2006212211
RNA 干扰———一种有力的基因沉默工具
彭辉兵(综述),全智华(审校)
(南华大学附属第一医院心血管内科,湖南衡阳421001)
中图分类号:Q522 文献标识码:A 文章编号:100622084(2007)0320177204
基金项目:湖南省自然科学基金资助项目(05JJ30040) 摘要:RNA 干扰(RNAi )自从1998年被阐明以来,一直是科学研究的一大热点。短短几年,基
于此机制建立的技术,在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域得到了广泛应用,已经成为一种有力的基因沉默方法。尤其对非编码RNA 中的短干扰RNA 与微小RNA 的研究日益受到重视。本文从RNAi 技术的发展、作用机制及应用等方面进行综述。
关键词:RNA 干扰;双链RNA ;短干扰RNA ;微小RNA ;基因沉默
RNAi ———a Pow erful Tool for G ene Silencing PENG Hui 2bing ,QUAN Zhi 2hua .(Department o f Cardio 2vascular Medicine ,The First Affiliated Hospital o f Nan Hua University ,H engyang 421001,China )
Abstract :The RNA interference has been being a hot spot in study since it is elucidated in 1998.Although few years passed ,many methods based on this has been widely used in functional genome ,microbiology and reg 2ulatory mechanism of gene expression ,which has been a strong method in gene silencing ,am ong which especially small interfering RNA and microRNA pointing to noncoding RNA is attracting m ore attention.This article re 2views RNAi in its development ,mechanism of action and application.
K ey w ords :RNA interference ;D ouble strand RNA ;Small interfering RNA ;M icroRNA ;G ene silencing
1 RNAi 技术的发展
RNAi (RNA interference )即RNA 干扰,也称RNA 干涉,是由外源或内源性的双链RNA (double strand RNA ,dsRNA )导入
细胞而引起的与dsRNA 同源的mRNA 降解,进而抑制其相应的基因表达。1998年由Fire 等[1]首次发现并命名,属于转录后水平的基因静默,是美国科学界评出的2002年度最重要的科技成果之一。现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。在短短几年中,对RNAi 的研究取得了突飞猛进的发展,许多令人振奋的报道相继出现:2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功应用RNAi 技术抑制基因表达,开创了
RNAi 技术应用于高等生物基因功
能研究的先河;2002年,K ay 研究小
组[2]首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi 研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组短干扰RNA (small interfering RNA ,siRNA )文库新技术和应用基因组siRNA 文库从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量
RNAi 研究。2 RNAi 的作用机制
现已阐明RNAi 发生机制的大致模型:①启动阶段:由
RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的dsRNA 分子在细胞内被Dicer 核酸酶(RNase III 核糖核酸酶家族成员)或Dicer 核酸酶同源物剪切成21～23nt
siRNA ,3′端带有2个碱基突出的黏性末端,5′为磷酸基团,此
结构对于siRNA 行使其功能非常关键。剪切位点一般在U 处,具特异性。②效应阶段:RNAi 特异性的核酸外切酶,核酸内切酶(RNase ш同源物),解旋酶,辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA 结合成RNA 诱导沉默复合体———RISC (RNA 2inducing silence complex )识别靶mRNA ,其中的反义
链与靶mRNA互补结合,正义链则被置换出来。继而,RISC 复合物中的RNaseш(可能是Dicer)在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。③级联放大:在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA2dependent RNA P olymerase,RdRP)的作用下,以mRNA为模板,siRNA为引物,扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶,产生更多的siRNA,从而使效应阶段反复发生,一个完整的mRNA就被降解成多个21～23nt的小片段,从而导致相应的基因表达沉默。
在这一过程中的多个步骤都需要ATP:RISC复合体的形成,siRNA与靶mRNA的配对,靶mRNA的切割。另外,在dsRNA复制过程中,两条链的分离可能也需要一个依赖ATP 的RNA解旋酶。
3 siRNA和miRNA的区别和联系
诱导基因沉默的核酸分子有反义RNA及近年发现的siRNA和miRNA(microRNA,即微小RNA)。siRNA介导特异基因mRNA的降解,这一细胞反应称RNA干扰;而miRNA使特异基因在翻译水平抑制。目前二者被认为是生物调节自身基因表达的重要方式,并参与抵抗病毒感染和转座子沉寂等过程。
siRNA和miRNA均属于非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA),且都是长度约21～25nt的小分子RNA(small RNA),近年来日益受到科学研究的重视。它们二者关系密切,存在某些异同点(表1)。
需指出的是,siRNA与miRNA的作用机制及对基因的调控长久以来被认为是截然不同的,但近来在植物中发现一些miRNA也能像siRNA一样识别切割靶mRNA,如拟南芥的一种miRNA2miRl71ΠmiRNA39靶向切割特异mRNA[3]。同时也发现有一些siRNA可以像miRNA那样与3′非翻译区(3′2U TR)作用抑制基因的表达而不影响mRNA的稳定性[4],这种现象提示可以针对3′2U TR设计特异的siRNA。到底siRNA和miRNA诱导mRNA降解还是翻译抑制,部分学者认为最终结果依赖miRNA与靶基因的互补程度和参与调控的蛋白因子[3]。这从另一方面给予一定的启示:siRNA与miRNA并不存在严格意义上的区别,尚待进一步研究探讨。
4 RNAi的特征及方法
4.1 RNAi的特征 大多数学者认为,RNAi具有以下4个重要特征[5]:①RNAi属于转录后水平的基因沉默机制;②具有高度的序列特异性,即使siRNAs中只有一个碱基与靶序列错配,也会使干涉效应大大减弱;③具有抑制基因表达的高效性,可引起该基因缺失突变的表型,而且远少于内源mRNA 数量的dsRNA就可达到明显的抑制效应;④RNAi的效应可在不同细胞间长距离传递和维持,且在某些生物中(如线虫)具有遗传性。
但值得探讨的是,一直以来siRNA及其介导的RNAi被认为具有很高的特异性,但近期有报道显示siRNA上一个碱基的改变并不影响siRNA的活性,甚至四个碱基的突变也不能使siRNA的干扰效应完全失活,这个现象对siRNA的特异性从侧面提出质疑[6]。另外,有研究显示siRNA的浓度影响其干扰的特异性,浓度降低,特异性增强[7]。并且有研究提出, siRNA的特异性是细胞型依赖性的[6]。
4.2 RNAi的方法 产生RANi的方法主要有体外合成和体内合成siRNA法。将siRNA导入细胞的方法又分为微量注射法、电穿孔法、浸泡法、工程菌喂养法、转基因法,病毒感染法和细胞渗透多肽(cell2penetrating peptides,CPPs)协助途径等。
目前,合成siRNA的方式共有5种。各具特点(表2)。
表1 siRNA和miRNA的区别与联系
相比对象
个 性
前 体结 构功能体现与靶mRNA结合
共 性
siRNA内源或外源长双链
RNA
双链分子降解mRNA引起需完全互补
miRNA内源发夹结构转录
产物之单链单链分子与互补mRNA结合
阻遏其翻译
不需完全互补
1.均由Dicer切割产生
2.长度都在22nt左右
3.都与mRNA作用而引起
基因沉默
4.复合物结构相似
5.均属于转录后基因调节
6.均为非编码小分子RNA
表2 制备siRNA的5种方式及其特点
项 目化学合成法体外转录法RnaseⅢ消化法表达载体法PCR表达框
