兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立
【摘要】目的建立小肠急性缺血再灌注损伤模型，确定合适的肠系膜上动脉阻断时间。方法将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间（0、15、30、45、60 min）分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。每组取8只于恢复血供2 h后留取兔下腔静脉血标本及肠组织，检测血清中丙二醛（MDA）含量的变化，光镜下观察小肠组织形态学变化并对小肠黏膜损伤程度进行评分。另6只兔用于术后24、48、72 h 生存率的观察。结果 A、B、C组的术后生存率均>83.3%。C、D、E 组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性（F=12.13、280.24,P<0.01）。结论肠系膜缺血30 min再灌注2 h 是建立兔小肠急性缺血再灌注损伤的合适时间。
【关键词】肠；缺血；再灌注损伤；模型,动物
［ABSTRACT］Objective To create a model of acute intestinal ischemia reperfusion injury in rabbits so as to determine suitable blocking duration of superior mesenteric arteries (SMA). Methods Seventy rabbits were divided into five groups as groups A, B, C, D, and E, based on the different blocking durations of SMA for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively, with 14 rabbits in each group. Eight of the rabbits in each group were detected for serum levels of MDA 2 h after recovery of blood supply, the changes of histomorphology of small intestine observed light microscopically. The other six
rabbbits in each group were used to observe the 24 h, 48 h and 72 h survival rates after the blockage of SMA. Results The survival rates were over 83.3% in groups A, B and C. Serum levels of MDA and score of injury of intestinal mucosa were significantly higher in groups C, D and E than that in group A (F=12.13,280.24；P<0.01). Conclusion The suitable duration for creating a model of acute SMA ischemia reperfusion injury in small bowel is ischemia for 30 minutes and reperfusion for 2 hours.
［KEY WORDS］ intestines; ischemia; reperfusion injury; model, animal
缺血再灌注损伤(IRI)是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血时进一步加重，器官功能进一步恶化的临床综合征[1]。IRI具有种属、器官的普遍性和广泛性，在临床上常见于动脉阻塞性疾病治疗过程中、器官移植、术中血流阻断、休克、心肺复苏等情况。IRI对器官的功能和组织结构都可以造成明显的损伤，甚至引起急、慢性器官衰竭[2]。临床上肠系膜缺血性疾病具有诊断困难、预后差、病死率高的特点。本研究旨在探索建立急性肠道IRI模型的条件，为研究如何减轻甚至阻止肠道IRI提供工具。
1 材料和方法
1.1 材料
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到 大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。
兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立 【摘要】目的建立小肠急性缺血再灌注损伤模型，确定合适的肠系膜上动脉阻断时间。方法将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间（0、15、30、45、60 min）分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。每组取8只于恢复血供2 h后留取兔下腔静脉血标本及肠组织，检测血清中丙二醛（MDA）含量的变化，光镜下观察小肠组织形态学变化并对小肠黏膜损伤程度进行评分。另6只兔用于术后24、48、72 h 生存率的观察。结果 A、B、C组的术后生存率均>83.3%。C、D、E 组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性（F=12.13、280.24,P<0.01）。结论肠系膜缺血30 min再灌注2 h 是建立兔小肠急性缺血再灌注损伤的合适时间。 【关键词】肠；缺血；再灌注损伤；模型,动物 ［ABSTRACT］Objective To create a model of acute intestinal ischemia reperfusion injury in rabbits so as to determine suitable blocking duration of superior mesenteric arteries (SMA). Methods Seventy rabbits were divided into five groups as groups A, B, C, D, and E, based on the different blocking durations of SMA for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively, with 14 rabbits in each group. Eight of the rabbits in each group were detected for serum levels of MDA 2 h after recovery of blood supply, the changes of histomorphology of small intestine observed light microscopically. The other six
病理生理学缺血再灌注损伤试题及答案 This model paper was revised by LINDA on December 15, 2012.
