第一部分基础理论知识
第一章基础实验技术
第一节基本原则
所有科学知识和理论都来自实践观察和实验。实践工作是大多数课程和评价工作的重要部分。本书旨在为大家提供一本易学易用的参考资料，便于掌握与现代生物技术相关的基本实验技术与技能。在实验课中培养起来的能力对你完成学业十分有益，并对你将来从事科学和其他工作有深远影响。
培养的实践技能——包括：a) 观察与测量；b) 记录数据；c) 设计实验；d) 分析与解释数据；e) 汇报/报告。
一、充分准备
要点：实验前准备越充分，受益越多。不要认为实验课上一切都已由老师准备好了，自己便不用动手了。
切记几点：
1. 预习实验内容，明确实验目的和有关的实验技能。该实验与你当前的课堂学习有关吗？是否需要复习或预习这部分内容？
2. 实验时带上课本，以便解答实验中遇到的问题。
3. 在开始实验时之前考虑一下可能出现的安全问题及应采取的预防措施。
4. 实验过程中要保持桌面整洁；实验课本要靠近但不要放在工作区内；把清洁的玻璃器具等放在实验桌的一边，用过的器具放在另一边。
5. 尽快完成实验报告并按时上交。
6. 尽快补做遗漏的实验，最好在下次实验之前补上。
二、基本要求
(一)记录实验结果
活页装订的A4纸记事夹使用起来灵活方便，可以在适当的位置插入实验记录或实验图表。但其主要缺陷是容易丢失一张或多张记录纸。使用记事本可避免此类问题，但交替的线条/图表或线条/空白纸张会比较浪费——可根据需要将绘图纸粘贴在笔记本中。
建议准备一支质量较好的HB铅笔或活动铅笔记录原始数据或绘制图表等，以便于修改；用黑色的油性记号笔在玻璃器皿上做标记；优质的精细绘图/写字笔用于图表定稿；用透明直尺(边缘未破损)绘图，这样在绘制时能看清尺下面的数据点/内
容。
(二) 制作高级实验报告
在许多实验报告和课题研究中，需要使用较高级的表达设备，如计算机绘图软件。在课题报告和墙报展示时，选用容易阅读的字体，并认真设计版面和内容。另外，也可使用精细的绘图笔和字母/符号印章(如Letraset?产品)制作报告，但这种方法比使用计算机花费更多的时间。
可用油性记号笔和醋酸纤维胶片为口头报告制作透明胶片。用计算机软件制作的课题报告也可以用激光打印机直接打印在特制醋酸纤维胶片或直接制作在35mm 幻灯片上。报告内容也可直接影印到特制醋酸纤维胶片上。
第二节健康与安全
健康与安全工作法要求研究机构为工作人员提供安全无害的工作环境，并对工作人员进行安全操作的宣传和培训。学生和职员必须十分注意自己和他人的健康与安全，正确使用一切安全设施。
要点：时刻谨记一切实验工作都必须在安全条件下进行，将对自己和他人的危害降到最小。安全工作，人人有责。
一、基本概念
1. 危险：一种物质或生物试剂能引起毒害的能力。
2. 危险性：在特定条件下，某种物质或生物试剂产生危害的可能性。
区别危险与危险性：水的危险之一是能使人溺死，而几滴水使人溺死的危险性是微乎其微的。
二、危险性评估
开展安全工作的第一步通常是进行危险性评估。内容包括：
1. 实验物质固有的化学、生物、物理的危险品及其最大的接触限量(maximum exposure limits, MELs)或职业性接触标准(occupational exposure standards, OESs)。化学药品生产商提供特定化学物质危害程度的列表，而病原(致病)微生物则根据其致病能力进行分类。
2. 危险性。要考虑到化学物质的使用量、使用方式及侵入人体的可能途径(吸入摄取，皮肤接种或吸收)。在此，要区分特定物质的固有危险性与其在特定实验中的危险性。
3. 处于危险环境中的人可能接触危险物质的途径，包括意外泄露(溅溢)。
4. 阻止或控制有害物品泄露措施。理想的方法是使用无害或微害的替代品。如果不行，则要采取适当的控制措施，如通风橱或其他操作间。除此之外，还要使用自我保护设施(如实验工作服、防护镜)。同时考虑废弃物的安全处理措施。
必须记录危险评估的结果，必须告诉在危险环境中工作的人员有关的安全知识。大多数实验室的危险评估由负责人提前进行：要把将危险降低到最小的必要知识写入操作规程。学生在实验前应了解系里提供的安全知识，并阅读有关资料。在实验开始时要与安全工作的负责人密切联系，了解主要的危险与危害所在。在课题研究中，开展实验前你需要与主管人员一起进行危险性评估。
除了专门的危险性评估外，大多数研究机构都有安全手册，给出了安全工作的一般细则以及安全负责人、急救员、医院等的姓名、名称和电话号码。切记要阅读和遵守这些规则。
三、实验室工作的基本规则
1．保证熟悉如何处理着火事故，包括安全出口通道、怎样启动报警器、在哪里集中离开着火的建筑物等。切记。在任何时候人身安全是第一位的：非安全境地不要试图救火。
所以实验室都出示通知，告诉你万一发生意外/事故在哪里可找到急救箱、与谁联系等。事故后要向主管人员报告事故过程，包括看起来无关紧要的事故。管理人员将按照安全法规进行正式记录。
2．时刻穿着保护衣——整洁的实验服(扣好纽扣)，还有防护镜(对眼睛有害的场合)。严禁在实验室吸烟、饮食，以免吸入或误食污染物。
3．使用移液管时，不要用嘴吸取液体，应使用洗耳球。
4．小心使用玻璃仪器。实验室的许多小事故都是由于粗心使用玻璃仪器引起的。使用玻璃仪器引起的。使用玻璃器皿必须注意以下几点：
1)在容易引起玻璃器皿破裂的操作中，如减压处理、加热溶液等，要戴防护镜。
2)用“柔和”的酒精灯火焰加热玻璃器皿——可避免因局部过热而使玻璃破碎。
移取热玻璃器皿时用钳子或戴上隔热手套。
3)不要使用有缺口或裂缝的玻璃器皿——这些器皿轻微用力就会破碎，应弃于碎
玻璃缸中。
4)持取大的试剂瓶时，不要只取颈部，应该用一只手托住底部，或放在托盘架中。
5)连接玻璃管或将玻璃管插在橡胶中时，要戴厚手套。
6)塞子不要塞得太紧，否则难以拔出。如果需要严格密封，可使用带有橡胶或塑
料塞的螺口瓶。
7)破碎的玻璃器皿要极其小心地彻底清除——戴上厚手套用废纸包起来，丢在指
定的废物缸里。
5．了解危险化学药品的警告标志。