核酸特征21～23nt
双链RNA 29nt双链
RNA
T7启动子后200～
800bp的转录模板
55～60bp
双链DNA
～50bp
双链DNA
制备时间34d至2周1～2d1～2d2～3周1d 个人操作时间几乎不需要中等中等多中等序列测试需要需要不必需要需要转染时间短中等中等长中等转染效果好好好一般一般标记siRNA可以可以可以不可不可抗性筛选不可不可不可可以不可抑制时间短短短长短成本估计最高中等低中等中等最佳选择确定最佳和
高纯度序列
筛选测试序列快速,低成本长周期研究筛选序列 注:3除化学合成法外,其余均不包括制备DNA模板时间5 RNAi技术的应用
RNAi现象自1998年发现以来,作为一种反向遗传学技术,已被成功的应用于线虫、果蝇、植物、真菌和哺乳动物等生物的多个研究领域中。
5.1 RNAi与基因功能研究 利用RNA i技术,在RNA水平抑制基因的表达,为人们提供了一种高效的基因功能研究方法。已有大量研究证实RNAi可以特异性抑制特定基因的表达,获得功能性丧失,从而成为研究基因功能的良好工具。例如:①单个基因功能研究。Prasanth等[8]用siRNA抑制Orc6基因的表达,阻碍有丝分裂,从而产生多核的细胞,结果长期缺失Orc6的细胞,增殖减慢,逐渐死亡,揭示了Orc6在染色体的复制和细胞分裂中的重要作用。②高通量基因功能研究。Ashrafi等[9]用RNAi技术系统地阻断线虫中已知基因的表达,确定了其中有305个基因失活导致体内脂肪减少,112个基因的失活使得脂肪堆积。新发现的一些调节脂肪量的基因与哺
乳动物的基因同源,另一些则具有高度的保守性。
与传统的基因功能的研究方法相比,RNAi技术在基因功能研究上有其独特的优点:①技术灵敏、易行,结果稳定;②与基因剔除(gene knockout)相比耗时少,成本相对低;③与反义技术相比具特异性和高效性;④可进行高通量的基因功能分析,适用于大规模筛选,定位新的功能基因等。基于以上优势,RNAi为人类基因组的研究进入后基因组时代,提供了一种有力的工具。
5.2 RNAi在疾病治疗中的应用 基因异常表达是许多疾病的标志。有学者认为RNAi技术能使变异基因特异性沉默,故在治疗疾病方面会比传统治疗方法针对性更强,毒副作用更小[10]。
5.2.1 在抗病毒治疗中的应用 目前已进行的研究表明RNAi可以作为一种抗病毒的有效武器,已证实对培养基中的细胞有效。针对艾滋病(AI DS),Lee等[11]针对HI V21长末端重复序列,附件基因vif和nef设计干扰片段,均取得一定进展,这为抑制AI DS病毒基因表达和感染的基因治疗提供了一个新途径。针对病毒性肝炎,McCaffrey等[12]通过表达shRNA 的载体在转染H BV质粒后免疫活性缺失小鼠肝脏中成功抑制了H BV复制。与对照相比,小鼠血清中H BsAg下降84.5%,免疫组织化学分析结果显示H BcAg下降率甚至超过99%。S ong等[13]通过RNAi技术使Fas基因沉默,成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。这为抑制肝炎病毒基因表达和感染的基因治疗提供了新思路。此外RNAi在其他病毒感染如脊髓灰质炎病毒,疱疹病毒等的应用中也取得了较满意的效果。
5.2.2 在抗肿瘤治疗中的应用 肿瘤一直是人类健康的宿敌,RNAi在此方面的运用为人类带来了曙光。RNAi有着序列特异性高的特点,可针对肿瘤相关基因变异设计干扰片段,从而特异地抑制变异mRNA的表达。如在白血病中, BCR2ABL杂合基因[分子学研究显示,染色体易位后(断裂点在bcr区),BCR与ABL基因融合成一个复合基因,进而翻译成为bcr2abl杂合蛋白]的形成导致酪氨酸激酶活性增高而致病,而针对BCR2ABL的siRNA可有效地治疗该类型的白血病[14];N omura等[15]针对T ax的siRNA成功地下调了T ax基因的表达,从而在HT LV21感染T细胞大鼠模型中使HT LV21丧失了致肿瘤作用,为今后成人T细胞白血病(AT L)的研究和治疗提供了新途径;现表明肿瘤细胞多药耐药现象的出现成为化疗最大障碍,Wu等[16]针对M DR基因,运用RNA干扰使耐药基因特异地沉默,最大的抑制效果可达65%,将提高化疗效果。以上说明RNA干扰有可能从肿瘤发生发展的多方面治疗肿瘤。
5.2.3 遗传性疾病的治疗 日本基因研究所的Ishizuka 等[17]发现RNAi同脆性X染色体综合征(与F MR21基因异常有关的导致智力低下的染色体病)之间的关系密切,揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。使遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。
5.2.4 新药物的研究和开发 RNAi还可以作为寻找新的药物靶标的工具,可以高通量地发现药物靶基因,帮助新药物的研究与开发,了解药物作用的生化模等。Makimura等[18]利用RNAi技术减少了丘脑下部一种豚鼠相关肽(agm outi2related peptide,AG RP)50%的表达量,AG RP通过提高代谢率而不减少摄食量来减轻肥胖,为肥胖的治疗提供了一个崭新靶点。5.2.5 其他 此外,Zhu等[19]使用RNAi技术对前列腺癌细胞(PC3)和乳腺癌细胞(M DA2M B2231)中的TSG101水平进行下调,在12d之后,通过免疫印迹法检测发现两个细胞系中约85%的蛋白质水平达到了选择性下调的目的。昭示了RNAi 在泌尿外科的应用前景。更有,Ling or等[20]设计Cy3标记的分别特异性针对c2Jun、Bax和Apaf21的siRNAs通过视神经断端注射抑制凋亡。该研究提出了视神经断端注射siRNAs使视网膜神经节细胞(RG C)目的基因下调的方法,提出了全新的RG C的分子生物学干预途径。以上同样为RNAi在眼科中的应用提供了可能性。
6 前景展望与存在问题
RNAi作为一种新的基因沉默工具,充分展示了其优越性。但是真正使用RNAi技术应用于人类疾病的预防和治疗尚在起步之中,仍留给大家诸多困惑:①并不是所有的RNA 序列都能轻易地接近siRNA,被其识别、切割。②基因抑制效率因基因的不同而异,因同一基因中的不同位点而不同,如何确定有效RNAi的位点。③某些生物体如病毒的复制过程并不严格,随意性很强,因此往往产生突变的子代,干扰siRNA 的识别。④如何更高效导入siRNA。⑤怎样保证导入siRNA 的稳定性,有效延长RNAi的作用时间。⑥在哺乳动物细胞中,RNAi并不能完全阻断基因的表达,特别是表达异常高的基因。⑦siRNA药物的靶细胞特异性、体内导向及可能出现的毒性问题等。
虽然面临许多困难,但是该项技术仍在以惊人的速度在不断地演进和完善。有理由相信,伴随人类基因组计划实施获得的成果,借助广大科学家们辛勤的耕耘,RNA干扰技术将在充满活力的后基因组时代中,发挥更为重要的作用,并将给生命科学领域带来新的希望。
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收稿日期:2006206213 修回日期:2007201205
AMPA 受体与癫痫的关系
冯冠青(综述),赵世刚,刘 罡(审校)
(内蒙古医学院第一附属医院神经内科,呼和浩特010050)
中图分类号:R74211 文献识别码:A 文章编号:100622084(2007)0320180203
摘要:癫痫是一种常见的神经系统疾病,严重危害人类健康。α2氨基羟甲基恶唑丙酸(AM 2PA )受体是一种游离型兴奋性谷氨酸受体,由G luR1～G luR44个亚单位组成,G luR2亚单位对
Ca 2+不通透。由于G luR2亚单位的表达天然AMPA 受体通道对Ca 2+不通透。在AMPA 受体激活
时,大量Ca 2+
内流导致神经损伤。AMPA 受体对于癫痫发病机制的研究和治疗均有重要作用。关键词:癫痫;AMPA 受体;G luR2亚单位;钙;离子
R elationship B etw een AMPA R eceptor and Epilepsy FENG Guan 2qing ,ZH AO Shi 2gang ,LIU Gang .(Department o f Neurology ,the First Hospital Affiliated to Inner Mongolia medical college ,Huhhot 010050,
China )
Abstract :E pilepsy is a comm on disease of neurology ,which seriously affects the health of human.AMPA receptor is a kind of ionotropic glutamate receptors with excitability ,which is com posed of four subunits
(G luR12G luR4),am ong which G luR2is im permeable to calcium.The nature AMPA receptor is normally Ca 2+
im permeable due to the expression of G luR2subunit.When AMPA receptor is activated ,lots of intracellular Ca 2+
result in neurons injury.AMPA receptor has the im portant role in epilepsy about its pathogenesis study and therapy.
