化学发光技术综述
化学发光免疫测定（）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。
（一）原理
化学发光免疫测定（）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。
（二）特点
特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。
（三）分类
1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。
1.1直接化学发光
化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。
代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。
1.1.1 吖啶酯
在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470的光，具有很高的发光效率，其激发态产物甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。
特点：
①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。
②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。
优点主要有：
①背景发光低，信噪比高；
②发光反应干扰因素少；
③光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；
④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；
⑤标记物稳定（在2-8 ℃下可保存数月之久）。
1.1.
2.三联吡啶钌
三联吡啶钌 [()3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
1.2 酶促反应化学发光
是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。酶促化学发光灵敏度高，但速度慢，酶活性容易受外界影响，其代表性的发光物质有鲁米诺及其衍生物、
1.2.1. 鲁米诺及其衍生物（)
激活酶为辣根过氧化物酶（)，鲁米诺体系的发光基本上为闪光型且信号弱。但在使用增强剂的情况下，发光的持续时间可延到30-60，发光强度至少增加100倍以上。
现通常采用的体系是2O2体系，即用标记抗原或抗体，以鲁米诺或异鲁米诺及其衍生物作发光底物，对碘苯酚或对苯基酚等作增强剂，用2O2作发光启动试剂，化学发光反应2后，光反射强度达到最高峰；20后，光强度减少20%。
1.2.2. 异鲁米诺（）
新产业的化学发光使用的发光剂，使用的是闪光非酶激活技术，加入启动液后测试0.1-3s时间内的发光强度。
1.2.3． ()
激活酶为碱性磷酸酶（）
的特性：
(1) 在碱性环境下，的非酶解性的水解程度低，即本底低；
(2) 热稳定性好，在7.0的水中，30℃时的分解半衰期为142h；
(3) 发光为辉光型，波长为470，在15时强度达到高峰，15-60内光信号强度维持一致，变化很小，即使在12h后仍能测定得出正确结果；
(4) 加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵()或等，能明显增强酶解的发光强度，增强因素达100-100000倍。
现通常采用的体系是，即用碱性磷酸酶()标记抗原或抗体，用(金钢烷)-1，2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物，在发光底物中加入增强剂。
使用此系统的有美国公司的和公司等，迈瑞的化学发光所使用的底物基本上属于。
2、从固相载体上，一般分为板式分离和磁珠分离
2.1 板式分离技术：
将抗原/抗体包被在微孔板上，反应时，待检物质通过抗原抗体反应结合于包被板上，通过洗涤液数次洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。
此分离技术和酶联免疫分析技术（）一致,只是将最后的显色剂改为发光剂得以实现，多数手工法检测，及部分半自动仪器使用这种分离技术，由于抗原抗体结合在反应孔中，反应面
积有限，所以为达到充分反应，孵育时间一般比较长。常为0.52h。
手工法化学发光最常用的发光体系是鲁米诺2O2/增强剂，规格和基本一致，为4896T。
2.2 磁珠分离技术
超顺磁珠是一种表面带有特定活性基团、大小均匀、球形、具有超顺磁性及保护壳的微粒。超顺磁珠在有外磁场存在时表现出磁力而发生聚集，无磁场时又失去磁力而分散开来。
通过一定的方法可将抗原/抗体等活性物质和磁珠表面的活性基团结合而包被于磁珠上面，检测时，将待检物和包被有抗原/抗体的磁珠在一定条件下孵育，通过抗原抗体反应结合，后通过增加外部磁场，磁珠产生磁性而聚集在一起，即可进行洗涤，实现结合部分和未结合部分的分离，最后加入底物、启动试剂，用光电倍增管检测发出的光信号。
使用磁珠法分离，由于反应时磁珠均匀分布于整个液体中，反应面积较大，更容易充分反应，故孵育的时间较短。
（四）一些自动化仪器使用的方法原理：
化学发光技术综述 化学发光免疫测定（）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 （一）原理 化学发光免疫测定（）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。 （二）特点 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。 （三）分类 1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。 1.1直接化学发光