6．使用危险化学药品要在通风橱中操作。保证通风橱正常工作，必要时只打开前门：通风橱上一般标有最大开口限度。
7．危险药品始终用最小剂量。
8．操作时有条理，干净利落，考虑周密，尽可能避免事故发生。
9．每次实验完毕要进行彻底清理。这是安全保证的重要方面，也可培养对实验工作负责的态度。
第三节液体的量取
一、液体的量取和分配
计量仪器的选择应根据量取液体的体积大小而定，同时要考虑量取的准确度和量取的次数(表3.1)。
表3.1 计量仪器的选择标准
计量仪器最佳量程准确度重复测量是否方便滴管30μL ~ 2mL 低极方便
量筒5~ 2000mL 中等方便
容量瓶5~ 2000mL 高方便
滴定管 1 ~ 100 mL 高极方便移液管/移液器 5 ~ 25μL 高极方便
微量注射器0.5~ 50μL 高方便
极高不方便称量任何量度(取决于天
平的准确度)
锥形瓶/烧杯25~5000mL 极低方便
某些液体可能引起的问题：
1. 高粘度的液体难以分液，转移时需要一定时间。
2. 有机溶剂挥发快，造成测量不准确：操作要迅速，快速密封容器。
3. 易产生泡沫的溶液(如蛋白质和去污剂溶液)较难量取和分液：操纵宜慢忌快，避免形成气泡。
4. 悬浮液(如细胞培养物)容易形成沉淀，移取前要充分混匀。
二、液体的盛放和储存
1. 试管：试管常用于颜色试验、小量反应、装培养基等、试管可经加热灭菌，试管帽或棉塞密封可保持无菌状态。
2. 烧杯：烧杯常作一般用途，如加热溶液、滴定等、烧杯壁上常有体积刻度，但不准确，只能用于粗略估计。
3. 锥形瓶：用于储存溶液，其底部较宽，稳定性号，瓶口较小，减少蒸发，易于密封。有的锥形瓶侧壁上也有体积刻度，但不准确。
4. 试剂瓶：具有螺口盖或圆形玻璃塞，可防止溶液蒸发和污染。
所有储存液都要清楚地标记，包括相应的危险信息(最好用橙色危险警告标签标记)。容器的密封方法要合适，如用塞子或封口胶密封。威防止试剂降解，溶液应存放在冰箱中，但使用前要恢复到室温。含有有机成分的溶液容易滋生微生物(除非溶液有毒或已经灭菌)，因此，用放置很久的溶液做出的实验结果不可靠。
三、玻璃器皿和塑料器皿的选择
记住以下几点：
1. 活性。塑料器皿易着火，易溶于有机溶剂，在相对低温时易变行，长期暴露在紫外线下会变化。有些增塑剂会从塑料中滤出，并显示生物活性。玻璃能吸收离子及其他分子，然后释放到溶液中，特别是碱性溶液。
2. 刚性和弹性。由于塑料容器用久了会变形，因此一般不用于计量液体。玻璃器皿壁塑料器皿易于破碎，这在离心时特别要注意。
3. 阻光度。玻璃和塑料在EMR光谱的UV范围内都有光吸收，因此在某些情况，如紫外分光光度测定时要用石英比色杯。
4. 废弃。塑料器皿比较便宜，经化学或微生物污染后常杯废弃。
四、玻璃器皿和塑料器皿的清洗
污染可能来自前次使用的药品残留成分或可能是洗涤后没有充分冲洗。使用前用蒸馏水或离子水彻底冲洗可以除去器皿上的灰尘和残留物质，这在定量研究中尤为
重要。冲洗后的器皿内不应残留液体。强碱性去污剂可以溶解酸性污物，酸性洗液可以清洗碱性污物。如果器皿上残留有机污物，可用工业酒精清洗。玻璃器皿可用次氯酸钠漂白剂或偏亚硫酸氢钠灭菌——用时按说明书稀释，用后用无菌水彻底清洗。另外，把玻璃器皿放在高压灭菌锅(121℃，15min)或干燥箱(160℃，3h)也可灭菌。
第四节实验室基本规程
一、化学药品的使用
(一) 安全方面
在实验课上，负责人有责任告诉你使用化学药品时可能存在的危险。在实际工作中，当使用一种不熟悉的药品时，首先要了解它的特性，特别是安全有关特性。为了方便日常实验操作，专职人员应评估药品的危险性并在实用手册列出有关安全的信息，如表3.1所示。使用任何化学物质之前，必须弄清是否需要采取安全防范措施并填写适当的表格以确认你完成了解其中的危险。你所在的系必须提供相关资料让你做到这一点。
表3.1 分子生物学实验中代表性的危险评估信息(包括DNA分离)
使用化学药品时安全要点有：
1. 把所有化学物质都当成具有潜在危险的物质看待。
2. 时刻穿好实验服，扣上纽扣。
3. 在开始实验工作之前，确认你知道哪里有安全设施，如洗眼池、灭火器、急救箱。
4. 使用有毒、刺激性或腐蚀性药品时，戴上手套和防护镜，在通风处进行操作。
5. 借助工具如移液管灯将接触药品的危险减到最小。
6. 使用易燃易爆物品时，杜绝任何火星。
7. 使用化学药品时，决不吸烟、吃或喝东西。
8. 给溶液贴上正确的标签。
9. 记下所有的溢出物并以适当方式将其清除干净。
10. 正确处理废弃的化学药品。
(二)试剂选择
化学药品有不同的纯度级别，一般在包装盒上标明。不同供应商对纯度等级的命名不同，目前没有统一的标准。高纯度的化学药品价格昂贵，有时要比一般药品贵得多，因此只有在必需的情形下才用它。如果你要订购药品，你所在的系对该手续会有详细的说明。
(三)配制溶液
溶液常以物质的浓度(如mmol· L-1或mol· m-3)或质量浓度(g · L-1或kg · L-1)配制：两者都可看做每一单位体积的数量，都可归为关系式：
浓度＝数量/ 体积
关系式中最重要的是清楚了解所涉及的单位，再配制溶液：对物质浓度而言，要知道化合物的相对分子质量，才能确定所需物质的质量。
例 3.1 怎样用固体药品配制一定浓度的水溶液？
1. 确定配制药品需要的浓度和要求的纯度。
2.确定配制溶液的体积。
3. 查出所用药品的相对分子质量(Mr)。即各组成元素的相对原子质量之和，这可在瓶子的标签上查到。如果所用药品含有结晶水，在计算所需药品质量时，结晶水应计算在内。
4. 算出要配的溶液中所需药品的质量。
假设要配制250 mL 0.1mol·L-1的NaCl。
(1) 首先统一单位。用mL或L(如250mL为0.25L)。
(2) 根据等式：0.1＝数量(mol)÷0.25，计算得到所需的摩尔数为0.1×0.25＝0.025mol。
(3) 将摩尔(mol)乘以相对分子质量，换算成质量单位g，NaCl的相对分子质量为
58.44。