K ey w ords :E pilepsy ;AMPA receptor ;G luR2subunit ;Calcium ;Iron
癫痫是一种常见的神经系统疾病,其发病率在一般人口中约25Π1000人,严重影响患者的生活、工作和学习,成为中枢神经系统疾病中的一大顽疾。因此,对癫痫发病机制的研究成为当今国际神经科学领域的重要课题。通过对动物模型和人类癫痫手术切除的海马标本研究,癫痫的发病机制可能是由于兴奋性异常增高、抑制机制不足或二者兼有之而导致的癫痫灶内神经元兴奋性过高,从而导致这些神经元的失控性自发性异常放电,进而引起了癫痫的反复性发作[1,2]。
谷氨酸受体是脊椎动物中枢神经系统中一类主要的兴奋性神经递质受体,可分为离子型和代谢型两大类。离子型谷氨酸受体是非特异性阳离子通道,包括N 2甲基2D 门冬氨酸(NM DA )、α2氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA )和海人酸(K A )受体通道,它们在快速兴奋性突触传递中发挥着重要作用[3]。由于NM DA 和代谢型谷氨酸受体在长时程增强(LTP )、长时程抑制(LT D )和记忆等方面具有重要作用,所以对它们的研究也较深入。但近年来,关于AMPA 和K A 受体的研究也取得了很多进展。AMPA 受体的过度激活可以导致多种神经损伤和精神异常。本文就AMPA 受体结构(图1)、功能与癫痫的关系简要综述。
1 AMPA 受体的结构
AMPA 受体是由G luR1～G luR4
(G luRA ～G luRD )4个亚单位组成的
四异聚体,其形成起始于粗面内质网
各个亚基的合成,每个亚基都有1个
大的N 端、3个跨膜区域、1个形成孔
的发夹结构和1个位于胞质侧的C 端[3]。尽管各个亚基的胞外结构和跨膜区非常相似,但它们的胞质侧C 端却不尽相同,G luR1,G luR4和少见的G
luR2L 相似,有较长的C 端,而多见的G luR2,G luR3和少见的G luR4C 具有较短的C 端,各个亚基通过C 端和不同的胞内蛋白相互作用[4,5]。
通过RNA 编辑改变AMPA 受体的功能特性的研究表明,含
G luR2亚单位的AMPA 受体异聚体呈现低Ca 2+
通透性;而由G luR1Π23Π24亚单位构成的同聚体和异聚体受体Ca 2+的通透性很高。G luR2亚单位的这一特性是由于其与其他三个亚单位在一个氨基酸残基的差异所形成的。这个氨基酸是由一种RNA 编码机制产生的,该机制将在G luR1Π23Π24
转录片段中的图1 谷氨酸受体的分类及其亚单位
2011年真题答案 1.T-DNA插入诱变原理及应用？ 原理：T-DNA是农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植物。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中，基因由于发生碱基的插入或缺失而发生突变。 应用：T-DNA插入诱变已成为反求遗传学研究的重要手段之一。 1）通过T-DNA插入获得突变植株，通过对突变体与野生型的变化对比，可对植物特定基因的功能进行分析。 2）已广泛应用与拟南芥等模式植物的突变体库构建。 3）T-DNA作为外源基因的载体，可携带外源基因感染植物，获得转基因植物。 2.反向遗传学原理及应用？ 原理：在已知生物体基因组全部序列的基础上,通过DNA重组、RNA干扰、基因沉默等技术对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等,对生物基因组进行改造，研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。 应用：1）用于研究高等动植物相关基因功能: 2）利用反向遗传学,可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编产物在病毒生命周期中的作用,为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。 3)利用反向遗传操作技术对RNA 病毒的cDNA 克隆进行点突变, 降低或消除病毒的活力，可能获得理想的减毒株来研制疫苗。 3.植物转基因沉默的可能原因？ 1）位置效应：因为转基因均是在基因组D N A序列的不同位置随机整合。如果转基因整合位置处于基因异染色质区或转录不活跃区，转基因就会在该区空间结构和成分影响下形成类似结构，导致转录不活跃或异染色质化而失活。 2）转录水平的基因沉默：整合进去的外源基因可能发生了DNA甲基化，抑制其转录。3）转录后和翻译水平的基因沉默：转录后形成的mRNA进入细胞质中，可能被植物细胞质内的RNA酶识别，将其降解；或发生RNA干扰，将mRNA降解。 翻译出的多肽发生了异常的剪接或折叠，失去活性，或被蛋白酶降解。 4.分子标记技术在植物学研究和育种工作的应用？ 分子标记技术主要包括RFLP、VNTR、SNP、染色体原位杂交等技术。 1）植物基因遗传图谱的建立：如通过RFLP技术对植物基因进行限制性片段多态性分析，从而建立植物基因组的遗传图谱，对于研究植物基因的功能有很重要的意义。 2）利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系。3）标记育种是利用与目标性状基因紧密连锁的遗传标记，对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。
转基因生物的利弊分析 第二临床医学院2012101061 黄俊霖 内容摘要:转基因生物指经遗传基因修饰了的生物体。转基因生物包括转基因 动物、转基因工程药物和转基因作物，用转基因生物材料制成的食品称为转基因食品。转基因生物及其产品是现代生物技术或基因工程技术的产物，是当代科学技术的进步与成功。但它也与科学技术一样是柄“双刃剑”，福祸相依，如何趋利避害、化险为夷，在于对其正反两方面的关系和机制有充分的认识，要掌握得法、监管适宜、运用得当。必须加强转基因生物安全监管，给公众以充分信息，让公众从非理性的恐慌和迷茫中明智地走出来。 关键词：转基因生物、食品安全、基因经济、人类环境与健康 20世纪以来,生物技术以前所未有的速度迅速发展,并在医药、农业及食品工业等领域获得广泛的应用,取得了巨大的经济效益和社会效益。转基因技术作为生物技术的核心, 是指利用分子生物学手段将人工分离和修饰过的基因导入生物体基因组中,使其生物性状或机能发生部分改变。这一技术称为转基因技术,在中国亦称为“遗传工程”、“基因工程”。经转基因技术修饰的生物体常被称为“遗传修饰过的生物体”(genetically modifiedorganism,简称GMO)。 目前, 转基因作物在一些发达国家像美国、阿根廷逐渐推广,上市的转基因食品已达几千种,转基因动物的研究给疾病的治疗、新药的制造带来了新的契机。总之,转基因技术的发展与应用给农业、医药的发展与之,转基因技术的发展与应用给农业、医药的发展与疾病的治疗提供了崭新的空间,将给人类带来巨大的利益。毫无疑问,转基因技术将成为近期内发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。 一、转基因生物的优点 1、转基因植物 1.1抗除草剂转基因植物 杂草是农作物生产的大害，将抗除草剂基因转入栽培作物，可以有效地使用除草剂除治田间杂草，保护作物免受药害，从而增产增收。抗除草剂基因植物是最先进入田间生产的转基因植物，也是当前种植面积最大的一类转基因作物。 1.2抗虫转基因植物 害虫是农业生产的另一大患害。全世界每年用于化学杀虫的费用高达数十亿美元。杀虫剂大量使用既增加农业成本又造成环境污染，特别是难降解、亲脂性的农药，其不但残留高，还可以通过食物链逐级富集放大，破坏生态平衡。因此，将各种抗虫基因导入栽培作物，由植物自身合成杀虫剂具有重大的经济和环境效益。2、转基因动物 利用DNA重组技术将特定的外源基因导入动物染色体，使其发生整合并能遗传，这将产生新的动物个体或品系。这些转基因动物作为医学研究的模型，用于疾病的病因、发病机制和治疗等方面的研究。研究转基因动物的重要目的之一是用它来培养人体器官，解决人体器官移植供体短缺问题，也可利用这种动物“生产”获得所需的药物，因为某种药品无法或极难用人工合成的方法来获得，只能从生