化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。 代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。 1.1.1 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470的光，具有很高的发光效率，其激发态产物甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。 特点： ①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。 ②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。
化学发光技术综述 化学发光免疫测定（CLIA）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 （一）原理 化学发光免疫测定（CLIA）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。 （二）特点 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。 （三）分类 1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。 直接化学发光
化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。 代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为左右。 特点： ①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。 ②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。 优点主要有： ①背景发光低，信噪比高； ②发光反应干扰因素少；
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
化学发光成像系统 配置及技术参数 1．暗箱 1.1 尺寸：30×24×46cm 1.2 结构：双层结构，微处理器控制暗箱，确保完全密闭。 1.3 抽屉式载样 1.4 电源220V/50HZ 2．美国原装进口高灵敏度制冷CCD相机 2.1 CCD芯片尺寸：12.49X9.99mm 2.2分辨率：605万像素，2750 x 2200 2.3像素大小：4.54X4.54um 2.4像素密度：16bit(真实65536灰阶) 2.5 量子效率：≥75% 2.6 暗电流: <0.001 e-/pixel/sec. @ -30oC 2.7 读出燥声: 5.5e- RMS at 12 MHz 2.8致冷：三级半导体热电式致冷,常温以下60度 2.9 接口：单一USB线完成图像传输及控制，无需串口线，可靠性强。 3．镜头： 3.1 F0.95大光圈快速镜头,4/3英寸靶面 4．辅助光源： 4.1 LED反射灯*2； 5．样品台: 5.1轨道式化学发光样品台 6.图像采集软件功能 6.1通过USB或1394等数字接口直接采集获取样品图像。 *6.2 高精度自动曝光功能,无需揣摩曝光时间，一键完成western成像 6.3软件有自动1－99帧图像累积功能，具备时间序列图像采集，连续集成等功能，从而避免反复曝光，可从中挑选最中意的图像保存。 *6.4拍摄完成后自动生成专业16bit文件格式，富含原始数据信息，（如：曝光时间、拍摄日期、时间等），且不可修改 *6.5拍摄完成的图像提供三种不同灰阶范围的显示效果并可手动调整 *6.6拍摄完成的所有图像在图像采集界面以小窗口显示，方便查找、浏览及将marker图像与化学发光图像叠加功能 6.7采用先进的像素合并技术1X1，2X2，3X3，4X4等选项，提高灵敏度和信噪比。 6.8方便实用的图像导航浏览功能，通过调整窗宽，窗位，获取最佳图像显示效果。 6.8具有支持16bit图像的旋转，裁切，反色等处理功能，进行图像优化处理。 7.图像分析软件功能 7.1具有支持16bit图像的旋转，裁切，等处理功能，确定最适的图像视野。 方便实用的图像导航浏览功能，通过调整窗宽，窗位，获取最佳图像显示效果。 7.2自动识别泳道条带，并且可以根据需要添加、删除，调整泳道，实现泳道的精确分离。 7.3自动计算泳道中各条带的密度积分和峰值，方便计算分子量大小及条带的迁移率。
全自动化学发光免疫分析仪 技术审查指导原则 （第一次征求意见稿） 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对全自动化学发光免疫分析仪注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对全自动化学发光免疫分析仪的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、适用范围 化学发光免疫分析根据化学发光物质的类型和发光特点，可分为电化学发光免疫分析和化学发光免疫分析，其中化学发光免疫分析根据发光剂的不同，可分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和鲁M诺氧途径免疫分析。目前，各类型化学发光免疫分析的常见发光剂包括：电化学发光剂为三联吡啶钌[（）]，直接化学发光剂为吖啶酯（），酶促化学发光剂为辣根过氧化物酶（）催化鲁M诺（氨基苯二甲酰肼，）及其衍生物或者碱性磷酸酶催化（′螺旋金刚烷）甲氧基（″磷酰氧基）苯二氧杂环丁烷（），鲁M诺氧途径发光剂为酞箐、二甲基噻吩衍生物及螯合物。 化学发光免疫技术根据反应过程中标记物是否需要分离可分为均相反应和非均相反应。均相反应主要应用于鲁M 诺氧途径免疫分析中，而非均相反应则应用于其他类型化学发光免疫分析中，通过采用固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离等方式实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，其中顺磁性颗粒分离较其他分离方式更为常用。目前，基于鲁M诺氧途径免疫分析原理的产品还比较少，临床常用的全自动化学发光免疫分析仪更多地采用非均相反应模式。 本指导原则适用于采用上述化学发光免疫技术和反应