(4) 因此，需称取0.025mol×58.44=1.461g，用蒸馏水溶解，配成250 mL溶液。
5. 准确称取所需的药品。如果所称的量太少而不够精确，可采用如下方法：
(1) 加大溶液体积。
(2) 配制母液，用时稀释。
(3) 或先称取质量，然后计算配制溶液的体积。
6. 把药品放在烧瓶或容量瓶中，加水到所需刻度线以下，如果有药品附在在称量纸或称量盘上，用水冲洗下来。
7. 必要时可加热、搅拌，使药品彻底溶解。可以通过观察晶体或粉末消失与否来确定。
8. 必要时在冷却后测量并调节pH值。
9. 定容至所需体积。如果浓度要求很精确，用容量瓶定容，否则用量筒。
(1) 用漏斗将溶液从烧杯转移到量筒中，避免溅洒。
(2) 加水，使凹液面达到刻度线。为了更精确，可用水冲洗原来烧杯来定容。
10. 转移溶液到试剂瓶或锥形瓶中，贴上标签。
需要配制的浓度由实验方案确定，药品的等级和供应商可能也要专门指定。实验成功可能有赖于使用同一厂家、相同质量的药品，如有关酶的工作。尽管配制时多配一点总是个好注意，因为在操作过程中可能会溅洒一些或在分配时会发生失误，但为了避免浪费，还是要仔细计算所需溶液的体积。尽量选择一个标准体积的器皿，这会使测量变得更容易。
用蒸馏水或去离子水配制水溶液，然后搅拌以确保化学药品充分溶解。用磁力搅拌器搅拌是最简便的方法，将磁条(搅拌棒)小心地放入烧杯中，防止溶液溅出，然后把烧杯放在搅拌盘中央，启动搅拌器，逐渐提高搅拌速度。当晶体或粉末溶解完全后，停止搅拌，抽出磁力搅拌棒。操作时小心，不要污染溶液并用蒸馏水冲洗搅拌棒。
对难溶的溶液可能要加热，但只有当你知道在所用温度下不会破坏药品时才能这样做。在加热时可用搅拌加热器使溶液混溶。待溶液冷却后才能测体积或pH值，因为他们受温度影响。
(四) 母液
当要配制一种不同浓度的系列溶液或含有共同成分的溶液时，母液(原液)很有用。如果同一溶液长期使用(如营养液)，配制母液也可省却不少工作。
母液比最终所需溶液的浓度大，经过稀释配成最终溶液。
稀释——用关系时[C1]V1=[C2]V2来确定体积或浓度。
二、配制一定浓度的稀释溶液
在分析工作中，经常要把母液稀释到一定质量浓度或摩尔浓度，可按以下步骤：
1. 用合适的工具精确量取一定体积的母液到容量瓶中。
表3.2 计量器的选择
2. 用溶剂定容至标准刻度——最后几滴用滴管加入，直到凹液面与标准刻度持平。
3. 充分混合。手握瓶子反复他颠倒。也可用磁力搅拌器搅拌(加磁条前先定容)。
对于精度要求不高的常规实验，所需的水溶液可用试管或烧杯代替容量瓶定容。此时，计算出所需母液和稀释剂的体积，假设最终体积为母液与稀释剂用量之和，那么，用1体积的母液加1体积的稀释剂酒可配成2倍体积的稀释液。稀释系数是母液的初始浓度与最终稀释液浓度之比。用稀释系数可推算出需要母液和稀释剂的体积。例如，假设要用4.0 mol· L-1的母液配制100 mL 0.2mol·L-1的NaCl，稀释系数为：0.2÷0.4＝0.05＝1/2(稀释20倍)。因此需要母液1/20×100=5mL，需要加入稀释剂19/20×100=95 mL。
三、配制系列浓度的稀释液
系列浓度的稀释液应用非常广泛，在仪器分析、微生物学和免疫学中绘制标准曲线时，常常需要将一个特定样品配成一定范围内的稀释液系列。可用多中方法：(一) 线性稀释
此时稀释液的浓度是相同的，如蛋白质含量为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg·mL-1的系列稀释液。这样的系列浓度可在分光光度法测定蛋白质或酶的浓度时用来绘制标准曲线。可用[C1]V1=[C2]V2来计算配制该系列中每一浓度稀释液所需母液的量，用稀释液总体积减去母液体积为稀释剂的体积。
(二) 对数稀释
系列溶液的浓度比是一常数，它取决于稀释梯度。这种稀释法用于需要配制浓度范围较大的系列溶液的情形，如生物活性物质的滴定，微生物悬浮液的平板计数、与浓度成对数关系的某一过程的分析。
最常见的例子有：
2倍稀释：即每一稀释液的浓度是它前一溶液浓度的一半(2倍梯度稀释，log2的稀释系列)。首先配制2倍于所需体积的最大浓度的溶液，然后量取一半到另一个装有同样体积稀释剂的容器汇中去，充分混匀，如此重复下去，便得到2倍稀释的一系列溶液，他们的浓度分别是原液的1/2, 1/4, 1/8, 1/16等(即分别稀释2, 4, 8,16倍等)。
10倍稀释：每一浓度是它前一浓度的1/10(10倍梯度稀释，log10的稀释系列)。首先，配制最大浓度的溶液(体积上至少多配10%)，量取需配溶液体积1/10的原液1份加到9份体积的稀释液中充分摇匀，如此充分下去，便得到浓度为原液的1/10, 1/100, 1/1000等的系列溶液(即分别稀释10，100，1000倍等)。用原液浓度乘以稀释系数可计算出溶液的实际浓度。
配制2倍或10倍稀释液系列时，最简单的做法是事先将适当体积的稀释剂分别加入一系列器皿中。在配制稀释液系列时，最关键的是要精确量取各种溶液的体积，如可以用校准过的移液管，否则任何不准确都会导致大部分稀释溶液的终浓度产生误差。
(三) 调和浓度稀释
系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数，如1, 1/2,1/3, 1/4, 1/5等。在依次排列
的器皿终加入体积逐步增加的稀释液，如在一组试管终分别加0，1，2，3，4和5倍体积的稀释剂，然后分别在每一试管终加入相同体积的母液，就得到每一浓度的稀释液。这种方法配制的稀释液没有因稀释转移带来的误差，但最大的缺点是这样的系列溶液浓度梯度是非线性的随着溶液系列增多，浓度梯度会越来越小。
在量取溶液到下一稀释液之前必须充分摇匀。每次稀释都要用干净的量筒以免污染，否则稀释前要彻底冲洗。每种溶液配好后都要贴上标签，否则容易混淆。确定需要的体积后，再逐份移到下一稀释液里去。记住如果体积要求严格从系列稀释液的最后一个里移去多余的那部份体积。
(四) 溶液混合与悬浮
可能用到各种设备，包括：