基因沉默与RNAi技术 定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA 与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。 RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 基因沉默是一种RNA干扰技术。 RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA ，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex ，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制. 一、基因沉默的分类及其机制 （一）转录水平基因沉默 转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核 ＲＮＡ合成的失活， 它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种： １．基因及其启动子甲基化 甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率 在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。［４］ 近来的研究表明，发生在转基因启动子５'端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。虽然转基因的甲基化可延伸至转基因的３'端，但甲基化过程均是从启动子区域开始的。从所报道的转基因沉默例子来看，几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化有关。 ２．同源基因间的反式失活 反式失活主要是由于拥有同源序列的沉默位点和其他位点的ＤＮＡ的相互作用而引起的基因沉默。通过顺式作用而甲基化并失活的基因能作为一种"沉默子"，对其他与之分离的具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 ３．后成修饰作用导致的基因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。 ４．重复序列 外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基
植物DNA 甲基化与转基因沉默 蒋自立 (贵州省遵义师范学院生物系,贵州遵义563002) 摘要 D N A 甲基化是表观遗传修饰的重要形式之一,植物D N A 甲基化及其引起的转基因沉默现象的研究对植物基因工程领域的发展有着举足轻重的作用。介绍了植物D N A 甲基化作用机理及其过程中至关重要的3种胞嘧啶甲基转移酶:M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶(C M T)和结构域重排甲基转移酶(D R M),并阐述了植物D N A 甲基化的相关机制,包括RN A 介导的D N A 甲基化(Rd MD )、组蛋白修饰与D N A 甲基化和D N A 去甲基化。通过分析植物转基因沉默现象与D N A 甲基化的关系,提出了克服由D N A 甲基化引起的转基因沉默的相关对策。关键词 D N A 甲基化;转基因沉默;表观遗传;基因工程 中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)12-05386-04 D NA Methylation and T ransgene Silencing in Plants JIA NG Zi 2li (Bio lo g y D epart ment of Z u nyi N ormal Co llege,Z un yi,G uizh ou 563002) Abstract D N A m eth ylati on is one o f the mo st sig nificant epig en etic m odificatio n m od us.A nd the research o f p lan t D N A m eth ylati on and tran sgene si 2lencing has been playin g a vital role in the dev el op ment of genetic engi neeri ng tec hnol og y.The study in tro duces the mo de o f D N A m eth ylati on and the mo st im po rtant D N A meth yltransferase throu g h D N A methy lated process:ME T1,D R M,an d C M T,w hich i ndicates the p ro g ress o f research o n the mechani sms o f D N Amethylation ,such as R N A 2depen dent D N A methy latio n,histo ne meth ylatio n,and D N A dem eth ylati on.Thro ug h analyzin g the relati on ship betw een D N A m ethylati on an d trans gene silencin g,it pu ts forw ard so me relativ e strateg ies to av oid o r reduce the effect o f trans gene silencin g.Key w ords D N A methy latio n;T ransg ene silencin g;E pigenetic in heritance;G enetic en gineerin g tech nol og y 作者简介 蒋自立(1966-),男,贵州遵义人,副教授,从事生物化学 与分子生物学研究。 收稿日期 2009202201 遗传学告诉我们,基因结构的改变会引起生物体表现型的改变,而这种改变是可以遗传的。然而,近年来的研究表明,现代生物从祖先基因组中所获得的生长、发育和进化信息并不仅仅是基因序列。在基因的D NA 序列不发生变化的条件下,基因表达发生的改变也是可以遗传的,导致可遗传的表现型变化。这种表现型变化因没有直接涉及基因的序列信息,因而是/表观0的,称为表观遗传变异,又叫表观遗传修饰。D NA 甲基化作为从细菌到人类最普遍的表观修饰方式,是表观遗传修饰的一种重要方式,对功能基因组时代的研究具有重要的意义。甲基化修饰在基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用。如D NA 甲基化与基因的转录失活,尤其是转基因的失活、转座子的转移失活等多种后生遗传基因的失活存在密切的关系[1]。并且,从所报道的转基因沉默例子来看,几乎所有的转基因沉默现象与转基因及其启动子的甲基化都有关。