化学发光法在药物分析中的应用的综述报告化学发光分析法是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法，作为一种有效的痕量分析技术,因其具有灵敏度高、线性范围宽、而且分析速度快、重现性好等特点,在分析化学领域得到了迅速发展；但选择性较差如果将其与流动注射、高效液相色谱（HPLC)、毛细电泳(CE)等技术联用，就能较好的克服这一缺点。 化学发光反应体系目前主要使用的有：①鲁米诺、②光泽精、③过氧草酸盐-荧光物质-H2O2等电致发光、④Ce（Ⅳ）、⑤高锰酸钾-还原性有机物等，在医学、生命科学等领域中具有广泛的应用前景。 如果将高效液相色谱（HPLC)、毛细电泳(CE)等技术联用对药物进行分析，是分析化学较为活跃的发展领域，此方法彰示着化学发光法的潜在优势。 下面介绍一些化学发光法的研究成果： 基于碱性介质中敌百虫增强鲁米诺-H2O2体系发光的研究,建立了测定敌百虫的流动注射化学发光分析方法。该法测定敌百虫的线性范围为 1.0×10-8—1.0×10-5g/mL,根据IUPAC建议计算出检出限为3.2×10-9g/mL,相对标准偏差为1.10%(1.0×10-7g/mL的敌百虫,n=11)。对蔬菜中的敌百虫进行固相萃取,有效地除去蔬菜中的干扰物质,并对蔬菜样进行加标测定,回收率范围在88.5%—92.6%之间。 阿莫西林在硫酸溶液中的降解产物与Ce（Ⅳ）在罗丹明6G的增敏作用下可产生化学发光。据此建立了流动注射化学发光测定阿莫西林的新方法。该方法线性范围为0.01～20.0mg·L-1,检出限为
0.008mg·L-1,相对标准偏差(n=11,C=1.0mg·L-1为0.7％。方法用于药物中阿莫西林含量的测定,结果满意。 基于碱性介质中莱克多巴胺对鲁米诺-铁氰化钾体系化学发光的增敏作用,研究了各因素对化学发光的影响。结果表明,在最佳发光条件下,相对发光强度与莱克多巴胺浓度在 4.0×10-9～8.0×10-7 g.mL-1范围内呈良好的线性关系,检出限为2.5×10-9 g.mL-1,相对标准偏差为5.6%。应用该方法成功分析了猪肉和尿样中莱克多巴胺的含量,回收率为69.3%～101.3%,结果令人满意。 在甲醛存在下,高锰酸钾与尿酸能够发生化学发光反应,产生很强的化学发光。据此采用流动注射技术,建立了一种利用高锰酸钾甲醛尿酸化学发光体系测定尿酸的化学发光分析法。方法的检出限为6×10-6 g/L;相对标准偏差为1. 8% (4. 0×10-4 g/L尿酸,n=11 );线性范围为2. 0×10-5 ~5. 0×10-3g/L。本法用于人体尿液中尿酸的测定,结果令人满意。 在碱性条件下,铁氰化钾氧化鲁米诺产生发光,盐酸异丙肾上腺素对该体系有显著的增强作用。基于此并结合流动注射技术建立了测定盐酸异丙肾上腺素的新方法。该方法具有很高的灵敏度,检出限为8.6ng L(IUPAC) ;线性范围为0 .0 5～10 μg L。对1.0 μg L盐酸异丙肾上腺素平行测定11次,其相对标准偏差为3.6 %。 …… 化学发光法的分析对象可分为无机物（无机离子、N的氧化物、含S化合物）有机物、聚合物、活性氧、纳米分子等
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
光谱分析化学Spectral Analytical Chemistry 综述题目化学发光综述 学生姓名 所在学院化学化工学院 专业及班级分析化学 完成日期2013年12月27日
目录 摘要 (3) 1.理论背景 (4) 1.1化学发光分析 (4) 1.2化学发光的分类 (6) 2.化学发光试剂 (7) 2.1直接化学发光剂 (7) 2.1.1 吖啶酯及吖淀酰胺类 (7) 2.1.2 三联吡啶钌 (9) 2.2 酶促反应发光剂 (10) 2.2.1鲁米诺及其衍生物 (10) 2.2.2（金钢烷）- 1,2- 二氧乙烷及其衍生物 (11) 3.国内外主要的化学发光仪器的生产商 (13) 4.化学发光的应用 (16) 4.1化学发光免疫分析 (16) 4.2药物分析方面的应用 (17) 5.化学发光的市场与化学发光免疫分析的临床前景 (18) 5.1国外自动化免疫分析系统生产商及自动化免疫分析系统 (19) 5.2国内自动化免疫分析系统生产商及自动化免疫分析系统 (21) 6.结束语 (22) 参考文献 (22)
化学发光分析 摘要 化学发光作为光谱分析中重要的分析手段越来越受到普遍的关注，由于其不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。并具通过特定的化学发光可以定性定量的测定微量物质，有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。本文首先从化学发光的理论依据出发，进行化学发光的分类，化学发光的仪器的国内外现状，然后详细介绍了化学发光在免疫分析方面的应用，为扩大化学发光分析技术在替它领域的应用提供一些启发，最后进行了化学发光免疫分析系统进行了市场分析，及其临床应用进行了深入探讨。 关键词：光谱，化学发光，免疫分析，应用 0.前言 发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为：光照发光、生物发光、化学发光等。 光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来（现在学术界也把生物发光最为化学发光的一种）。化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。 本文主要介绍化学发光方面的理论及其应用。一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A + B C* C* C + hυ 其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态；