1. 磁力搅拌器和磁条。磁力搅拌器有各种形状和大小，有的搅拌器内含有加热器。再使用过程中，磁力搅拌速度可能会随仪器温度的升高而加快。
2. 漩涡混合器。适合少量溶液的剧烈振荡混合，如再一组试管中配制系列稀释液。小调节混合速度——如果速度太慢，试管只振荡而部产生涡流，混合就不充分；如果速度太快，试管会从手中滑落。
3. 摇床或水浴锅。用于在一定温度下的混合，例如长期培养、细胞生长研究。
滚动瓶。用于细胞培养中以保持柔和、持续地混合。
(五) 药品和溶液的储藏
不稳定的化学药品必须保存在冰箱或冷柜中。储藏在低温下的化学药品，使用时要特别小心：使用前要让药品及其包装恢复到室温，否则水蒸气会凝集在药品上。它可能使称量失去意义甚至毁坏药品。另一些容易吸潮的药品须保存在干燥器中。
(六) 混合物和溶液成分的分离
颗粒状固体(如土壤)可根据大小用筛子分离。在自动摇床上安装有一套筛网，筛孔大的在上面，一直摇动到样品分开为止。液体里的悬浮物可离心或过滤分离。各种规格的滤纸有不同的孔隙度和纯净度。真空过滤能加速过滤过程，用过滤管连接到过滤瓶中效果最好。用预先灭菌的小孔滤过滤是一种对少量溶液灭菌的好方法。可以用加热、加压旋转蒸发或冰冻干燥的方法将溶剂从溶液中蒸发。后两种方法对热不稳定的溶液特别有用，请参考生产厂家的使用说明。
四、天平的使用
现在数字式电子天平比机械式更受青睐：易于读数并且自我调零的特点意味着称量前能自动减去称量盘的质量。最常见类型的天平都能精确到1mg，称量范围从1mg到160 g，适用于大部分生物学实验。
标准自我调零天平的操作：
1. 检查天平是否水平放置，用调节脚(通常在仪器的后面)调节小泡到水平仪的中央。一定要给天平盖上干燥罩以保证称量准确。
2. 放一空容器在盘上，让读数稳定。如果物质比天平盘还大，注意物体不能接触天平或干燥罩，否则读书不准。按调零按钮，使读数为零。在容器中小心加入化学药品或物体(粉末药品要用大小合适的干净药匙舀取)。
3. 待读数稳定后，记下数据。
4. 如果称量时加多了药品，移去药品时要特别小心。先关掉天平，然后清理干净掉在天平上及其周围的药品。
大质量物体的称量要用精度合适的托盘天平。注意天平的量程：尽管绝大多数天平都有保护装置防止超载，超载也可能会损坏仪器。在野外，弹簧天平和电池供电的天平可能更适合。找一个避风处使用天平。有称量少到1μg的电子天平可称量极微量的物品，但这样的天平非常精致易损，使用时必须特别小心。
五、温度的测量与控制
(一)加热样品
加热样品时要小心：无论何时加热有机物都会发生火灾和被加热的液体烫伤的危险。应始终戴好防护镜。如果可能，使用具有温度调节装置的电搅拌加热器。如果使用酒精灯，应使火苗远离身体及衣服(长发扎在脑后)。酒精灯下垫一块不易燃烧的席垫以保护实验台面。不用时就关掉它。
可以用烘箱或干燥箱干燥样品和玻璃器具，它们的温度一般是可调控的。如果是干燥有机物后称干物质质量，调温到80℃可避免样品焦化。始终标出实际使用温度，因为它影响结果。通过称量核实水分已全部被赶走，直到恒重。
(二)冰冻样品
冰箱和冷柜的冷藏和冷冻温度大约是4℃和-15℃。反应物要求保持在接近0℃时，可用冰浴。许多部门都有制冰机供冰浴之需。如果用普通的盐和冰混合，温度可达到0℃以下。需要时用乙醇和干冰(固体CO2)混合，温度可达-72℃。为了快速
冷冻样品，可用钳子把样品浸入液氮中(-196℃)。操作时系好围裙戴上厚手套，防止液氮贱出冻坏皮肤。始终在通风良好的实验室进行操作。
(三)恒温保存
恒温室或恒温培养箱可用来使温度保持在所需的水平。经常检查温度计或温度记录仪来检测自动调温器精度是否达到研究的要求。为了控制温度在较小范围内变动，如氧电极，可使用水浴锅。它常常集加热元件、循环机械装置及温度调节装置于一体。用于环境温度调控的水浴锅有一冷却元件。
六、空气条件控制
(一) 气体组成
空气可以通过“U”形管或“Dreschel”瓶(其中装有适当的化学药品或溶液)“净化”成几种气体。
为了精确控制气体的浓度，可使用纯气体的储气瓶。通过控制各种气体的流速即得到特定比例的混合气体。储气凭顶端的调节栓。可让你调控气压(即调节流速)，可用调节栓上的控制钮或大小合适的扳手来调整。使用前先检查输出阀是否关闭(向逆时针方向转)，然后开启储气瓶(向顺时针方向转)——气瓶的读数盘告诉你瓶内的气压。打开防气钮(慢慢向顺时针方向转)，调节到需要的压力/流速。关闭时，倒序操作上述步骤。为控制液体中溶解的气体成分，要么在真空下除去气体，要么用另一气体赶气泡，如制备用于HPLC的无氧液体。
(二) 压力
有多种压力泵常用来给空气和液体加压或抽真空使之流动。每种泵都有各自的使用说明。许多实验室都有“真空泵”(抽气机)和空气压缩机，可用于真空过滤这样的实验步骤。用后一定要关闭阀门。要特别小心处于超低压或超高压的玻璃器皿。这些应当置于金属筐内，以最大限度地减少受伤的危险。操作过程中一直戴好防护镜。
七、时间测定
许多实验和观测都要仔细记时。大面盘的记时器使你能设置并遵循“实验时间”，省却从手表或时钟计算“实际时间”的许多麻烦。有的记时器可用来控制光照和温度的周期性变化。有的记时器计量经过的时间，而另一些倒记时到0，后一种记时器用处不大。
第二章数据分析
第一节测量与记录
数据是指对特定性质或差别的测量，可分为：
1. 定量的。每个数据是量化描述地，包括：①连续地，②不连续地(或分离地)，即只有数据值。分子生物学的许多变量(变量是指能够记录数值范围之一的任一特征或性质)都是连续的和定量的，如在质量、温度、时间和酶反应中产物的数量。
2. 等级的。数据可划分大小顺序。这些数据有量的等级，它们有时被称为“半定量数据”。这些等级不能被认为是真正的数字，他们不应被相加、平均等。
3. 定性的。每个数据被指定用于描述类别，如在基因杂交中的形态学特征，或一个样品中某种生物分子的存在与否。