笔者就D NA 甲基化这一表观遗传现象做简要介绍,并分析D N A 甲基化同植物转基因沉默现象之间的联系,借此探讨D N A 甲基化引起的植物转基因沉默的解决对策。 1 DNA 甲基化模式 1.1 D NA 甲基化作用 D N A 甲基化修饰方式为CpG 二核苷酸胞嘧啶第5碳原子的甲基化,是通过甲基转移酶(D NA me thyltransfe rase,M tase)的催化作用,以S 腺苷甲硫氨酸(S A M )为供体,将甲基转移到DN A 分子的腺嘌呤或胞嘧啶碱基上的过程,主要形式有52甲基胞嘧啶,N62甲基腺嘌呤和72甲基鸟嘌呤。在高等植物中,多数D NA 甲基化发生在GC 富集区和高度重复序列处。对于重复序列,甲基化除发生在CpG 二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子上,还常发生在C AG 、C TG 三核苷酸和C C G 模体中,并且常常是对称的甲基化,但也有非对称序列甲基化的报道[2]。而非重复序列基因 在这些位点常常并不发生甲基化[3]。 D NA 甲基化作为最早被发现,最普遍的表观修饰途径广 泛存在于生物界。研究发现D NA 甲基化在不同生物中发生情况各不相同,在原核生物中CC A/T TG 和C A TC 常会被甲基化;真核生物D NA 中,52甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基;植物则分布于5c 2C G 23c 或5c 2C NG 23c 序列中;脊椎动物中,甲基化位点存在于5c 2C G 23c 序列处。真核生物中,大部分GC 序列都处于甲基化状态,而位于管家基因和少量组织特异性基因的5c 端C pG 岛(C pG 成簇出现的区域)则呈非甲基状态。其分布一般与基因的密度有很好的线形对应关系。如,人类基因组中,大小为100~1000bp 的C pG 岛总是处于未甲基化状态,并且与56%的人类基因组编码基因相关。植物基因组的52甲基胞嘧啶水平与基因组的重复序列水平是相关的。如,总共只有120Mb 碱基的拟南芥,其基因组中约有6%的甲基化胞嘧啶;而具有2500M b 的玉米基因组中大约有25%的胞嘧啶被甲基化。在同种生物中D NA 甲基化的程度也不相同。以植物为例,植物中胞嘧啶发生甲基化的比例因植物种类而异,裸子植物比开花植物D NA 包含更少的甲基化胞嘧啶[2],高等植物D NA 的甲基化比例从4.6%~30.0%不等[4]。在同一物种不同组织或同一类型细胞的不同发育阶段,基因组D NA 各CpG 位点甲基化状态也各不相同。玉米中编码胚乳特异性表达的B 2z ip 的O paque 2基因,启动子序列在叶片组织中(非表达组织)D NA 高度甲基化[5]。此外,在不同环境下以及植物特定基因及其启动子区域的甲基化分布也不同。 1.2 胞嘧啶甲基转移酶 在植物D NA 甲基化过程中,D NA 甲基转移酶起着非常重要的作用,它催化D NA 甲基化的完成。根据甲基化作用过程,可将植物细胞中的DN A 甲基转移酶分为结构和功能不同的3类[6],即M E T1甲基转移酶家族、染色质甲基化酶和结构域重排甲基转移酶。 1.2.1 M ET1甲基转移酶家族。该类甲基转移酶的主要功能可能是作为维持性甲基化酶,也可能在重新甲基化中起作用,现已在胡萝卜、豌豆、番茄和玉米中分离得到了M ET1及 安徽农业科学,Jo u rnal of Anh ui Agri.S ci.2009,37(12):5386-5389 责任编辑 孙红忠 责任校对 况玲玲
动物转基因技术及其应用 摘自（作者：幸宇云任军江西农业大学来源：《百名专家谈转基因》） 转基因是指利用现代分子生物学技术，将某些生物的基因导入到其他物种中，由于导入基 因的表达，引起这些物种性状发生可遗传的变化。转基因动物就是利用转基因技术获得的、具 有正常表达和可稳定遗传外源基因的动物。自1982年第一只转基因动物——一只因导入大鼠 生长激素基因而使生长速度倍增的转基因鼠诞生以来，各种转基因动物，如鱼、兔、猪、牛、 羊等先后问世，1997年，举世轰动的“多莉”克隆羊的诞生使转基因克隆动物成为现实，转 基因动物研究得到了进一步发展。 生产转基因动物的方法有很多，如：显微注射法、精子载体法、逆转录病毒载体法、胚胎 干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等，这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。 显微注射法是动物转基因技术中最早使用的方法。1982年，美国人Gordon就是利用这种 方法获得了名噪一时的转基因鼠。其基本原理是在显微镜下直接将目的基因注射到受精卵细胞 的原核内，在目的基因与胚胎基因组融合后进行体外培养，最后移植给受体母畜“借腹怀胎”。这种方法的优点是：可靠性高，重复性好，目的基因的整合效率相对较高，导入基因片段的大 小和类型不受限制，转基因在世代之间可以稳定遗传。该方法也有其缺点，主要体现在导入基 因整合的随机性和不可见性，这样会导致基因表达不稳定及可能出现不希望的插入突变。该方 法成功的范例很多，如：美国科学家Hammer等在1985年获得一批转基因兔、绵羊和猪；荷兰 科学家KrimPenfort等于1991年获得了转基因牛；1985年，我国朱作言院士等成功获得了世 界上首例转基因鱼；由中国农业大学李宁院士领导的课题组于2008年获得了一头导入人CD20 抗体基因的转基因奶牛——贝贝。 有的学者另辟蹊径，创立了精子载体转基因法。该方法是将精子与目的DNA进行预培养后，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，精子与卵子结合后，该基因被整合到受精卵的DNA 中。同显微注射法相比，该方法有几个明显的优点：无需显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本很低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但该方法成功率不高、效果不 稳定，有待科研人员进一步探索和改进。与显微注射法相比，该方法成功的例子不多。1989 年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠；1996年意大利Sperandio科 研小组报道了采用该方法生产转基因牛和猪。 谈到病毒，人们往往面容失色，殊不知病毒在科学上有很多妙用。逆转录病毒是一种RNA 病毒，在转基因技术中有着独特的应用。人们将目的基因结合到逆转录病毒上，通过病毒感染 可将目的基因插入到宿主基因组中去。该方法具有可同时感染大量胚胎、不需要昂贵的显微注 射设备等优点，但也存在插入外源DNA大小有限、外源基因易发生重排和丢失、逆转录病毒的 序列可能干扰转基因表达等缺点。应用该方法，美国人Salter等（1987）生产出转基因鸡； 德国学者Hofmann等获得绿色荧光蛋白转基因猪（2003），随后又生产出转基因牛（2005）； 来自冷泉港实验室的Michael获得能够发荧光的山羊（2006）。 胚胎干细胞是生命体中保留的未成熟细胞，具有再分化形成其他细胞和组织器官的潜力， 被称为“万能细胞”。利用胚胎干细胞生产转基因动物的原理是将外源基因导入分离好的胚胎 干细胞，然后将转基因的胚胎干细胞注射于受体动物胚胎后，参与宿主的胚胎融合形成嵌合体，从而得到转基因动物。这一方法的优点是可以对胚胎干细胞进行特定选择。缺点是目前只有小 鼠干细胞系比较成熟，而家畜干细胞系还未完全建立，有不少问题尚待解决。 体细胞克隆介导的转基因是动物转基因技术中的“高级版本”。说到体细胞克隆，很多人都会想到一位“动物明星”——多莉羊，它是于1997年由英国Wilmut等获得的杰作。转基因 克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合，其基本原理是将目的基因导入动物体细胞