第十章缺血－再灌注损伤
一、选择题 【A型题】 1．缺血再灌注损伤最常见于下述哪一器官 A．心肌 B．脑 C．肝 D．肾 E．肠 2．最活泼有力的氧自由基是： A．-? 2 O B．H2O2 C．OH· D．LO· E．LOO· 3．认为再灌注损伤实为缺血的继续和叠加的学说为： A．钙超载 B．自由基损伤 C．无复流现象 D．白细胞作用 E．能量代谢障碍4．缺血-再灌注性心律失常最常见的类型： A．房性心律失常 B．室性心律失常 C．房室交界部阻滞 D．房室传导阻滞 E．房颤 5．氧反常损伤程度加重，不见于： A．缺氧的时间越长 B．缺氧时的温度越高 C．缺氧时酸中毒程度越重 D．重给氧时氧分压越高 E．再灌注时pH纠正缓慢 6．有关自由基的错误说法是： A．自由基是具有一个不配对电子的原子、原子团和分子的总称 B．-? 2 O是其他活性氧产生的基础
C．OH＾自由基的产生需有过渡金属的存在 D．体内的自由基有害无益 E．自由基的化学性质极为活泼 7．钙反常时细胞内钙超载的重要原因是： A．ATP减少使钙泵功能障碍 B．Na+-Ca2+交换增加 C．电压依赖性钙通道开放增加 D．线粒体膜流动性降低 E．无钙灌流期出现的细胞膜外板与糖被表面的分离 8．导致染色体畸变、核酸碱基改变或DNA断裂的自由基主要为： A．-? 2 O B．OH· C．H 2O 2 D．LO· E．LOO· 9．缺血一再灌注时细胞内氧自由基生成增加不见于： A．中性粒细胞吞噬活动增强 B．儿茶酚胺增加 C．黄嘌呤氧化酶形成减少 D．细胞内抗氧化酶类活性下降 E．线粒体受损、细胞色素氧化酶系统功能失调 10．自由基对机体的损伤最主要是通过： A．蛋白质交联 B．直接损伤核酸 C．引发葡萄糖交联 D．脂质过氧化引起损伤 E．引起染色体畸变 11．下面哪个不是活性氧 A．NO B．-? 2 O C．OH· D．CO 2 E．LOO·
第20卷 第4期2005年8月 内蒙古民族大学学报(自然科学版) Journal of Inner Mongolia University for Nationalities Vol.20 No.4 Aug.2005肠缺血再灌注损伤的防治研究进展Ξ 马玉山,罗 力 (内蒙古医学院第一附属医院普外科,内蒙古呼和浩特 010050) 摘 要:本文概述了肠缺血再灌注损伤的可能机理及其预防和治疗措施. 关键词:缺血再灌注损伤;肠 中图分类号:R656.7R364.1 文献标识码:A 文章编号:1671-0185(2005)04-0452-04 The Progress of Prevention and Therapy in Ischemia R eperf usion Injury of Intestine MA Yu-shan,L UO Li (G eneral Surgery Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College,Hohhot010050,China) Abstract:This review was performed to summarize the possible mechanism and therapy in is2 chemia reperfusion injury of intestine. K ey w ords:Ischemia reperfusion injury;Intestine 肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,简称I/R)是外科实践中常见的组织器官损伤之一,在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全以及小肠移植的病理演变过程中起重要作用.近年来许多研究表明肠缺血再灌注损伤不仅可以引起消化道局部的组织损害,而且可以导致肠内细菌毒素移位到体循环,引起网状内皮系统发生系列反应,进而导致大量相关介质和细胞因子的释放,甚至发生多系统器官功能不全综合征,因此近年来越来越受到重视,其发生发展机理及防治措施的研究也成为外科领域的重点和难点课题之一. 肠缺血再灌注损伤的病理生理机制尚不清楚,人们先后提出过能量衰竭、氧自由基损伤、钙超载、白细胞黏附与内皮细胞损伤、介质病、细胞因子和细胞凋亡等一系列学说,并针对肠缺血再灌注损伤的可能机制,进行了相应的防治实验研究,并取得了一些进展. 1 抗能量缺乏疗法 组织缺血时,组织细胞内氧的供应减少或中断、细胞的有氧代谢受到抑制、A TP合成急剧下降,加之无氧代谢产生的有毒酸性产物大量累积,导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏,在严重缺血时可使细胞内环境紊乱,甚至细胞死亡,因此在缺血期为缺血组织提供足够的A TP可以阻止无氧代谢及细胞膜内外离子的平衡.史晓峰等〔1〕在大鼠小肠缺血再灌注损伤的实验研究中发现,经肠系膜上动脉间断灌注1、6-二磷酸果糖,可以改善细胞的能量代谢,为细胞提供能量,同时具有稳定细胞生物膜、减少脂质过氧化物和氧自由基生成而起到对肠缺血再灌注损伤的保护作用.除此之外,在缺氧期吸入氧气,也可以明显改善肠缺血再灌注后的组织损害.高压氧能够抑制肠缺血再灌注损伤过程中TNF-α的产生,并能抑制中性粒细胞在肺中的聚集,因而能够减轻肠缺血再灌注的损伤〔2〕.O’Donnel等〔3〕则发现在缺血时的肠腔内持续注入携氧的过氟碳的保护作用,他们在肠缺血再灌注的模型中观察到:在缺血60分 Ξ收稿日期:2004-12-16 作者简介:马玉山(1973-),男,内蒙古通辽市人,内蒙古医学院在读硕士研究生(2003级).
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
第十三章缺血-再灌注损伤 一、选择题： 1.钙反常时细胞内钙超负荷的主要途径是 A. ATP减少使钙泵功能障碍 B. Na+-Ca2+交换异常 C. 电压依赖性钙通道开放增加 D. 线粒体膜流动性降低 E. 无钙灌流期出现的细胞膜外板与糖被表面的分离 2.下列哪项与再灌注时钙超载的发生无关 A．Na+/Ca2+交换加强 B．Na+ /H+交换加强 C．儿茶酚胺升高 D．细胞膜外板与糖被膜分离 E．钙泵功能加强 3.最易发生缺血再灌注损伤的器官是 A．肝 B．肺 C．肾 D．心 E．胃肠道 ?最易发生缺血再灌注损伤的器官是 A．肝B．肺C．肾D．心E．胃肠道1.A 型选择题 （1 ）最活泼、最强力的氧自由基是 A. O· 2 B. H 2 O 2 C. OH· D. LO· E. LOO· （2 ）认为再灌注损伤实为缺血的继续和叠加的学说为 A 钙超载B. 自由基损伤C. 无复流现象D. 白细胞作用E. 能量代谢障碍（3 ）缺血－再灌注性心律失常最常见的类型 A. 房性心律失常 B. 室性心律失常 C. 房室交界部阻滞
D. 房室传导阻滞 E. 房颤 （4 ）下述情况可使氧反常损伤的程度加重，除了 A. 缺氧的时间越长 B. 缺氧时的温度越高 C. 缺氧时酸中毒程度越重 D. 重给氧时氧分压越高 E. 再灌时pH 纠正缓慢 （5 ）有关自由基的错误说法是 A. 自由基是具有一个不配对电子的原子、原子团和分子的总称 B. O· 2 是其他活性氧产生的基础 C. OH·自由基的产生需要有过渡金属的存在 D. 体内的自由基有害无益 E. 自由基的化学性质极为活泼 （6 ）导致染色体畸变、核酸碱基改变或DNA 断裂的自由基主要为 A. O· 2 B. OH· C. H 2 O 2 D. LO· E. LOO· （7 ）缺血－再灌注时细胞内氧自由基的生成增加不见于 A. 中性粒细胞吞噬活动增强 B. 儿茶酚胺的增加 C. 黄嘌呤氧化酶形成减少 D. 细胞内抗氧化酶类活性下降 E. 线粒体受损、细胞色素氧化酶系统功能失调 （8 ）主要由白细胞释放的具有最强趋化作用的炎症介质是 A.C 3a 、C 5a B.C 5b67 C.LTB 4 D. 巨噬细胞趋化因子 E. 纤维蛋白肽B （9 ）一般认为，心肌细胞膜上何种钾离子通道是缺血预适应心肌保护的终效应器 A. 瞬时外向电流钾通道（I to ） B. 内向整流电流钾通道（I K1 ） C.ATP 敏感钾通道（KATP ） D. 延迟外向电流钾通道（I K ） E. 乙酰胆碱敏感钾通道（IKAch ） 答案：1.C 2.C 3.B 4.E 5.D 6.B 7.C 8.C 9.C 二、名词解释： 1.Free oradical 2.Ischemia/reperfusion Injury
抗氧化剂在缺血再灌注损伤中对大鼠肠粘膜的保护作用 目的探讨预先肠道给予抗氧化剂对大鼠肠缺血再灌注损伤小肠粘膜的保护作用。方法使用75只成年雄性SD大鼠，采用生理盐水、维生素C、维生素E 和后两者的组合进行实验干预。依据肠血管供应游离肠管，通过夹闭供应该段肠管的血管进行缺血再灌注造模。在未夹闭、缺血末期及再灌注期每15min取材。分时段取材后进行定量、定性分析。结果与其他组比较，使用维生素E组和维生素E、维生素C联合组呈显着衰减缺血再灌注损伤作用。最后研究表明以上两组与控制组和维生素C组比较，能显著的减少绒毛高度的降低及中性粒细胞的浸润。结论在缺血再灌注实验模型中，维生素E做前期处理能够减弱I/R对大鼠小肠粘膜的损伤，减少绒毛高度的降低、衰减中性粒细胞的浸润。 标签：缺血；再灌注；再灌注损伤；抗氧化剂缺血组织血流量恢复会造成比原先缺血引起更大的损伤，这个过程称为缺血再灌注（I/R）损伤。I/R时，小肠是最容易受损伤的。虽然所涉及的机制尚未完全阐明，但相信，氧化应激的炎症介质发挥重要的作用。由于超氧化物（ROS）参与I/R损伤的发生，多种抗氧化剂都进行过研究，其中就包括维生素C、维生素E。维生素C是一种水溶性、还原性的抗氧化劑，常被用来对抗I/R造成的损伤。维生素E是一种脂溶性抗氧化剂，通过稳定细胞膜的不饱和脂肪酸的来对抗氧化应激反应。因此，维生素E 能减少组织ROS反应，增加组织抵抗膜质过氧化的作用，维生素C、E联合应用有协同效应。本研究的目的是用维生素C、E前期处理实验大鼠，通过空肠的形态标准来评估其对I/R小肠粘膜的积极作用。 1资料与方法 1.1空肠缺血再灌注模型使用75只体重介于224~261g的成年健康雄性SD 大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉后剖腹探查。游离肠系膜动、静脉，长度足够放置血管夹即可。以游离动脉供应的肠段作为取材部位。在未夹闭血管前取材一次（BC）。