变量可能是独立的或不独立的。通常，由实验者控制的变量(如时间、底物浓度、pH等)是独立的变量(自变量)，而被测量的变量(生物反应)是非独立变量(因变量)。有时，用这种方式去形容变量是不恰当的，它们也经常被认为是互相依存的。另外的数据组，通常被称为推断(或计算)数据，是从两次或更多次单独测量中计算出来的，包括比率、百分率和速率。
一、测量尺度
可以用不同标准来测量变量。
1. 名词性词。描述性特征的分类(如颜色)，这是有关定性数据的唯一标准。
2. 序数。这是数量等级的分类，从最小到最大，但在等级之间无假定相等的间隔。
3. 间隔。一些数量变量相对任意的0点有相等的单位间隔，如温度。
4. 比率。与间隔尺度相似，但0点表示该中特征的缺失，即是一个绝对的0。
你可以用多种方法去测量一个变量：如你可以用名词性的尺度如颜色(“蓝光”、“红光”等)来描述光；用等级的尺度，根据视明暗度的标准(1=阴暗，2=一般，3=明亮等)来测量光；还可以用比率尺度，根据幅照度(W·m-2，如在电磁辐射光谱中的波长范围)来测量光。总之，应该用比率尺度进行数量测量，这样你可最大限度地应用数学运算和统计程序。
二、准确和精确
准确是测量值或推论值向真实值的接近。而精确是重复测量之间的互接近程度，错误的平衡(即偏差)可以得到精确(重复性很好)而不准确(不真实) 的结果。除非测
量系统有偏差，否则精确会导致准确，如果不怀疑偏差的话，精确通常是实际考虑中的最重要因素。你可采用重复测量同一样品中的方法去研究任何测量系统的精确性；重复值越接近则测量越精确。
由于测量系统的局限性，绝对的准确和精确是不可能达到的。在出现的结果中避免虚假的准确是尤为重要的，包括那些在测量系统中所要求精确的位数。荡变换单位(如厘米到米)和推断数据尤其是计算器得出一个十进制的大数字结果时，这种错误是普遍发生的。
三、偏差(系统误差)
偏差是一种系统的或非随机的不精确，它是使用数字数据时最麻烦的困难之一。偏差可以时由刻度不标准的仪器造成，如一支错误的移液管，或是由于实验操作造成的，如在储存中酶活力丧失。测量的偏差也可由客观的或个人的因素引起，如实验者对“预期”结果的预计。
借助刻度完全标准的仪器，通过仔细、标准的操作过程，可以将偏差减少到最小，研究实验汇总的偏差可用不同的方法测量一个变量，看所测量的结果是否相同。为了避免个人造成的偏差，测量时应采用“盲试”，即测量者在不知道各种样品名的情况下进行测量，如使用编码系统。
四、测量误差
所以测量都可能有误差，但可以通过认识和理解误差的可能来源和采用相应的调查与计算步骤来减少错误。
测量错误普遍来源于粗心，如从错误的方向去度数即视觉误差。这种误差通过认真的记录来减少，并且可以通过反复测量来发现其他的误差起源于错误的或不准确的设备，但即使是一台功能十分完善的机器，它所测量的准确度、精确度也是有限度的。这些局限通常在厂家的说明书中都有说明，哪怕仪器设备是崭新的，这种局限性也存在，何况随岁月的流失仪器会老化。
实际上一个不可能排除的主要因素是实验本身的效应：哪怕是把一个温度计放入水中也会影响液体的温度，测量本身可能使一个变量发生改变。在任何报告中，你应把错误的可能来源都考虑在内，并估计它们的重要性。无论如何，不要把“生物可变性”作为不良实验技术和实验设计的借口。
五、收集和记录原始数据
开展实验工作或研究项目，要掌握记录和处理数据的重要技巧，将每个观察结果(如实验室温度)记录在笔记本上，而表格是收集大量信息的最简便的方式。
要点：一套好的实验室记录应该包括：
1. 说明实验或观察目的；
2. 详细记录描述材料和方法的所有资料；
3. 记录所有的实验结果或发现，并且提供形象的数据描述；
4. 记下直接结论和进一步实验的建议。
绘制一个收集数据的表格时，你应该：
1. 用一个简明的标题或数字代码表明相互参照之处。
2. 确定待测变量的个数、它们之间的关系，并且设计一个恰当的表格：
(A)表格的第一列应该表示自变量(控制变量)的值，接下来的列应是每个样品或重复的测量值；
(B) 如果几个变量都来测量同一个体或样品，每个变量应分别占一排；
(C)在时间进程研究中，根据不同处理将重复数据成组排成列，相应的不同的时间排成行。
3. 保证按数据采集的顺序排列。表格设计应该使记录过程尽量简单易行、尽量少出错。在最后报告中，最好是另作安排。
4. 考虑是否有必要为后面的计算增加表格的列数。数学运算可安排单独的列，使一步一步的计算清晰可见。如果你要运算许多数据，就用一个计算机的制表软件。
5. 用铅笔记录数据，可以更容易地改正错误。
6. 用足够的时间清楚记录定量数据——数字写大、写清楚、确保每个数据之间不混淆。
7. 将定量的数据制成合适数量的图，以反映测量值的准确性和精确性。不要省略数据值，否则会影响后面的分析。
8. 记录确切的观察情况，而不是你的解释，如记录一个特定生物化学反应的颜色，而不是记录正反应还是负反应。注意不要丢失任何于数据有关的信息。例如，如果你只写下平均值而不记录每个具体数据，将影响后面的统计分析。
9. 为重复实验准备相同的记录表格或清单。
10. 注脚处解释一些不寻常的结果，不要仅凭记忆来做解释。
六、课题工作细节的记录
推荐进行双重记录。
(一)原始记录
原始记录使在实验当场完成的，你必须注意材料、方法和结果的细节，包括在别处不会用到、但在分析误差时有用的信息。例如，如果你记录一种溶液的组成(记录所用的准确体积和质量，而不仅仅时记录浓度)，这样能发现计算错误是否时结果错误的原因。注意记录所用试剂和材料的来源、类型和状态。在方法和材料上，基本原则时记录足够的信息，使一个具有一定技能的科学家能完全重复你的实验。你必须介于极端学究和遗漏恰当的基本说明之间——最好使多记下额外的细节。有经验的实验员能告诉你哪种技术的些微改进是重要的(如重要化学药品的一批数字，或一种新的母液的配制)，许多重要的科学发现来源于仔细的观察和记录，以及一些看起来没有价值的巧合数据的记录。制作草图来表示重复实验、设备等安排。如果不得不使用散页纸记录数据，记录本的每一页都必须记有日期并把它固定在你的实验指导上，用皮圈绑起来，或用标签帖紧。这同样适用于打印、输出和制图表。