基因改造生物带给人类收益还是危害 5月16日消息：通过基因改造的生物是否会打破自然界的生态平衡，从而导致对环境的危害？面对基因改造生物可以带给人类的巨大收益和可能带来的危害，人类该何去何从？昨天，在由国家环保总局主办，由加拿大食品检验署、南京环境科学研究所等单位协办的生物安全培训班上，到会的各路专家再次把关注的目光投到了转基因作物的安全性上。 国家环保总局自然司柏成寿告诉记者，通过基因方式对生物体进行改良取得了很大的成效。很多物种在改良后产量有了增加，也增强了防御自然灾害及病虫害的能力。但值得注意的是，改良后的品种可能会对环境产生一定危害。 他举例说，像“抗虫棉”，这种棉花经过一定的基因转化后，可以使自然界中原来危害棉花的害虫死去，但它也可以使很多非目标的有益昆虫死去。还有一些农作物被注入一种抗除草剂基因，当农田中施加除草剂时，所有的杂草都会死去，只保留下农作物本身。但在某种情况下，这种抗除草剂的农作物会和杂草出现杂交，这种杂草就被称为“超级杂草”，消灭起来就非常困难。 北京大学生命科学院许崇任和国家环保总局南京环境科学研究所的刘标还列举了近年来引起社会广泛关注的转基因作物事件，包括：将巴西豆的基因转入大豆，虽然可以改良大豆营养组成，但可能会引起部分人群发生过敏反应。转Bt基因玉米可以提高有益昆虫绿草蛉的死亡率和延长发育时间。用食转基因马铃薯的蚜虫饲喂瓢虫，会影响瓢虫的生殖力及存活。而蚜虫是温带作物中重要的害虫，瓢虫是其天敌。 通过基因改造的生物是否会打破自然界的生态平衡，从而导致对环境的危害？面对基因改造生物可以带给人类的巨大收益和可能带来的危害，人类该何去何从？昨天，在由国家环保总局主办，由加拿大食品检验署、南京环境科学研究所等单位协办的生物安全培训班上，到会的各路专家再次把关注的目光投到了转基因作物的安全性上。 国家环保总局自然司柏成寿告诉记者，通过基因方式对生物体进行改良取得了很大的成效。很多物种在改良后产量有了增加，也增强了防御自然灾害及病虫害的能力。但值得注意的是，改良后的品种可能会对环境产生一定危害。 他举例说，像“抗虫棉”，这种棉花经过一定的基因转化后，可以使自然界中原来危害棉花的害虫死去，但它也可以使很多非目标的有益昆虫死去。还有一些农作物被注入一种抗除
植物转基因沉默的机制及克服方法 专业：植物学学号：220100905010 姓名：潘婷 摘要：植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用，转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 关键词：转基因沉默；外源基因；DNA甲基化；共抑制 1986年Peerbotte发现转基因烟草中出现转基因沉默(transgene silencing)现象后，研究者对转基因沉默进行了许多深入探索，以期阐明转基因沉默的机制和获得克服手段。 1 转基因沉默机制 转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上，现在也把位置效应引起的沉默归到转录水平。 1.1 转录水平基因沉默(TGS)机制 1．1．1 甲基化作用从目前报道看，几乎所有的转基因沉默现象都与转基因及其启动子的甲基化有关，DNA甲基化都是从启动子区域开始的，主要发生在基因5’端启动子区域。甲基化通常发生在DNA的GC 和CNG序列的C碱基上，C碱基甲基化不是转基因沉默前提，但对维持基因沉默是必需的。甲基化基因序列通过抑制甲基化DNA结合蛋白的结合进而抑制转录。 1．1．2 位置效应转基因在宿主细胞基因组中的整合位点往往决定着转基因能否稳定表达。研究发现，转基因烟草中稳定表达的T-DNA
至少有一侧和基因组DNA富含AT的核基质附着区相邻，并且位于端粒附近。而不能稳定表达的T-DNA则位于异染色质及着丝粒旁。1．1．3 重复序列、同源序列等引起的TGS Assaad等对自交转基因(潮霉素抗性基因)植株后代进行分析时发现了重复序列诱导的基因沉默(RIGS)。重复序列诱导的基因沉默指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。它有顺式失活和反式失活2种作用方式。进行多个基因转化时，基因启动子间同源序列相互作用也能引起反式失活。 1．2 转录后水平基因沉默(PTGS)机制 1．2．1 RNA阈值模型 1994年Dougherty等提出RNA阈值模型，认为在细胞质中可能存在mRNA的监控系统。监控系统能促使超量表达的mRNA降解，使细胞内转基因转录物不超过一个特定的阈值。 1．2．2 异常RNA模型鉴于转录后基因沉默并不总是表现出较高的转录水平，而是有一种不同于正常mRNA的异常的RNA(aRNA)存在，English等1996年提出了异常RNA模型，该模型认为aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的活性，RdRp 再以aRNA为模板合成大量约25bp的互补RNA (cRNA)。这些cRNA如果与同源的mRNA相遇就会结合上去形成部分双链结构一dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别、降解。在该过程中，内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合，并被同时降解。这样外源基因的导入，会最终导致内源和外源基因的表达共同受阻，即出现共抑制现象。 1．2．3 双链RNA模型 Waterhouse认为转基因沉默原因在于外源基
转基因动物技术应用研究进展 摘要：本文主要对动物转基因技术发展状况作了概述，重点是近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法, 如睾丸转基因法和卵巢转基因法; 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法作了介绍。然后对转基因技术的应用作了论述，最后对转基因技术的发展前景作了展望。 关键字：动物转基因技术；应用；展望 Progress on Techniques for Producing Transgenic Animals And their Application Abstract: This review describes the recently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non-site specific methods; gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods.The application and prospect of transgenic technology was also discussed. Key words: animal gene transfer technique; application;prospect 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中, 从而使其得以表达。自Palmiter等[1] (1982)把大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵获得超级巨鼠以来,世界各国科学家对转基因技术应用于动物生产的研究产生了极大的兴趣,并相继在兔、羊、猪、牛、鸡、鱼等动物上获得转基因成功。转基因动物研究是近年来生命科学中最热门、发展最快的领域之一,其应用已广泛渗透于分子生物学、发育生物学、免疫学、制药及畜牧育种等各个研究领域中。这项技术正在对动物生产产生一场新的革命,在提高生长速度、生产性能,改善产品品质、抗病育种、基因治疗等方面取得了可喜的进展,显示出诱人的应用前景。 1 转基因动物技术 1.1 显微注射法 这一方法是发展最早,目前应用最广泛和最为有效的制作转基因动物的方法,创始人是Jaenisch和Mintz等,Gorden等[2]和最先通过此法获得转基因动物。其基本原理是:通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵,利用受精卵繁殖过程中DNA的复制过程,将外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。 1.2 逆转录病毒载体导入法 将目的基因重组到逆转录病毒载体上,制成高滴度的病毒颗粒,人为感染着床前后的胚胎,