化学发光及生物发光的原理及其应用 第一部分概述 化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。化学发光体系用化学式表示为： 依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为： 1 ）普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反 应 ) ； 2 ）生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应；简称 BCL) ； 3 ）电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应，简称 ECL) 等。根据测定方法该法又可分为： 1 ）直接测定 CL 分析法； 2 ）偶合反应 CL 分析法 ( 通过反应的偶合，测定体系中某一组份； 3) 时间分辨 CL 分析法 ( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 ) ； 4 ）固相、气相、掖相 CL 。分析法； 5 ）酵联免疫 CL 分析法等。 化学发光的系统一般可以表示为：
在整个的检测系统中其关键的部分为 PMT ，其直接影响到仪器的检测性能，其最高检测极限为 10 － 22 mol/L 。不同型号的仪器其检测技术不一样，但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系，而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。记录仪记录峰形，以峰高定量，也可以峰面积定量。因化学发光多为闪烁式发光 (1—2s 左右 ) ，故进样与记录时差短，分析速度快。 第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理 化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（ 170 ～ 300KJ ／ mol ），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。 化学发光反应的发光效率是指发光剂在反应中的发光分于数与参加反应的分子数之比。对于一般化学发光反应，值约为 10 － 6 ，较典型的发光剂，如鲁米诺，发光效率可达 0 . 01 ，发光效率大于 0 。 01 的发光反应极少见。现将几种发光效率较高的常用的发光剂及其发光机理归纳如下。 1. 鲁米诺及其衍生物 鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、 4—氨基已基—N 一乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等。鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为 425nm 的化学发光。 在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时反应非常迅速。最常用催化剂是金属离子，在很大浓度范围内，金属离子浓度与发光强度成正比，从而可进行某些金属离子的化学发光分析，利用这一反应可以分析那些含有金属离子的有机化合物，达到很高的灵敏度。其次是利用有机化合物对鲁米诺化学发光反应的抑制作用，测定对化学发光反应具有猝灭作用的有机化合物。其三是通过偶合反应间接测定无机或有机化合物。其四是将鲁米诺的衍生物如异鲁米诺 (ABEI) 标记到羧酸和氨类化合物上，经过高效液相色谱 (HPLC) 或液相色谱 (LC) 分离后，再在碱性条件下与过氧化氢－铁氰化钾反应进行化学发光检测。也可以采用其它分离方法，如将新合成的化学发光试剂异硫氰酸异鲁米诺标记到酵母 RNA 后，通过离心和透析分离，然后进行化学发光检测。此外应用的还有 N 2(B2 羧基丙酰基 ) 异鲁米诺，并对其性能进行了研究。
?综 述? 几种主要化学发光物质的发光性能及其 化学发光免疫分析体系 尹东光,贺佑丰,刘一兵,沈德存,韩世泉,罗志福 (中国原子能科学研究院同位素所五十三室,北京102413) 文章综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质的结构 、发光机理、发光性能和特点以及其免疫分析体系。 目前,在免疫分析领域中应用多种免疫分析方法,其中化学发光免疫分析(C LI A )是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。C LI A 的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。C LI A 具有强大的生命力,在国际和国内倍受临床用户和生物医学工作者的重视。近十年来C LI A 的 发展迅猛,国外已开发出多种化学发光物质,C LI 2A 系统,以及全自动化化学发光仪。不同的化学发光物质发光机理和发光性能不同,不同的C LI A 系统原理和方法各异。本文综述了目前国际上免疫分析中应用的几种主要的化学发光物质及其免疫分析体系。 1 鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类 鲁米诺(luminol )、异鲁米诺(is oluminol )及其衍生物是最早在C LI A 中使用的一种常用的化学发光物质[1-3],它们的结构如下: 这类物质的发光为氧化反应发光,它们在碱性条件下通过辣根过氧化物酶(HRP )催化,被H 2O 2氧化生成3-氨基邻苯二酸的激发态中间体, 当其回到基态时发出光子,以鲁米诺为例其发光机理如下: 收稿日期:2002-02-06;修回日期:2002-05-23
化学发光法在环境监测中的应用 （上海大学环境与化学工程学院） 摘要：化学发光分析的方法是在环境监测工作中应用较多的一种现代测试技术，由于其自身灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优越特点使得化学发光技术在环境监测中的应用范围不断扩展。本文综述了化学发光分析法的原理、优缺点和在环境监测中的一些应用并简介了化学发光分析的局限性和在此基础上改进后的化学发光分析法在环境检测中的拓展应用。结合毛细管电泳技术与化学发光分析的联用，举例说明了化学发光分析的优良特点与化学发光分析的发展方向。 关键词：化学发光分析法；环境监测；应用 Chemiluminescence applications in enviromental monitoring Maguowen (School of chemical and enviromental Engineering, Shanghai University) Abstract:Chemiluminescence analysis method is a more modern testing technique commonly applied in environmental monitoring ,Because of its high sensitivity,wide linear range and simple equipment,chemiluminescence technology is in the ever-expanding range of applications in environmental monitoring.An reviewof the principle,advantage and disadvantage of chemiluminescence analysis and its improved application in enviromental monitoring is presented in this paper.discussed the characteristics and development of chemiluminescence analysis combined with capillary electrophoresis. Key words: chemiluminescence analysis;enviromental monitoring;application 化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度或辐射总量来确定其相应组分含量的分析方法。自19世纪下半叶发现一般有机物的化学发光反应以来，化学发光反应便被应用到分析化学领域中，特别是近十年来化学发光分析取得了很大的进展。随着人们对环境保护的重视，对环境监测要求也愈来愈高，化学发光法的众多优点使得其在环境监测分析方面的应用也逐渐增加，特别是在水和废水中对无机离子的分析监测方面有较多应用。近年来，随着环境科学研究的深入和发展，化学发光分析在环境监测中的应用也日益增多，并成功地应用于大气监测、水质监测以及环境污染机理的研究中[1]。 1基本原理与特点 1.1原理 化学发光分析是物质在进行化学反应时释放出的化学能被处于基态的反应分子吸收，分子从基态跃迁至激发态，在符合量子化条件时，激发态分子所吸收的化学能以光的形式辐射出来，成为化学发光。当在单重激发态返回基态时辐射的是荧光，其反应式为： 反应物A+反应物B激发态产物+其他产物 激发态产物基态产物+光子 化学发光的光强度Ιa与化学发光光子产率Φa之间的关系式为： Ia=Φa?dc(t)/dt[2] 由上式可知Ia是时间的函数，它与反应物的浓度及化学发光光子产率Φa成正比。用仪器测量一定时间内发光光子数或其积分值即发光强度或总发光强度，即可测出参与化学反应的各种物质的浓度，便能进行反应物质的定量分析。化学发光反应时待测物质与发光试剂反应发生化学发光。如某些金属离子能与鲁米诺和H2O2作用产生化学发光。另一方面，由于某些物质可与某些金属离子形成饱和配合物，使金属离子浓度降低，从而使其与鲁米诺的发光强度明显降低，基于此原理，可通
常见发光免疫分析技术的比较 免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18 摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。 发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。 1、化学发光 化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。其主要特点为消耗发光剂。同时量子效率相对较低。 1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；并目冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。 1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测2个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。而辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如HRP一鲁米诺系统、ALP—AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。 测量化学发光反应的光强度，求得某些化学物质和生物物质的含量，尤其与免疫学方法结合以后形成的化学发光免疫测定法(CLIA)，其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速，试剂无放射危害，检测限达10负15 mol／L。