原始记录应是研究报告的一面镜子，包括：标题和日期、简介、对材料和方法的理解、数据和简短的结论。
(二) 第二次记录
你应同时或稍后在专用的本子上做第二次记录，无论是在文字组织上或表述上，它应更加干净利落。这本记录本将用于同指导老师讨论结果、些报告或学位论文，或许它还是你学业评价的一部分。抄写一个第二次记录，它会使你再次考虑原始记录中可能忽略的细节并提供了一个副本以防丢失或损坏。然而，这些记录应保留原始记录中不必重复记录材料和方法，可以采用诸如“方法同实验B4”的方式来表示。如果方法是有书本或论文中引用的，提供一个出处即可。在开始时仔细说明你的实验目的，并把该实验与其他实验窜联起来(如根据实验D24的结果，我决定测试是否······)。要用一种易懂的反射表示数据，如平均值表格或总结性图表。用适当的统计检验分析实验结果。得到数据后应该立即进行分析，这样可能对你后面的实验有一定的帮助。记下所有的那些当时看起来很明显但撰写报告和论文时容易忘记的结论。同样地，对进一步的研究思路将非常有价值。即使你的实验看起来时失败地，但对可能原因的分析被证实时有用的。
七、使用共有的记录
如果在一个研究组里一起工作，你可能要用到它们共有的数据。这就避免了重复工作和保证技术的一致性。它们可能也成为实验工作的法律安全需要的一部分。它们可能包括：
1. 一本通用技术的共用的记录本(如培养基或溶液)；
2. 一套设备使用的详细说明书；
3. 按字母顺序排列的设备和消耗供应商名单；
4. 大家共用的化学药品及其放置位置的清单；
5. 危险的实验步骤的危险性评估单；
6. 放射性物质或临床样品的使用与废物处理的记录。
第二节原始数据的处理与转换
发现自己研究结果的意义往往令人激动不已！这一过程包括两部分：
1．实验数据的处理——用于研究实验结果的本质，并通过数据处理提出可能的模式与关系。其目的在于提出一个进一步研究的假设。通过处理可以展现数据的直观形式，对于检验试验性“研究”的结果是很有用的，但应当应用于研究的全过程中。
2．验证分析——即对实验阶段所提出的假说进行验证，所用的技术本质上是统计方法。
要点：制表软件对于数据的处理与转换有不可估量的作用：复杂的数学过程可迅速完成，并由内置的图形功能立即将结果以图的形式显现。制表软件也有利于数据的统计分析。
一、数据的组织
为了组织、处理和汇总数据，必须做到：
1.简化数据，如通过四舍五入法或取平均值法，这可避免小数点后面位数过于
庞大。
2.以尽可能多的方式重新安排数据，以便于比较。
3.用图的形式表示：可以提供一个相对容易解释的、直观的概要。
4.寻找数据的总体模式——在这一阶段要避免丢失细节。
5.找出与该模式有明显差别的例外数据——它们经常是某些特例，或者是由于
在数据的采用、记录或复制过程中出错而产生的错误数据。
6.由图形解释转向精心选择的数字概要和/或文字描述，可以包括一个解释性的
假说。
收集数据后，第一步经常是计算每个值出现的频率，得出一个频率表。该频率仅仅是数据组中某一个值出现的次数，因而是一个统计数。原始数据可用计数表系统产生一个简单的频率表。构建计数表的方法是：
1.一次只输入一个计数符。
2.若是从数据清单上输入数据，在计数表上每输入一项，就从数据清单上把这
一项划去，以避免重复输入。
3.最后检查数据清单上的数据是否全被划去，并且数目是否与总数一致。
完成后，把数据转换为一个正规表格。由于分数比分类总数更容易比较，因而该表格可以包含显示各类的相对频率的一栏。相对频率可以用小数(按1的比例) 或百分数(按100的比例) 的形式来表示。
二、数据绘图
图是一种研究数据趋势的有效方法，可以揭示在表格中难以体现的数据特征（如频率分布的偏斜度）。在第3节中将详细介绍图的构建与使用。研究数据特点时应注意以下几点：
1.数据清晰。重点一股脑放在实际数据上，而不但标签、刻度标记等(这与为展
示数据而绘图的要求不同)。
2.避免图杂乱。删去网格线，根据目的尽量采用最简单的图。
3.尽量使用计算机制表软件的图形功能。利用这种工具软件的速度与灵活性，可
以迅速而相对容易地检验数据的各个方面。
三、展示分布
数据分布的直观展示通常对于按照某一间隔或比例尺度测定的变量是很有用。变量的分布可用每个值的频率表展示；如果数据较多，可将数据分组或分类。用图展示这些数据主要有两种方式：
1.柱形图，通常用语大量样本。
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地
亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
细胞内DNA和RNA的显示 一、目的要求 1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。 2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。 二、实验原理 核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。 三、器材与试剂 1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。 2、材料：鸡血。 3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。 4、试剂的配制 （1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。 （2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。 （3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。 （4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。该液应现配现用，不宜久置。 四、内容与方法 1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。 2、固定：将晾干的血涂片浸入70%乙醇中固定10分钟，取出后在室温下晾干。 3、染色：滴甲基绿派洛宁混合染液于血膜上，染色15min。 4、冲洗：用蒸馏水冲洗标本片，并用吸水纸吸去玻片上多余的水分，但不要吸得过干。 5、分化：将血涂片在95%酒精中迅速地过一下，进行分色，取出晾干。 6、观察：光镜下可见细胞质呈现红色，细胞核呈绿色。 五、作业与思考 1、简述DNA和RNA的染色原理。 2、细胞核中核仁理论上应被染成何种颜色？为什么？