为了避免其他因素影响小肠绒毛的高度，达到彻底地模型效应，游离肠段3cm左右，并切断所有的侧支循环。夹闭肠管血管1h后，进行第2次取材（BI），后移去血管夹，恢复血流，分别在再灌注15min（RB15）、30min（RB30）、45min （RB45）和60min的（RB60）取材。 1.2实验分组75只大鼠随机分为5组：T组大鼠行剖腹探查并切除选定肠管，不做缺血再灌注损伤模型。对照组行剖腹探查术，并行肠管缺血再灌注造模，预定时间点取材，没有预先处理。C组造模，术前4d通过喂养的方式给予250mg/kg 维生素C。E组也造模，术前4d与C组相同的方式给予60mg/kg维生素E。C+E 组行与对照组相同的手术，并喂养与C组、E组相同计量的两种药物。 1.3损伤的指标用定量分析方法来评估缺血再灌注的损伤。肠管损伤程度用组织切片绒毛的高度、中性粒细胞浸润的程度来评价。为减小误差及偏倚，所有标本由本实验室被双盲的技术人员用Chiu等人提出的分类标准进行评估。使用光学显微镜在10个随机镜头视野统计绒毛的高度分布，单位为毫米（mm）。通
第十章 缺血－再灌注损伤 一、选择题 【A 型题】 1．缺血再灌注损伤最常见于下述哪一器官? A ．心肌 B ．脑 C ．肝 D ．肾 E ．肠 2．最活泼有力的氧自由基是： A ．- ?2O B ．H 2O 2 C ．OH · D ．LO · E ．LOO · 3．认为再灌注损伤实为缺血的继续和叠加的学说为： A ．钙超载 B ．自由基损伤 C ．无复流现象 D ．白细胞作用 E ．能量代谢障碍 4．缺血-再灌注性心律失常最常见的类型： A ．房性心律失常 B ．室性心律失常 C ．房室交界部阻滞 D ．房室传导阻滞 E ．房颤 5．氧反常损伤程度加重，不见于： A ．缺氧的时间越长 B ．缺氧时的温度越高 C ．缺氧时酸中毒程度越重 D ．重给氧时氧分压越高 E ．再灌注时pH 纠正缓慢 6．有关自由基的错误说法是： A ．自由基是具有一个不配对电子的原子、原子团和分子的总称 B ．- ?2O 是其他活性氧产生的基础 C ．OH ＾ 自由基的产生需有过渡金属的存在 D ．体内的自由基有害无益 E ．自由基的化学性质极为活泼 7．钙反常时细胞内钙超载的重要原因是： A ．ATP 减少使钙泵功能障碍 B ．Na + -Ca 2+ 交换增加 C ．电压依赖性钙通道开放增加 D ．线粒体膜流动性降低 E ．无钙灌流期出现的细胞膜外板与糖被表面的分离 8．导致染色体畸变、核酸碱基改变或DNA 断裂的自由基主要为： A ．- ?2O B ．OH · C ．H 2O 2 D ．LO · E ．LOO · 9．缺血一再灌注时细胞内氧自由基生成增加不见于： A ．中性粒细胞吞噬活动增强 B ．儿茶酚胺增加 C ．黄嘌呤氧化酶形成减少 D ．细胞内抗氧化酶类活性下降 E ．线粒体受损、细胞色素氧化酶系统功能失调 10．自由基对机体的损伤最主要是通过： A ．蛋白质交联 B ．直接损伤核酸 C ．引发葡萄糖交联 D ．脂质过氧化引起损伤 E ．引起染色体畸变
中性粒细胞介导肠道缺血再灌注损伤中的作用 郄文斌屠伟峰 广州军区广州总医院全军临床麻醉中心（广州510010） 严重的创伤、感染、休克均可伴有不同程度肠道血流量减少，导致肠功能障碍，在此基础上随着血供的恢复，组织器官的损伤反而加重，表现为肠道缺血/再灌注(GIR) 损伤。肠道是缺血/再灌注损伤（IRI）最敏感的组织之一[1]。业已证实，肠缺血再灌流是严重创伤、烧伤后全身性炎症反应综合征(SIRS)及多器官功能障碍综合征(MODS)发生、发展的重要诱因[2]。肠道系统不仅仅是体内最大免疫器官，而且是激发和诱生各种炎性介质和细胞因子、介导嗜中性粒细胞（PMN）激活的中心器官“motor”。有实验表明：PMN是引起组织损伤，乃至多器官功能衰竭(MOF)的关键细胞[3,4]。PMN的激活趋化、聚集于靶组织与释放大量炎性介质和细胞因子是导致局部组织损伤和远离脏器损伤发生的主要途径。 一PMN的激活和趋化 正常生理状况时，组织中较少见PMN，而循环系统血液中的循环粒细胞、边缘粒细胞以及储存在骨髓中大量的成熟PMN，在激活因子和趋化因子作用下被激活，继而侵入炎症组织中。肠道缺血再灌注后肠血管可能作为“预激床”，在激活因子（包括细菌、毒素、免疫复合物、补体、氧自由基、白介素类等）作用下激活循环中的PMN。其机理为激活因子通过与PMN细胞膜表面的相应受体结合（如C5a与PMN表面C5a受体结合），将信号传递给GTP结合蛋白，特异性磷酸脂酶激活磷脂酰肌醇，并在此酶的作用下，产生一系列代谢产物，激活蛋白激酶Ｃ，引起细胞内Ca2＋浓度升高，从而激活PMN[3,5]。激活的PMN在趋化因子(包括补体C3a，C5a，IL-8，LPS和激肽释放酶等)和粘附分子的作用下与血管内皮细胞(VEC)粘附并进入组织中。 二PMN对内皮细胞（EC）的粘附和穿越 激活的PMN与血管内皮细胞（VEC）相互作用形成的粘附连锁反应是PMN聚集、活化的关键，是导致组织损伤的先决条件[6,7]。在急性炎症损伤过程中，PMN粘附、穿越VEC向炎症部位游走的分子基础是PMN与VEC表面粘附分子的相互作用[8]。粘附分为再灌注早期PMN与沿着VEC表面慢速滚动的不稳定粘附以及随后的牢固粘附两个阶段。现已知的粘附分子主要有选择素家族、整合素家族和免疫球蛋白超家族。 2.1 选择素家族(Selectin) 选择素家族成员是介导白细胞和EC早期粘附过程的关键粘附分子。此族分子为高度糖基化的单链跨膜糖蛋白，分子量为90～140ku。主要包括L选择素，E选择素和P选择素。L-selectin表达于白细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)表面，当白细胞活化后通过蛋白水解方式释放出来,其功能为介导PMN与VEC的粘附以及淋巴细胞向周围淋巴结
第十章缺血－再灌注损伤 一、选择题 【A型题】 1．缺血再灌注损伤最常见于下述哪一器官? A．心肌 B．脑 C．肝 D．肾 E．肠 2．最活泼有力的氧自由基是： A．-? 2 O B．H2O2 C．OH· D．LO· E．LOO· 3．认为再灌注损伤实为缺血的继续和叠加的学说为： A．钙超载 B．自由基损伤 C．无复流现象 D．白细胞作用 E．能量代谢障碍 4．缺血-再灌注性心律失常最常见的类型： A．房性心律失常 B．室性心律失常 C．房室交界部阻滞 D．房室传导阻滞 E．房颤 5．氧反常损伤程度加重，不见于： A．缺氧的时间越长 B．缺氧时的温度越高 C．缺氧时酸中毒程度越重 D．重给氧时氧分压越高 E．再灌注时pH纠正缓慢 6．有关自由基的错误说法是： A．自由基是具有一个不配对电子的原子、原子团和分子的总称 B．-? 2 O是其他活性氧产生的基础 C．OH＾自由基的产生需有过渡金属的存在 D．体内的自由基有害无益 E．自由基的化学性质极为活泼 7．钙反常时细胞内钙超载的重要原因是： A．ATP减少使钙泵功能障碍 B．Na+-Ca2+交换增加 C．电压依赖性钙通道开放增加 D．线粒体膜流动性降低 E．无钙灌流期出现的细胞膜外板与糖被表面的分离 8．导致染色体畸变、核酸碱基改变或DNA断裂的自由基主要为： A．-? 2 O B．OH· C．H2O2 D．LO· E．LOO· 9．缺血一再灌注时细胞内氧自由基生成增加不见于： A．中性粒细胞吞噬活动增强 B．儿茶酚胺增加 C．黄嘌呤氧化酶形成减少 D．细胞内抗氧化酶类活性下降 E．线粒体受损、细胞色素氧化酶系统功能失调 10．自由基对机体的损伤最主要是通过： A．蛋白质交联 B．直接损伤核酸 C．引发葡萄糖交联 D．脂质过氧化引起损伤 E．引起染色体畸变 11．下面哪个不是活性氧? A．NO B．-? 2 O C．OH· D．CO2 E．LOO·
第十章缺血－再灌 注损伤 一、单选题 1. pH 反常是指（） A. 缺血细胞乳酸生成增多造成p H 降低 B. 缺血组织酸性产物清除减少，p H 降低 C. 再灌注时迅速纠正缺血组织的酸中毒反而会加重细胞损伤 D. 因使用碱性药过量使缺血组织由酸中毒转变为碱中毒 E. 酸中毒和碱中毒交替出现 2．最易发生缺血-再灌注损伤的器官是（） A ．心 B ．肝 C ．肺 D ．肾 E ． 胃肠道 3．下述哪种物质不属于活性氧（） A.O2 - 。 B.H2 O2 C.OH ? D.1O2 E.L ? 4．下述哪种物质不属于自由基（）A. O2 - 。 B.H2O2 C.OH ? D.LOO ? E.Cl ? 5．膜脂质过氧化使（） A.膜不饱和脂肪酸减少 B.饱和脂肪酸减少 C.膜脂质之间交联减少 D.膜流动性增加 E.脂质与蛋白质的交联减少 6.黄嘌呤脱氢酶主要存在于（） A. 血管平滑肌细胞 B. 血管内皮细胞 C. 心肌细胞 D. 肝细胞 E. 白细胞
7. 黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶需要（） A. Na + B. Ca 2+ C. Mg 2+ D. Fe 2+ E. K+ 8．O2- 》与H2O2 经Fe nt on 反应生成（） A. 1O2 B. LOO C. OH D. H2 O E. ONOO- 。 9 ．呼吸爆发是指（）A．缺血- 再灌注性肺损伤B．肺 通气量代偿性增强C．中性粒细胞氧自由基生成大量增加D．线粒体呼吸链功能增加E．呼吸中枢兴奋性增高10．破坏核酸及染色体的主要自由基是（） A. O2 - B. H2 O2 C. OH ? D. 1O2 E. LOO ? 1 1. 再灌注时自由基引起蛋白质损伤的主要环节是（） A. 抑制磷酸化 B. 氧化巯基 C. 抑制蛋白质合成 D. 增加蛋白质分解 E. 促进蛋白质糖基化 1 2. 自由基损伤细胞的早期表现是（） A. 膜脂质过氧化 B. 蛋白质交联 C. 糖键氧化 D. 促进生物活性物质生成 E. 减少AT P 生成 13．再灌注时细胞内钙升高最主要是因为（）A．细胞膜通透性增高B．线粒体内钙释放C．肌浆网钙释放 D．Na+/ Ca2 + 交换蛋白反向转运增强E．Na ＋/ H＋交换增强14．再灌注时激活细胞Na＋/ Ca2＋交换的主要因素是（）A．细胞内高Na ＋ B．细胞内高H+ C．细胞脂质过氧化D．P KC 活化E．细胞内高K+
肠缺血再灌注损伤及缺血预适应处理的干预作用 研究背景： 缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI) 是指各种原因导致组织器官缺血时, 会引起细胞代谢障碍和组织结构出现破坏, 而当血供恢复时, 组织及细胞损伤反而出现加重的现象称为。微血管通透性增加、组织间质水肿、血管调节机制受损及炎症细胞浸润与缺血再灌注所引发的器官功能障碍相关。肠缺血再灌注（intestinal ischemia reperfusion，IIR）损伤是由多种临床情况引起的，如出血性休克、败血症、严重创伤、绞窄性肠梗阻和急性肠系膜缺血等，具有高发病率和死亡率的一种常见临床问题。IIR 会导致不可逆转的组织损伤，血流恢复后通过诱导细胞凋亡、炎症反应及氧化应激又会进一步加重损，严重者还会引起全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至进一步诱发多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF）。因此，防治肠缺血再灌注损伤是危重病研究领域的重点之一。 缺血预适应（ischemic preconditioning, IPC）是短期缺血应激使机体对随后长时间的缺血再灌注损伤产生明显保护作用的一种适应性机制进行反复的、短暂的、无创伤、无危害的缺血预适应训练，能够激发人体免疫系统的应急机制，产生和释放内源性保护物质（如：腺苷、缓激肽、一氧化氮等，这些物质参与保护心肌和能量代谢）减轻和抵抗随后更长时间因为人体缺血缺氧造成的损伤。故本次研究的目的是探究不同的缺血预处理方法对肠道I / R损伤的可能保护作用。 材料与方法： 1.动物与分组： 中国家兔16只，雌雄各半，随机分为4组，分别为假手术组（只进行开腹手术，辨认肠系膜上动脉，不结扎）；对照组（进行肠系膜上动脉根部夹闭及复灌）；预适应处理A组（先进行缺血预处理，方法为夹闭5min开放5min，循环3次，然后行肠系膜上动脉夹闭及复灌）；预适应处理B组（先进行缺血预处理，方法为夹闭20min开放5min，循环3次，然后行肠系膜上动脉夹闭及复灌）。 2.模型复制： （1）根据文献[3]方法，复制家兔肠缺血再灌注模型，具体如下 家兔经耳缘静脉注射乌拉坦（0. 005 mL/g）麻醉后，仰卧固定于手术台上。腹部正中线自剑
1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研 究进展
医学院检验系，广东广州510182;2.广州医学院第一附属医院，广东广州510120) 【关键词】全脑缺血再灌注动物模型实验研究进展 心脏骤停(CA)是急诊医学常见的急症之一，因其居高不下的致死率及致残率给社会和家庭造成严重威胁，所以心肺脑复苏是现代医学研究的热点课题。心搏骤停是指心跳及呼吸突然停止，血液循环终止。由于脑细胞对缺氧十分敏感，循环停止4～6 min脑组织即可出现不可逆性损害[1]。面对突如其来的心脏骤停，目前最有效的治疗方法是心肺复苏。但是即使复苏后，心脏恢复了搏动，但脑功能的恢复是心肺复苏成功的关键。一般心脏停止搏动，脑缺血、缺氧立即发生，如超过4～6 min就可以出现不可逆的大脑损害。心脏停搏时间长，如>8 min以上，大脑功能很难恢复，成功率极小。有学者研究认为，心脏停搏后，约50%左右患者死于中枢神经系统损害，即脑死亡。即使心、肺复苏成功，生命保留，仍约有20%～50%左右存在着不同程度的脑功能障碍，成为植物状态(植物人)或痴残等[2]。 在成功进行心肺复苏后有20%～40%的患者遗留下永久性神经损害[3]。鉴于脑保护和脑复苏的重要性，近年来对缺血性脑损伤的机制进行了大量的研究，脑是一个血流量大、代谢旺盛的器官，其功能几乎全靠葡萄糖的氧化代谢。心脏骤停后引起的脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血再灌注损伤，其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋亡等机制[4]。所以心肺复苏的最终目的是脑复苏。 大量研究旨在寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物，并且已经在动物模型上获得一定成功，但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注可预期的情况。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法，然而再灌注也可能加重损伤。在再灌注早期，大量活性氧自由基的产生和钙超载导致了缺血再灌注损伤。所以近年来围绕心肺脑复苏的保护机制及其方法成为专家学者们研究的热门，而建立有效、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有多种，包括：二血管阻断加低血压法、四血管阻断法、三血管阻断法、颈动脉负压分流法。国内文献报道用四血管阻断法比较多[5]，国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道，但更偏向于后者[6]。对比不同建模方法在实验过程中所显露出的特性，分析并总结各自的优缺点。选择能较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型的方法，为脑复苏的深入研究提供良好的实验基础。本文将从实验的可操作性、成功率、发展前景等方面对各类建模方法进行综述。 1制作全脑缺血再灌注动物模型及效果的判定 1.1全脑缺血再灌注模型模拟心搏骤停
第十章缺血－再灌注损伤 一、单选题 1.p H反常是指（） A.缺血细胞乳酸生成增多造成p H降低 B.缺血组织酸性产物清除减少，p H降低 C.再灌注时迅速纠正缺血组织的酸中毒反而会加重细胞损伤 D.因使用碱性药过量使缺血组织由酸中毒转变为碱中毒 E.酸中毒和碱中毒交替出现 2．最易发生缺血-再灌注损伤的器官是（） A．心 B．肝 C．肺 D．肾 E．胃肠道 3．下述哪种物质不属于活性氧（） A.O2-。 B.H2O2 C.O H· D.1O2 E.L˙ 4．下述哪种物质不属于自由基（） A.O2-。 B.H2O2 C.O H· D.L O O˙ E.C l˙ 5．膜脂质过氧化使（） A.膜不饱和脂肪酸减少 B.饱和脂肪酸减少 C.膜脂质之间交联减少 D.膜流动性增加 E.脂质与蛋白质的交联减少 6.黄嘌呤脱氢酶主要存在于（） A.血管平滑肌细胞 B.血管内皮细胞 C.心肌细胞 D.肝细胞 E.白细胞 7.黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶需要（） A.N a+ B.C a2+
C.M g2+ D.F e2+ E.K+ 8．O2-》与H2O2经F e n t o n反应生成（） A.1O2 B.L O O C.O H D.H2O E.O N O O-。 9．呼吸爆发是指（） A．缺血-再灌注性肺损伤 B．肺通气量代偿性增强 C．中性粒细胞氧自由基生成大量增加 D．线粒体呼吸链功能增加 E．呼吸中枢兴奋性增高 10．破坏核酸及染色体的主要自由基是（） A.O2- B.H2O2 C.O H· D.1O2 E.L00˙ 11.再灌注时自由基引起蛋白质损伤的主要环节是（） A.抑制磷酸化 B.氧化巯基 C.抑制蛋白质合成 D.增加蛋白质分解 E.促进蛋白质糖基化 12.自由基损伤细胞的早期表现是（） A.膜脂质过氧化 B.蛋白质交联 C.糖键氧化 D.促进生物活性物质生成 E.减少A T P生成 13．再灌注时细胞内钙升高最主要是因为（） A．细胞膜通透性增高 B．线粒体内钙释放 C．肌浆网钙释放 D．N a+/C a2+交换蛋白反向转运增强 E．N a＋/H＋交换增强 14．再灌注时激活细胞N a＋/C a2＋交换的主要因素是（）A．细胞内高N a＋ B．细胞内高H+ C．细胞脂质过氧化 D．P K C活化 E．细胞内高K+
线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究 马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1 （1 辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032；） 摘要①目的建立一种比较系统，操作简单，成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型，达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。 ②方法成年健康雄性 SD大鼠40只，参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只，假手术组20只。本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法，并且此方法的再灌注效果较为明显。 关键词动物模型；脑缺血；再灌注；线栓法 Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1 (1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride（TTC）Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious. Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture 脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径，因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。早在1986年，日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1995年，我国也出现了相关的报道。目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。国内一些学者对此方法又进行了改进，但仍存在一些问题，例如：手术操作过程复杂，实验动物死亡率较高，而模型成功率较低，并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点，就是对该模型的制作过程描述得过于简单，读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。本文旨在前人研究的基础上，建立一种操作简单，成功率高的 MCAO再灌注模型，并将此方法图文并茂的展现给读者，使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。 1 材料与方法 1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只，体重280-320g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为模型组和假手术组，每组20只。四氮唑红(TTC)染料，由沈阳市博尔美试剂公司提供。 1.2 栓塞线的制备栓塞线采用 2.5号钓鱼线，直径0.25-0.28mm。将其剪成4cm长，一端用细砂纸打磨成半球形（需在显微镜下筛选），再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm
线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法 Pipilulu 目录： 第一部分线栓模型制备理论及经验 1插线法局灶性脑缺血模型简介 2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置 3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（zhuqing0506战友） 4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会（bladeflyer战友） 5 我的做MCAO模型的一些体会（intelligentwang战友） 6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO）制备技巧（ysf2k战友）第二部分线拴模型制作过程（雨后天晴战友） 第三部分灌注取脑（pipilulu战友） 第四部分 TTC染色（pipilulu战友）
前 言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文 献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作 的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样 的感觉）。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO 模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代Koizumi和Longa创用了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 1994年Huang等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997年Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59]，王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺，存在着下列不足：①线栓造模过程是非直视下的手术，血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物，可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。