附件4 全自动化学发光免疫分析仪 技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对全自动化学发光免疫分析仪注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对全自动化学发光免疫分析仪的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 化学发光免疫分析根据化学发光物质的类型和发光特点，可分为电化学发光免疫分析和化学发光免疫分析，其中化学发光免疫分析根据发光剂的不同，可分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和鲁米诺氧途径免疫分析。目前，各类型化学发光免疫分析的常见发光剂包括：电化学发光剂为三联吡啶钌
[RU（bpy）3]2+，直接化学发光剂为吖啶酯（AE），酶促化学发光剂为辣根过氧化物酶（HRP）催化鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼，luminol）及其衍生物或者碱性磷酸酶催化3-（2′-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3″-磷酰氧基）苯-1,2-二氧杂环丁烷（AMPPD），鲁米诺氧途径发光剂为酞箐、二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物等。 化学发光免疫技术根据反应过程中标记物是否需要分离可分为均相反应和非均相反应。目前，临床使用的全自动化学发光免疫分析仪通常采用的是非均相反应模式，通过采用固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离等方式实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，其中顺磁性颗粒分离较其他分离方式更为常用。 本指导原则适用于采用上述化学发光免疫技术和反应原理对人体血清、血浆或者其他体液样本中的被分析物进行定性或定量检测的全自动化学发光免疫分析仪。对基于其他化学发光免疫技术和反应原理的产品，可参照本指导原则相关适用条款准备注册申报资料。对临床适用范围广泛，全自动化学发光免疫分析只是其适用范围某一部分的临床分析仪器，亦可参照本指导原则准备全自动化学发光免疫分析部分的注册申报资料。 本指导原则适用于申请产品注册和相关许可事项变更的产品。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 1.概述 （1）申报产品管理类别：Ⅲ类。 （2）分类编码：6840-3。
第一章化学发光技术 一、免疫学检测发展阶段 免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程，如图1.1所示。 20世纪60年代70年代90年代时间 图1.1免疫学检测发展阶段 尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态，亟待改进。下表１.１就此做一比较： 表1.1 中国免疫诊断现状 由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是大势所趋；而取代进口，发展我国的化学发光检测事业，
正是临床检验界着手发展的方向。由此，我公司自1998年立项至今，致利于化学发光检测方案设计，自行开发了具有国内领先水平的化学发光底物，与国外知名检测仪器生产商联合开发了化学发光全自动、半自动检测仪，并自行设计开发了化学发光管理软件，而今形成了仪器、试剂、软件全面配套，为我国的临床检验界提供了一套完善的解决方案。 二、化学发光免疫分析技术 【概述】 本世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（EIA）相似，不同这处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。 化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。 【原理】 在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式，如图1.2，1.3，1.4所示。 如图1.2双抗体夹心法反应原理示意图
化学发光技术综述
化学发光技术综述 化学发光免疫测定（）是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 （一）原理 化学发光免疫测定（）属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。 （二）特点 特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。 （三）分类 1、从反应原理上，化学发光免疫技术主要分为直接化学发光和酶促反应化学发光。 1.1直接化学发光
化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。直接化学发光速度快、试剂稳定性好，但灵敏度略低于酶促发光。 代表性的发光剂有：吖啶酯、三联吡啶钌。 1.1.1 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470的光，具有很高的发光效率，其激发态产物甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 这类化合物的发光为闪光型，加入发光启动试剂后0. 4s 左右发射光强度达到最大，半衰期为0.9s左右。 特点： ①发光反应中在形成电子激发态中间体之前，联结于吖啶环上的不发光的取代基部分从吖啶环上脱离开来，即未发光部分与发光部分分离，因而其发光效率基本不受取代基结构的影响。 ②吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物化学发光不需要催化剂，在有H2O2 的稀碱性溶液中即能发光。因此应用于化学发光检测具有许多优越性。