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
生物技术专业介绍 生物技术专业是于2000年设立并正式开始招生，经过多年的建设，现已成为学校的优势专业，是山东省特色专业，又是山东省应用型特色名校工程重点建设专业。 一、人才培养目标 培养德、智、体、美全面发展，系统掌握农业生物技术的基本理论、基本知识、基本技能，具有较强的自主学习能力、实践能力、创新能力，能够支撑现代农业生物技术产业体系，服务于山东区域经济社会发展的高素质应用型人才。 二、特色和优势 1. 构建了一支高学历、教学经验丰富、科研能力强的一支师资队伍。本专业现有专职教师70人，其中正高职称22人、副高职称28人，讲师20人，高级职称教师占71.4%；具有博士学位的教师57人，占专职教师的81.4%；具有国外学习和研修经历的19人；泰山学者海外特聘专家3人、山东省教学名师2人、国务院特殊津贴获得者1人、“留学回国人员成就奖” 获得者1人、博士生导师4人。 2. 具有生物学科特色。本专业具有植物学、动物学、微生物学、生理学、遗传学等多学科支撑，以及生物化学与分子生物学省级重点学科支撑，生物学科特色鲜明。我们在生物技术专业的建设中，以厚基础，宽口径为前提，在课程体系与教学内容上力求突出自身的学科优势，形成专业特色，培养高素质应用型生物技术专业人才。 3. 以科研促教学，提高人才培养质量。（1）通过科研，提高教师自身素质，为提高教学质量提供了重要保证；（2）科研促进了教学条件的建设。在投资1000多万购置实验仪器的基础上，目前又新组建了科研用组培室与炼苗室各1间及教学用组培室与炼苗室各1间，极大充实了教学条件；（3）科研充实了教学内容。通过科研，提高教师学术水平，把新知识、新观点及时充实到教学中，激发学生对学科的兴趣，切实提高教学质量；（4）科研培养学生动手能力、创新思维。本专业于2003年率先在全校实施了“本科生导师制”制度，使学生从大二开始进入实验室，参与教师的科研活动，独立设计试验并完成科研任务，切实提高学生独立操作能力及创新能力。 三、学科建设 本专业为山东省特色专业，先后获得生物化学与分子生物学、遗传学、植物
《细胞生物学》 实验指导 目录 实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2 实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2 实验三细胞内糖类的显示（验证性）2 实验四细胞Feulgen反应（验证性）2 实验五动物细胞培养（综合性）4 实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4
实验一细胞大小测定和生物绘图法 一、实验目的 1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。 2. 掌握生物绘图的基本方法。 二、实验原理 （一）测微尺的原理 测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。 将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 物测微尺格数 目微尺每格所代表的实际长度= ×10um 目测微尺格数 例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。 测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。（二）生物绘图的基本要求 1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。 2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。 3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。 4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。 5. 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 6. 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。 三、实验材料和实验用品 1. 实验材料：口腔黏膜上皮细胞，洋葱内表皮，西红柿，芹菜，韭菜，红辣椒 2. 实验用品：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸，HB及2H或3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图
《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：
生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激
励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。