转基因食品的优点 可增加作物单位面积产量；可以降低生产成本；通过转基因技术可增强作物抗虫害、抗病毒等的能力；提高农产品的耐贮性，延长保鲜期，满足人民生活水平日益提高的需求；可使农作物开发的时间大为缩短；可以摆脱季节、气候的影响，四季低成本供应；打破物种界限，不断培植新物种，生产出有利于人类健康的食品。 转基因食品也有缺点 所谓的增产是不受环境影响的情况下得出的，如果遇到雨雪的自然灾害，也有可能减产更厉害。且多项研究表明，转基因食品对哺乳动物的免疫功能有损害。更有研究表明，试验用仓鼠食用了转基因食品后，到其第三代，就绝种了。 全球人口的迅猛增长，耕地面积的不断减少，粮食问题成为世界许多国家面临的一个十分辣手的问题。要满足人们的食品供应，提高食品供应质量，必须依靠科学技术。目前转基因技术在食品生产中的应用，已取得明显的成效，转基因食品也已悄然走上人们的餐桌。1 转基因食品的发展状况转基因食品(Genetically modified food)就是以转基因生物为原料加工生产的食品。世界上最早的转基因作物诞生于1983年，是1种含有抗生素类抗体的烟草。直到10年以后，第1种市场化的转基因食品才在美国出现。它是1种可以延迟成熟的西红柿。到了1996年，由其制造的番茄酱才得以允许在超市出售。据统计，1997年全世界转基因作物的播种面积约为1100万hm2，1998年上升到2780万hm2，1999年将近达到4000万hm2。全球转基因农作物销售额1995年为7500万美元，1996年达2．35亿美元，1997年达6．7亿美元，1998年跃升为16亿美元。预计到2000年，全世界的转基因农产品市场可达到30亿美元以上，2010年将达到250亿美元，转基因动物产品可达到75亿美元美国是转基因技术采用最多的国家，20世纪80年代初，美国最早进行转基因食品的研究。从1983年转基因作物诞生，到1997年，美国已能生产34种转基因作物，如土豆、西葫芦、玉米、番茄、木瓜、大豆等，并形成了可观的产业规模。转基因作物播种的面积已占大豆播种总面积的55％，占玉米播种面积的40％。阿根廷是继美国之后大量采用转基因技术的第2个国家，1997年，阿根廷转基因作物的播种面积仅140万hm2，1998年增加到550万hm2，其中75％的大豆播种面积采用了经过改变基因的豆种。加拿大也是转基因农业生产发展迅速的国家，它的转基因作物播种面积已从1997年的130万hm2增加到2000年的280万hm2，2001年51％的大豆和玉米采用了经过基因处理的种子、除上述3个国家外，世界上应用转基因技术比较多的国家还有澳大利亚、墨西哥、西班牙、法国和南非等。中国是90年代初进入商业型转基因农业生产的第1个发展中国家，在21世纪，我国的转基因食品会得到很快的发展，一方面因为我国的生物技术研究越来越接近世界水平，甚至有些方面已达到世界水平，为其发展提供了可靠的技术支持；另一方面，我国对转基因食品的市场需求很大，我国人均耕地面积少，不可能完全依靠扩大耕地面积来满足人们的食品需求，只能走高科技发展之路，生物技术无疑是其中1个重要手段，亦是提高食品质量的1种重要方式。如果我们自己不发展，这个潜在的市场就会被国外的转基因食品所抢占。2 有利的方面2．1 过去改变植物的品种主要是通过育种，这种传统的育种方式需要的时间长，杂交出的品种不易控制，目的性差，其后代可能高产但不抗病，也可能抗病但不高产，也许是高产但品质差，所以必需一次一次地进行选育。而转基因技术就不同了，可以选择任何1个目的基因转进去，就可得到1个相应的新品种，不用再花那么长的时间筛选了。2．2 传统的
转基因技术的利与弊 科学家发明转基因技术的初衷是想利用该技术造福人类，既可加快农作物和家畜品种的改良速度，提高人类食物的品质，又可以生产珍贵的药用蛋白，为患病者带来福音。比如说，抗虫的转基因玉米不会被虫咬，可以让人们放心食用；将能产生人体疫苗的基因转入植物食品，人们就可以在食用食物的同时增加自身对疾病的抵抗力。 但是，人类对自然界的干预是否会造成潜在的尚不可能预知的危险？大量转基因生物会不会破坏生物多样性？转基因产品会不会对人类健康造成危害？一些科学家们开始担心对生物、植物生命进行的“任意修改”，创造出的新型遗传基因和生物可能会危害到人类。它们可能会对生态环境造成新的污染，即所谓的遗传基因污染，而这种新的污染源很难被消除。还有，转基因农作物和以此为原材料制造的转基因食品对人体的影响也尚未有定论。 目前，国内外学者对转基因技术的负面影响也作了大量研究，出现了许多相关报道，如英国的权威科学杂志《自然》刊登了美国康奈尔大学副教授约翰·罗西的一篇论文，引起世界震惊。论文指出，研究人员在实验室里把抗虫害转基因玉米“BT玉米”的花粉撒在苦苣菜叶上，然后让蝴蝶幼虫啃食这些菜叶。4天之后，有44％的幼虫死亡，活着的幼虫身体较小，并且没有精神。而另一组幼虫啃食撒有普通玉米花粉的菜叶，就没有出现死亡率高或发育不良的现象。论文据此推断，BT转基因玉米花粉中含有毒素。另据报道，英国伦理和毒性中心的实验报告说，与一般大豆相比，耐除草剂的转基因大豆中，防癌的成分异黄酮减少了。与普通大豆相比，两种转基因大豆中的异黄酮成分减少了12％～14％，还有巴西坚果事件等。面对国际上出现的种种关于转基因作物的争议，许多科学家、学术团体纷纷以各种形式发表对转基因技术的支持态度。由美国Tuskegee大学Prakash教授2000年1月起草的题为“科学家支持农业生物技术的声明”，已征集到世界上3 000多位科学家的签名，其中包括DNA双螺旋结构的发现者、诺贝尔奖得主James Watson，绿色革命的创始人、诺贝尔奖得主Norman Borlaug，世界粮食奖获得者、国际水稻研究所首席育种家Gurdev Khush。该声明称，“对植物负责任的遗传修饰既不新也不危险。如抗病虫等诸多性状已通过有性杂交和细胞培养的方法经常性地引入作物中。与传统的方法相比较，通过重组DNA技术引入新的或不同的基因并不一定会有新的或更大的风险，且商品化的产品的安全性则由于目前的安全管理规则而得到了更进一步的保障。遗传新技术为作物改进提供了更大的灵活性和精确性。” 因此，笔者认为和现代任何一项工业技术一样，转基因技术也具有两面性，有长亦有短。在发展转基因技术等生物技术时，应该扬长避短、趋利避害、规范管理，使转基因技术能够健康发展。 转基因技术的发展展望 当前条件下，转基因技术还存在许多不足，还处于不断的发展与完善之中，表现在：转基因表达水平低，许多转基因的表达强烈地位受着其宿主染色体上整合位点的影响，往往出现异位表达和个体发育不适宜阶段表达，影响转基因表达能力或基因表达的组织特异性，从而使大部分转基因表达水平极低，极少部分基因表达水平过高；难以控制转基因在宿主基因组中的行为，转基因随机整合于动物的基因组中，可能会引起宿生细胞染色体的插入突变，还会造成插入位点的基因片段丢失，插入位点周围序列的倍增及基因的转移，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因；不了解哪些基因控制多数生理过程，不了解基因表达的发育控制和组织特异性控制的机制；制作转基因动物的效率低，这是目前几乎所有从事转基因动物研究的实验室都面临的问题，也是制约着这项技术广泛应用的关键；对传统伦理是一种挑战，对人类的生存有一定的负面作用等。但笔者相信只要通过科学家的进一步研究和各国对转基因技术的规范管理，保证转基因技术的研究和开发的健康而有序，制定相关的法律、法规，健全转基因生物和转基因食品的管理，如对转基因作物进行监管，对转基因食品进行标识等，应该更深入的了解转基因技术其中的奥秘，只有更了解它才能利用好它，让我们的生活更加
转基因动物及其产品的主要管理制度 摘要:转基因三文鱼被美国FDA 批准上市，成为世界上首个获批可直接食用的转基因动物食品，开启了转基因动物商品化的大门。为对转基因动物及其产品进行有效的监管，世界各国均在不同程度上制订了管理制度，其中主要包括安全性评价制度和转基因成分标识管理制度。文中对猪、牛、羊等转基因动物的研发现状和转基因动物的检测技术进行了阐述，对世界主要国家/地区的转基因动物及其食品安全性评价制度和转基因成分标识制度的发展现状进行了综述，最后对转基因动物及其产品的发展做出了展望。 转基因动物是指通过基因工程等技术对基因组进行修饰，使其出现与原品种不同的性状或产物。自1982 年美国科学家将生长激素基因导入小鼠受精卵中获得转基因“超级鼠”，开启转基因动物研发的大门后，转基因鱼、兔子、猪、牛、羊等20 多种转基因动物相继被培育出来。转基因动物在提高生产性能、增强抗病能力、培育新品种、建立疾病模型、器官移植等方面有着广泛的应用。以转基因动物为原料加工生产的产品称为转基因动物产品。目前，世界上针对转基因动物及其产品的主要管理制度为安全性评价和标识管理制度。转基因动物及其产品的生物安全性受到了各国研究机构和组织的关注，在其进入人们生活之前，均经过严格的安全性评价。同时，针对批准上市的转基因产品，为了保障消费者的知情权和选择权，各国根据自己的国
情制定了转基因生物的标识管理制度。同时转基因动物及其产品的检测技术是保障安全性评价和标识管理制度顺利实施的重要手段。 一、转基因动物及其产品概述 1、转基因动物及其产品的研究概况 转基因动物的研究主要集中在提高生长速率、疾病模拟的建立、增强抗性和表型改变等方面。近年来，学者通过研发显性致癌基因的转基因小鼠，酪氨酸酶基因双等位猪和PARK2、PINK1 双基因敲除猪等，为肿瘤、动脉粥样硬化、白化病、帕金森综合征和乙型肝炎等疾病建立了模型，同时也为一氧化氮合酶及eGFP 相关染色质的功能研究提供新思路。肌肉生成抑制素基因(MSTN) 敲除的猪和表达外源纤维素酶和木质素酶的转基因小鼠的成功研制，为提高动物的瘦肉率和饲料转化率打下了基础。通过构建双重shRNA 表达系统的转基因牛和短发卡RNA 结构转基因鸡等转基因动物，有效防范了疾病的传播。为了增加动物的观赏性，相继出现了转绿色荧光蛋白基因猪，转黄色荧光蛋白斑马和转红色荧光蛋白基因唐鱼等。转基因牛的研制主要集中在乳腺生物反应器，如转人乳铁蛋白基因牛，转人血清白蛋白基因牛等。中国农业大学的学者相继研发出转人乳铁蛋白、人溶菌酶、人α -乳清白蛋白基因奶牛。最近，华南农业大学的学者报道了用转基因小鼠中的唾液腺作为生物反应器，成功生产出人神经生长因子蛋
第一阶段：双方1辩立论陈词 正1：我方的观点是转基因生物存在着安全问题，应禁止。理由如下：由于科学发展水平的限制，目前科学家们对基因的结构，基因间的相互作用，以及基因的调控机制等都了解的相当有限；再加上转移的基因虽然是功能已知的基因，但不少却非同种生物的基因，由于外源基因插入宿主基因组的部位是往往随机的，因此在转基因生物中，很可能会出现一些人们意想不到的后果。例如在转基因食品中，可能会出现新的有毒物质或过敏原，对人类的生命安全造成危害；在生物安全方面，我们担心将各类活的转基因生物释放到环境中，可能会对生物的多样性构成潜在的风险和威胁。在环境保护方面，转基因生物还有可能会对生态系统的稳定性和人类的生活环境造成破坏。综上所诉，我们有理由认为；转基因生物无论是在食品安全，生物安全还是环境安全方面，都存在着安全隐患。 ) 反1：我方的观点是转基因生物是安全的，应提倡。我们认为，基因工程自20世纪70年代兴起后，在短短的30年间，就得到了飞速的发展，目前已成为生物科学的核心技术，在农牧业，工业，环境，医药卫生等方面展示出巨大的成就和美好的前景。例如在农业方面，科学家将抗虫基因，抗病基因，抗旱基因，抗除草剂基因等，导入农作物中以提高其抗逆能力，在改良了农作物品质的同时，还减少了农药的使用，保护了环境。在医药方面，现在利用转基因工程菌生产的药物已有60多种投放市场，最常见的就是胰岛素，干扰素等，有效的解决了像糖尿病这些常见病给人类带来的困扰。转基因产品给人类带来的福音还有很多，而对方辩友所提到的那些安全隐患，我认为是过分担忧，并没提供出实际的事例来证明，我们不能怕噎着，就不去吃饭吧，所以我方坚持认为：转基因生物是安全的，应提倡。 （
基因改造生物带给人类收益还是危害 5 月1 6 日消息：通过基因改造的生物是否会打破自然界的生态平衡，从而导致对环境 的危害？面对基因改造生物可以带给人类的巨大收益和可能带来的危害，人类该何去何从？ 昨天，在由国家环保总局主办，由加拿大食品检验署、南京环境科学研究所等单位协办的生 物安全培训班上，到会的各路专家再次把关注的目光投到了转基因作物的安全性上。 国家环保总局自然司柏成寿告诉记者，通过基因方式对生物体进行改良取得了很大的成 效。很多物种在改良后产量有了增加，也增强了防御自然灾害及病虫害的能力。但值得注意 的是，改良后的品种可能会对环境产生一定危害。 他举例说，像“抗虫棉”，这种棉花经过一定的基因转化后，可以使自然界中原来危害棉 花的害虫死去，但它也可以使很多非目标的有益昆虫死去。还有一些农作物被注入一种抗除 草剂基因，当农田中施加除草剂时，所有的杂草都会死去，只保留下农作物本身。但在某种 情况下，这种抗除草剂的农作物会和杂草出现杂交，这种杂草就被称 为“超级杂草”，消灭起 来就非常困难。 北京大学生命科学院许崇任和国家环保总局南京环境科学研究所的刘标还列举了近年 来引起社会广泛关注的转基因作物事件，包括：将巴西豆的基因转入大豆，虽然可以改良大 豆营养组成，但可能会引起部分人群发生过敏反应。转Bt 基因玉米可以提高有益昆虫绿草 蛉的死亡率和延长发育时间。用食转基因马铃薯的蚜虫饲喂瓢虫，会影响瓢虫的生殖力及存 活。而蚜虫是温带作物中重要的害虫，瓢虫是其天敌。 通过基因改造的生物是否会打破自然界的生态平衡，从而导致对环境的
危害？面对基因改造 生物可以带给人类的巨大收益和可能带来的危害，人类该何去何从？昨天，在由国家环保总 局主办，由加拿大食品检验署、南京环境科学研究所等单位协办的生物安全培训班上，到会 的各路专家再次把关注的目光投到了转基因作物的安全性上。 国家环保总局自然司柏成寿告诉记者，通过基因方式对生物体进行改良取得了很大的成 效。很多物种在改良后产量有了增加，也增强了防御自然灾害及病虫害的能力。但值得注意 的是，改良后的品种可能会对环境产生一定危害。 他举例说，像“抗虫棉”，这种棉花经过一定的基因转化后，可以使自然界中原来危害棉 花的害虫死去，但它也可以使很多非目标的有益昆虫死去。还有一些农作物被注入一种抗除 草剂基因，当农田中施加除草剂时，所有的杂草都会死去，只保留下农作物本身。但在某种 情况下，这种抗除草剂的农作物会和杂草出现杂交，这种杂草就被称 为“超级杂草”，消灭 起来就非常困难。 北京大学生命科学院许崇任和国家环保总局南京环境科学研究所的刘标还列举了近年来 引起社会广泛关注的转基因作物事件，包括：将巴西豆的基因转入大豆，虽然可以改良大豆 营养组成，但可能会引起部分人群发生过敏反应。转Bt 基因玉米可以提高有益昆虫绿草蛉 的死亡率和延长发育时间。用食转基因马铃薯的蚜虫饲喂瓢虫，会影响瓢虫的生殖力及存活。 而蚜虫是温带作物中重要的害虫，瓢虫是其天敌。 据了解，大规模应用转基因生物至今的十几年中，尚未出现因转基因生物引起的危害事件。 人类对转基因生物可能带来的安全性问题的认识也在逐步深入。专家们认为，人类有能力控 制转基因技术可能造成的危害。