实验一：感受态细胞的制备 1.原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.实验材料 2.1LB液体培养基 2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.操作方法 3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。
细胞生物学实验讲义 实验一不同细胞形态观察、大小测量，结构比较 一、实验目的 利用光学显微系统对生命的基本组成单位——细胞进行观察，了解不同细胞的形态、结构和大小区别。 二、实验原理 细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构入手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。 三、实验内容和步骤 A、血涂片的制作 1．取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的载玻片作为推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载玻片保持30～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。 2．操作 ①将干燥血片用甲醇固定3-5分钟。 ②将固定的血片置于被pH6.4 -6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的Giemsa染液中，浸染10-30分钟（标本较少可用滴染法）。 ③取出用水冲洗，待干后镜检。 注意： ①取血滴不宜过多，以免涂片过厚，影响观察。 ②要使涂片厚薄均匀、拿片角度和速度都要适中，用力要均匀。涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。 ③涂片一般在后半部为好，白细胞在边缘和尾端较多。 B、洋葱表皮临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水 2)用刀片在洋葱鳞片叶内侧表皮上，划出2-5平方毫米的小方格，然后用镊
子撕下方格内的表皮放在载玻片的水滴中。 3)用镊子将表皮展平。 4)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的水滴，慢慢放平。3.染色 1)用滴管在盖玻片的一侧滴适量稀释的碘酒。 2)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸染液。 4.观察 C、人的口腔上皮细胞临时制片的制作 1.准备：擦净载玻片和盖玻片 2.制片 1)把载玻片平放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水。 2)用凉开水漱口，取消毒牙签在口腔侧壁上轻刮几下，将刮下的碎屑在载 玻片的液滴中涂抹均匀。 3)用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，慢慢放平。 3.染色 a)用滴管在盖玻片的一侧滴适量碘液。 b)用吸水纸在盖玻片的另一侧吸碘液。 4.观察 四、实验准备 1.器材：普通光学显微镜，牙签、酒精棉球、载玻片。 2.材料：洋葱表皮，口腔上皮，血涂片，永久制片。 3.试剂：碘液，Giemsa染液，生理盐水，甲醇，香柏油。 五、作业 描绘你所观察到的各种细胞的结构及大小（以比例尺表示）。 1、血液涂片（必做）。 2、永久制片，洋葱表皮，人口腔上皮选做其一。 实验二植物细胞微丝束的观察 一、实验目的 掌握考马斯亮蓝R250染植物细胞内微丝束的方法。了解在微丝束细胞内的分布特点。 二、实验原理
实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <
……………………….…………………………………………………………………………………姓名：杜宗飞专业：生物实验技术专业 院校：浙江大学学历：本科……………………….…………………………………………………………………………………手机：×××E – mail：×××地址：浙江大学
自荐信 尊敬的领导： 您好！今天我怀着对人生事业的追求，怀着激动的心情向您毛遂自荐，希望您在百忙之中给予我片刻的关注。 我是生物实验技术专业的2014届毕业生。大学四年的熏陶，让我形成了严谨求学的态度、稳重踏实的作风；同时激烈的竞争让我敢于不断挑战自己，形成了积极向上的人生态度和生活理想。 在大学四年里，我积极参加生物实验技术专业学科相关的竞赛，并获得过多次奖项。在各占学科竞赛中我养成了求真务实、努力拼搏的精神，并在实践中，加强自己的创新能力和实际操作动手能力。 在大学就读期间，刻苦进取，兢兢业业，每个学期成绩能名列前茅。特别是在生物实验技术专业必修课都力求达到90分以上。在平时，自学一些关于本专业相关知识，并在实践中锻炼自己。在工作上，我担任生物实验技术01班班级班长、学习委员、协会部长等职务，从中锻炼自己的社会工作能力。 我的座右铭是“我相信执着不一定能感动上苍，但坚持一定能创出奇迹”！求学的艰辛磨砺出我坚韧的品质，不断的努力造就我扎实的知识，传统的熏陶塑造我朴实的作风，青春的朝气赋予我满怀的激情。手捧菲薄求职之书，心怀自信诚挚之念，期待贵单位给我一个机会，我会倍加珍惜。 下页是我的个人履历表，期待面谈。希望贵单位能够接纳我，让我有机会成为你们大家庭当中的一员，我将尽我最大的努力为贵单位发挥应有的水平与才能。 此致 敬礼！ 自荐人：××× 2014年11月12日 唯图设计因为专业，所 以精美。为您的求职锦上添花，Word 版欢迎 下载。
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，
核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer