作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。
糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。
目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。
１
多糖的提取纯化
１．１常规方法提取
１．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。１．１．２
浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提
取。浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。１．１．３
过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。１．１．４
有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓
缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。
现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规
水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。
朱晓霞，罗学刚
（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）
多糖提取与纯化技术应用进展
摘
要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。提取和纯化是制备多
糖的关键。目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。综述了多糖制备常用的提取与纯化工艺与新技术的应用进展，分析了它们的原理及优缺点并探讨了发展前景。关键词：多糖；提取；分离；纯化
ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ
ＺＨＵＸｉａｏ－ｘｉａ，ＬＵＯＸｕｅ－ｇａｎｇ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
Ｈｉｇｈｖａｌｕｅｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈａｖｅｗｉｄｅｌｙａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅｆｏｏｄｓｔｕｆｆａｎｄｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｌｏｗｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｉｔｓｐａｒｔｉｃ－ｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｔｈｅｋｅｙｉｓｓｕｅｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，
ｔｈｅｃｏｍｍｏｎ－ｌｙｕｓｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｕｓｕａｌ－ｗａｔｅｒ，ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ，ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｕ－ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｎｇｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｂｒｕｐｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１．２物理辅助提取
目前常将物理场应用于对多种生物大分子的辅助提取，以提高多糖得率，主要是采用微波及超声波进行样品预处理。
１．２．１微波提取
微波加热是靠微波电子管发出的电磁波，感应生电，又转化成分子的动能而发热，具有快速、高效、安全的特点；其次微波的频率很高，能透入物体的深度较深，对细胞的结构有较大作用。
王莉、孙萍［５￣６］等利用连续微波反应器，用石油醚、乙醚除去药材中的脂溶性杂质，用８０％乙醇除去所含单糖、低聚糖及甙等干扰性成分后，再运用微波技术用水提醇沉法分别制得板蓝根多糖和甘草多糖，并用苯酚－硫酸比色法对其多糖含量进行测定，得率均较传统方法提取明显提高，平均回收率在９８．５０％￣１０１．５０％之间，ＲＳＤ小于１．５０％，反应时间缩短１２倍。付志红［７］为保持车前子多糖的生物活性，采用微波技术提取车前子多糖。结果表明，微波提取方法时间短，得率高。１．２．２超声波提取
超声波主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分的溶出。
Ｓｔａｈｍａｎｎ［８］等报道，一种具有β－１，３－Ｄ－葡聚糖结构的多糖经过长时间的超声处理后，分子量从２５万降至５万左右，经小角度Ｘ光衍射分析，此多糖的超声降解产物的空间结构与具有免疫调节活性的裂褶多糖相似。
超声降解的速率受以下因素的影响：母体分子量、浓度、体积、超声辐照时间和反应温度等。Ｃｈｅｎ［９］等认为，相对分子量越高或浓度越低，则降解速度越快。此外，增大超声波的强度、降低环境温度、施加外压或在外加气体存在的条件下均可导致降解速度提高。
韩兵兵［１０］等通过单因素法对超声波法提取大枣多糖的实验条件进行优化，并与常规的水浴提取法作了比较。结果显示，超声法提取具有高效、节能、省时的特点。常秀莲［１１］等在超声波法提取芦荟花多糖的研究中发现，采用超声波分两批次加水比单次加相同水量可多提取７％的多糖。
１．３超临界流体萃取
超临界流体萃取（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＣＦＥ）是２０世纪９０年代发展起来的一项新型提取技术，利用超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ，ＳＣＦ）为萃取剂，从液体或固体中萃取目标组分。用纯ＣＯ２提取糖及苷类化合物的产率低，这是因为这类化合物分子量较大、羟基多、极性大，如加入携带剂和加大压力则可提高产率［１２］。廖周坤等用ＳＥＦ－ＣＯ２萃取装置试验从藏药雪灵芝中萃取总皂苷粗品及多糖，确定最佳多糖萃取条件为：１０ＭＰａ、４５℃６．４ｈ，其中加不同极性夹带剂的梯度ＳＦＥ萃取法与传统溶剂萃取工艺相比，多糖收率可以提高至１．６２倍。
２多糖的纯化
多糖的纯化是获得粗的活性多糖提取液后，除去共存杂质，进行混合糖的相互分离，随糖类组分的复杂性不同而有所区别。一般分为两个过程：多糖除杂、多糖分离。
２．１多糖除杂主要过程
２．１．１去蛋白
Ｓｅｖａｇ法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解。微生物多糖去蛋白常采用Ｓｅｖａｇ法、三氟三氯乙烷法；植物多糖去蛋白常用三氯乙酸法，也可以用蛋白质水解酶使样品中的蛋白质部分降解后，再用Ｓｅｖａｇ法效果会更好。
李知敏等［１３］选用了３种较为常见的方法：三氯乙酸法、盐酸法及Ｓｅｖａｇ法对植物多糖提取液进行脱蛋白处理。其脱蛋白率分别为４６．１％、７２．５％和４２．３％，多糖损失率分别为６．１％、１５．１％和１４．３％。盐酸法脱蛋白率高，但它的多糖损失率较高；三氯乙酸法、Ｓｅｖａｇ法较温和，但除蛋白效率不高。
２．１．２透析
流水透析４８ｈ，蒸馏水透析２４ｈ，去除小分子杂质。２．１．３有机溶剂洗涤
透析后的沉淀相继用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥得粉末状的粗多糖。
２．２多糖分离
主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、透析法、金属盐沉淀法和制备性区域电泳等，目前大多采用ＤＥＡＥ－凝胶或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法。
２．２．１色谱分离
依据被分离多糖组分间的理化性质差异及其在固相载体和流动相之间分布和流动速度的差异而达到分离的目的。
２．２．１．１凝胶色谱
凝胶色谱是一种分辨率低、载样量少的分离技术，但方法简单、快速。常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）和琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ），以不同浓度的盐溶液和缓冲
溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。一般生药提取物得以分离多用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（甲基丙烯酸聚合树脂）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（丙烯葡聚糖凝胶）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ精制得到各种多糖。
魏江洲等［１４］用热水抽提法提取海螵蛸多糖粗品，用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ柱及ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱对海螵蛸多糖粗品进行分离，最后使用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００柱进一步纯化，最后得到相对均一的活性精品多糖ＣＰＳ－１。２．２．１．２离子交换色谱法
通过载体表面带电基团与样品离子和淋洗离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附实现色谱分离。不同多糖尤其是多糖与蛋白质结合在一起的复合多糖，在一定ｐＨ条件下，所带电荷不同，则可根据各多糖上电荷的差异而达分离目的。
毛建山［１５］等经脱脂、沸水抽提、乙醇沉淀、酶－Ｓｅ－ｖａｇ法脱蛋白得到的粗多糖，再经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ阴离子交换和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００葡聚糖凝胶柱色谱分离得到纯化的白毛藤多糖（ＳＬＰＳ）。
２．２．２膜分离
膜分离技术（ｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＳＴ）是一项新兴的高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（如压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分选择性通过膜。以压力差为推动力的膜分离过程包括微滤、超滤、纳滤、反渗透，根据筛分原理使某些组分选择性透过，实现提纯和浓缩［１６］。目前应用较多的是超滤和微滤技术。２．２．２．１超滤
超滤［１７］（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＵＦ）的孔径范围为１ｎｍ～１００ｎｍ，截留相对分子质量为１０３￣１０６。溶解的盐和水会通过超滤膜，分子量在１０００以上的物质则被截留，故可从水和其它液体中分离出很小的胶体和大分子。超滤膜的另一特点是由于受渗透压的阻碍作用小，所以在相当低的压力差（０．０４ＭＰａ￣０．７０ＭＰａ）下，仍具有高流通率。
超滤膜技术［１８］广泛应用于各类多糖的分离、浓缩、纯化等研究中，包括中药药源多糖如灵芝多糖、大黄多糖、六味地黄汤多糖、黄芪多糖、紫芝多糖、人参多糖，海洋活性多糖如鲨鱼软骨粘多糖、褶纹冠蚌多糖、紫菜多糖、褐藻糖胶、卡拉胶，酵多糖如蜜环菌菌索多糖、ＰＳ－９４１５发酵液多糖、冬虫夏草多糖，食用植物多糖如茶多糖、香菇多糖、金针菇多糖、芦荟多糖、枸杞多糖等。采用超滤膜技术处理多糖具有收率高、不易破坏多糖的生物活性、能耗低等特点，适于工业化生产。
念保义［１９］以香菇为原料，利用超滤膜装置对浸提的香菇多糖进行分离。同时对超滤过程的阻力及传质特性进行分析，并建立超滤过程的修正凝胶极化模型。经过实验获得香菇多糖提取率５．７％，多糖质量分数８９．２％，说明利用超滤方法分离浓缩香菇多糖是有效的工艺手段。
２．２．２．２微滤
微滤（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＭＦ）膜通常截留粒径大于０．０５μｍ的微粒，多采用对称微孔膜，膜的孔径范围为０．１μｍ～５μｍ，操作压差范围为０．０５ＭＰａ～０．２ＭＰａ。微滤［２０］能有效去除比膜孔大的微粒和微生物，具有能耗低、无二次污染、分离效率高等特点，在多糖提取中可用于多糖液体的澄清和多糖精制。
２．３纯度鉴定
对分离纯化的多糖需要进行纯度鉴定，常用的纯度鉴定方法有４种［超离心、高压电泳、凝胶层析和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）］。现在应用较多的是ＨＰＬＣ法。也有人将旋光测定作为一种纯度测定标准。通常要肯定某一多糖的均一性，必须要有两种方法以上的鉴定结果才能肯定。
李雪华［２１］从荔枝肉中提取多糖，用凝胶色谱柱ｓｅｐｈａｄｅｘＧ－２５对荔枝多糖进行分级纯化，得到多糖Ａ１和多糖Ａ２，纯化后的多糖分别用聚丙烯酰胺凝胶柱Ｐ－１００、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维薄膜电泳法检测多糖的纯度。对Ａ２进行纯度鉴定：从聚丙烯酰胺凝胶Ｐ－１００柱的洗脱图谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维薄膜电泳的电泳色带均证明Ａ２为纯品。
３结论
近２０年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，快速高效、节省能源、简便易行的提取与纯化工艺对多糖的研究有重要意义。目前较为常用的提取与纯化技术比较成熟，但存在溶剂、能源消耗大且效率不高的问题，合理使用一些新技术可以有效改善提取与纯化效果，使多糖制备向高效节能的方向发展；不断探索和完善的提取与纯化技术，将会使多糖制备向绿色、现代化的方向发展。
参考文献：
［１］尹源明，何国庆，郑晓冬．大麦中活性多糖提取的研究［Ｊ］．中国粮油学报，２００２，１７（１）：４３￣４５．
［２］樊君，尚红伟，王华敏．大枣多糖的提取工艺研究［Ｊ］．食品研究与开发，２００２，２３（３）：２９￣３１．
［３］尤献民，金薇，邹桂新．老头草中多糖的含量测定［Ｊ］．时针国药研究１９９７，８（６）：５１３．
［４］倪德江，谢笔钧，宋春和．乌龙茶多糖提取条件的优化［Ｊ］．食品科
学，２００２，２３（１２）：３５￣３９．［５］
王莉，鲁建江，顾承志．微波技术在板蓝根多糖提取及含量测定中的应用［Ｊ］．中药材，２００１，２４（３）：１８０．
［６］孙萍，李艳，顾承志．甘草多糖的微波提取及含量测定［Ｊ］．基层中药
杂志，２００１，１５（６）：２２．
［７］付志红，谢明勇，聂少平．微波技术用于车前子多糖的提取［Ｊ］．食品
科学，２００５，２６（３）：１５１￣１５４．［８］
ＳｔａｈｍａｎｎＫＰ，ＭｏｎｓｃｈａｕＮ，ＳａｈｍＨ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｎａｔｉｖｅａｎｄｓｏｎｉｃａｔｅｄｃｉｎｅｒｅａｎ，ａβ－（１－３）－（１－６）－Ｄ－ｇｌｕｃａｎｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，１９９５，２２６（１）：１１５￣１２８．［９］ＣｈｅｎＲＨ，ＣｈａｎｇＪＲ，ＳｈｙｕｒＪＳ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄ
ｓｔｏｒａｇｅｉｎａｃｉｄｉｃｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｎｃｈａｎｇｅｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｐｏｌｙｉｓ－ｐｅｒｓｉｔｙｏｆｔｒｅａｔｅｄｃｈｉｔｏｓａｎ［Ｊ］．ＣａｒｂｏｈｙｄｒＲｅｓ，１９９７，２９９：２８７￣２９４．［１０］韩兵兵，李鹏飞，赵国燕．超声强化提取大枣多糖的研究［Ｊ］．农产品
加工，２００５，３：５３￣５５．
［１１］常秀莲，王长海，冯咏梅．超声波法提取库拉索芦荟花多糖［Ｊ］．烟台
大学学报（自然科学与工程版），２００５，１８（２）：１３７￣１４１．
［１２］赵启铎，贡济宇，高颖，等．超临界流体萃取技术在中药成分研究中
的应用［Ｊ］．中国药学刊２００３，２１（５）：８２１￣８２３．
［１３］李知敏，王伯初，周菁．植物多糖提取液的几种脱蛋白方法的比较
分析［Ｊ］．重庆大学学报，２００４，２７（８）：５７￣５９．
［１４］魏江洲，张建鹏，刘军华．海螵蛸多糖的提取分离及活性组分
ＣＰＳ２１的纯化［Ｊ］．第二军医大学学报，２００６，２７（１）：１７￣２１．［１５］毛建山，吴亚林，黄静，等．白毛藤多糖的分离、纯化和鉴定［Ｊ］．中草
药，２００５，３６
（５）：６５４￣６５６．［１６］刘茉娥．膜分离技术［Ｍ］．北京：化学工业出版社，１９９８：１￣２．［１７］何江川，韩永萍．超滤膜分离法在多糖分离提取中的应用［Ｊ］．食用
菌，２００５（１）：５￣８．
［１８］胡亚芹，曹杨．超滤膜技术在多糖提取方面的应用［Ｊ］．生物技术通
讯，２００５，１６
（２）：２２８￣２３０．［１９］念保义，陈铭，王铮敏．超滤膜分离香菇多糖的研究［Ｊ］．化学工业与
工程技术，２００３，２４（４）：２７￣３０．
［２０］吕宏凌，王保国．超滤、微滤分离技术在中药提取及纯化中的应
用进展［Ｊ］．化工进展，２００５，２４（１）：５￣９．
［２１］李雪华，谢云峰，周劲帆．荔枝多糖分离纯化及纯度鉴定［Ｊ］．广西医
科大学学报，２００５，２２（３）：３６６￣３６７．
收稿日期：
２００６－１０－０８刘爱国１，丁宇翔１，王伟２
（１．天津商学院生物技术与食品科学学院食品科学与工程系，天津３００１３４；２．天津市康乐食品厂，天津３００３００）
结冷胶在非膨化冷食品中的应用研究
摘
要：从结冷胶的特点和冷食品新产品开发的要求出发，重点研究了结冷胶在冷食品中的应用，以适应冷食品发
展的需要。选取适宜的胶体与其复配，达到最佳凝胶效果。然后将复配胶体用于非膨化冷食品中，得到较理想的酥脆冷食品配方。配方为：葡萄糖１５％，甜蜜素０．１０％，柠檬酸０．１５％，柠檬酸钠０．０３％，结冷胶０．０２％，魔芋胶０．０８％，卡拉胶０．０５％，氯化钙０．１％，水８４．４７％。关键词：结冷胶；黏度；凝胶；冷食品
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
作者简介：刘爱国（１９６４－），男（汉），副教授，学士，研究方向：乳制品工艺，冷食品开发，食品添加剂。
ＳＴＵＤＹＯＮＴＨＥＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＯＦＧＥＬＬＡＮＧＵＭＩＮＮＯＮ－ＥＸＰＡＮＤＥＤＦＲＯＺＥＮＤＥＳＳＥＲＴ
ＬＩＵＡｉ－ｇｕｏ１，ＤＩＮＧＹｕ－ｘｉａｎｇ１，ＷＡＮＧＷｅｉ２
（１．ＴｉａｎｊｉｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｏｏｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｏｍｍｅｒｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１３４，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｉａｎｊｉｎＫａｎｇＬｅＦｏｏｄＦａｃｔｏｒｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００３００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：
ｓｔｕｄｉｅｄｏｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅｌｌａｎｇｕｍｉｎｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔ，ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｇｅｌｌａｎｇｕｍａｎｄｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｅｗｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔ，ｔｏａｄａｐｔｔｏｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔｉｎｄｕｓｔｒｙｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｅｍｉｘｅｄｇｅｌｌａｎｇｕｍｉｓａｐｐｌｉｅｄ，ｗｈｉｃｈｉｓｍｉｘｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｇｕｍ，ｉｎｎｏｎ－ｅｘｐａｎｄｅｄｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔ，ａｎｄｇｏｔａｎｉｄｅａｌｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆｃｒｉｓｐｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔ．Ｔｈｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ｇｌｕｃｏｓｅ１５％，ｓｏｄｉｕｍｃｙｃｌａｍａｔｅ０．１０％，ｃｉｔｒｉｃａｃｉｄ０．１５％，ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ０．０３％，ｇｅｌｌａｎｇｕｍ０．０２％，ｋｏｎｊａｌｇｕｍ０．０８％，ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ０．０５％，ｃａｌｃｉｕｍ０．１％，ｗａｔｅｒ８４．４７％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ｇｅｌｌａｎｇｕｍ；ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ；ｇｅｌ；ｆｒｏｚｅｎｄｅｓｓｅｒｔ
第四章核酸分离纯化 一、学习目标 掌握 DNA和RNA分离纯化的步骤、原则和常用方法。 熟悉常见临床分子生物学检验标本的种类、标本处理的一般原则。 二、重点和难点内容 （一）临床分子生物学检验标本的主要种类： 血液标本（全血、血清、血浆、外周血单个核细胞）、分泌物标本（鼻咽分泌物、生殖道分泌物、唾液、痰液、胃液等）、组织标本等。 （二）临床分子生物学检验标本的主要处理原则： （1）适时、适量采集标本。 （2）低温运送与保存。 （三）核酸分离纯化的步骤： （1）制备细胞及破碎细胞。 （2）消化蛋白质，去除与核酸结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子。 （3）去除其它不需要的核酸分子。 （4）沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质。 （四）核酸分离纯化的原则：
（1）维持完整度（抑制DNA酶或RNA酶对DNA或RNA 的降解活性）。 （2）确保高纯度。 （五）分离纯化后的理想DNA样品应具备的条件： （1）不含对后续检测所用酶（如后续PCR检测所用酶：DNA聚合酶）的活性有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。 （2）最大程度上避免蛋白质、多糖和脂类的污染。 （3）排除RNA分子的污染与干扰。 （六）核酸分离纯化的方法： （1）基因组DNA 的分离纯化 酚抽提法 吸附柱法（原理：基于高盐缓冲系统下，DNA与硅基质的可逆结合来分离纯化DNA） 磁珠法（原理：基于磁珠表面修饰的对DNA有吸附作用的官能基团，通过其与DNA的可逆结合、磁场对磁珠的作用来分离纯化DNA） （2）总RNA的分离纯化 Trizol (异硫氰酸胍&苯酚混合液)法 总RNA提取试剂盒(吸附柱法&磁珠法) （3）mRNA的分离纯化 寡聚(dT)-纤维素柱层析法
一、核酸 核苷酸单体聚合而成的生物大分子，是生物细胞最基本和最重要的成分。一般认为，生物进化即始于核酸，因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。他当时称之为核素。阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后，定名为核酸。 二、核酸的分类和功能 核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。这两类核酸有某些共同的结构特点，但生物功能不同。 DNA贮存遗传信息，在细胞分裂过程中复制，使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA；RNA主要在蛋白质合成中起作用，负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。 核酸的基本结构单元是核苷酸，核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。碱基与戊糖构成核苷，核苷的磷酸酯为核苷酸。DNA和RNA中的戊糖不同，RNA中的戊糖是D-核糖；DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。核酸就是根据其中戊糖种类来分类的，DNA和RNA的碱基也有所不同。 三、核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 四、细胞裂解： （一）裂解原理在核酸提取过程中，细胞裂解是非常重要的。经典的裂解液几乎都含有去污剂(如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐(如Tris、EDTA、NaCl 等)。 盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境(如Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是基因组DNA 抽提的主流。 （二）细胞的裂解方法
多糖的提取和纯化→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2 －3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）。干燥后可得粉末状的粗多糖。1.2 微波辅助提取法：其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中[14]。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清[15]。聂金源等在柴胡多
糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。1.3 超声辅助法：其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。1.4 索氏提取法：将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。1.5 醇提法：先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃℃℃
1.多糖的提取方法 生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。1．1溶剂法 1．1．1水提醇沉法 水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。多糖是极性大分子化合物，提取时应选择 水、醇等极性强的溶剂。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置 5 h，多糖的质量分数和得率均较高。影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。 水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。 1．1．2酸提法 为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。 由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之处。 1．1．3碱提法 多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。 1．1．4超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是近年来发展起来的一种新的提取分离技术。超临界流 体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。由于CO2的超临界条件（TC＝304．6 ℃，Tp＝7．38 MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40 MPa 时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。 该法的缺点是设备复杂，运行成本高，提取范围有限。 1．2酶解法 1．2．1单一酶解法 单一酶解法指的是使用一种酶来提取多糖，从而提高提取率的生物技术。其中经常使 用的酶有蛋白酶、纤维素酶等。蛋白酶对植物细胞中游离的蛋白质具有分解作用，使其结构变得松散；蛋白酶还会使糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质水解，降低它们对原料的结合力，有利于多糖的浸出。
作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。 糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。 目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。 １ 多糖的提取纯化 １．１常规方法提取 １．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。１．１．２ 浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提 取。浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。１．１．３ 过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。１．１．４ 有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓 缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。 现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规 水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。 朱晓霞，罗学刚 （西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０） 多糖提取与纯化技术应用进展 摘 要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。提取和纯化是制备多 糖的关键。目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。综述了多糖制备常用的提取与纯化工艺与新技术的应用进展，分析了它们的原理及优缺点并探讨了发展前景。关键词：多糖；提取；分离；纯化 ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ ＺＨＵＸｉａｏ－ｘｉａ，ＬＵＯＸｕｅ－ｇａｎｇ （ＳｃｈｏｏｌｏｆＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｉｇｈｖａｌｕｅｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈａｖｅｗｉｄｅｌｙａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅｆｏｏｄｓｔｕｆｆａｎｄｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｌｏｗｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｉｔｓｐａｒｔｉｃ－ｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｔｈｅｋｅｙｉｓｓｕｅｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ， ｔｈｅｃｏｍｍｏｎ－ｌｙｕｓｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｕｓｕａｌ－ｗａｔｅｒ，ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ，ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｕ－ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｎｇｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｂｒｕｐｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
第一部分：野生灵芝菌种的分离、扶壮、保藏和培养 前言 采集吉林长白山野生灵芝，经过菌种分离，鉴定为GANODERMA（英文名称）多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.) Karst．的菌种。经过纯化扶壮培养，成为一支优良的灵芝菌种，为灵芝菌丝体发酵培养和灵芝多糖的提取奠定了基础。 实验室流程：（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（恒温培养箱）菌种培养扶壮（恒温恒湿冷藏柜）优良菌种保藏（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（摇床）发酵菌种摇瓶培养（用于接种菌种罐） 第二部分：灵芝菌丝体液体发酵培养 前言 液体发酵培养不同于灵芝子实体栽培，周期短，产量高，无污染，灵芝多糖含量高，节省木材和耕地。是一种灵芝多糖理想的工厂化现代科技生产方式。经过摇瓶培养的灵芝菌种接种于种子罐，待生长良好，在接种于扩大的发酵罐中，通过通气恒温培养，长成成年灵芝菌丝体，生长完全后，进行离心分离喷雾干燥，就得到相当于灵芝子实体的灵芝菌丝体粉，多糖含量达到15%左右。进一步提取加工得到高含量的灵芝多糖。 灵芝菌丝体发酵工艺流程:（配料罐）培养液的配制（菌种罐）菌种的发酵培养 （发酵罐）灵芝菌丝体发酵培养（离心机）灵芝菌丝体固液分离（浓缩液配制罐)灵芝菌丝体配制成浓缩液（喷雾干燥塔）浓缩液喷雾干燥，得到灵芝菌丝体粉 第三部分：灵芝菌丝体多糖的提取分离 前言 灵芝菌丝体粉，是大部分不溶解于水，食用以后象灵芝子实体一样，只有少部分成分被吸收，通过现代提取手段，将灵芝菌丝体经过提取罐的水提取，经过真空浓缩，在经过醇沉工艺，加工成可以全部被人体吸收，灵芝多糖含量提高到30-40%灵芝菌丝体提取物。极大的提高了功效，减少了服用量。 灵芝多糖提取工艺流程：(提取罐）灵芝菌丝体粉水提取（外循环真空浓缩罐）提取液真空浓缩（醇沉罐）浓缩液乙醇沉淀多糖（离心机）沉淀多糖分离 (浓缩液储罐）沉淀物配制成多糖浓缩液（喷雾干燥塔）灵芝多糖喷雾干燥 （粉碎机）灵芝多糖粉碎到100目（混合机）灵芝多糖粉批量混合（真空包装机）食品塑袋真空包装。灵芝多糖原料成品
多糖分离纯化的基本原则和方法 多聚糖(polysaccharide)，简称多糖，常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的，其性质已大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失，广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，与生命功能的维持密切相关。近年来，大量研究表明多糖除了有增强免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学效应外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用。 1、基本原则 在不破坏多糖活性的前提下进行多糖的分离纯化。尽量不引入新的杂质，或引入的新杂志易于除去，如小分子盐类可经过透析作用除去，铵根离子可通过加热挥发除去等[1]。 2、分离纯化方法 多糖的生物活性倍受关注，但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟，基于效率、成本多方面的考虑，各种方法的开发、比较、分析是研究工作的焦点之一。目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同，决定在提取之前是否做预处理：提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在用水提取前，应先加入甲醇或l：l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚进行脱脂，而对含色素较高的根、茎、叶、果实类，需进行脱色处理。 2.1多糖的提取与分离方法 由于各类多糖的性质及来源不同，所以提取方法也各有所异，主要归纳为以下几类： 第一类难溶于水，可溶于稀碱液的主要是胶类，如木聚糖及半乳糖等。原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取，提取液经中和及浓缩等步骤，最后加入乙醇，即得粗糖沉淀物。 第二类易溶于温水，难溶于冷水的多糖，可用70~80℃热水提取，提取液用氯仿：正丁醇（4:1）混合除去蛋白质，经透析、浓缩后再加入乙醇即得粗多糖产物[2]。 第三类粘多糖的提取。在组织中，粘多糖与蛋白质以共价键结合，故提取
核酸的提取与纯化 一 DNA的提取与纯化 （一）实验目的与主要原理 DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎， 暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使 DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去 除蛋白质，从而提取高纯度DNA。 （二）实验材料 蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/l Tris(pH 8.0), 500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。 （三）实验方法 DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽 提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法 由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响 较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以 沉淀方法较为多见，主要步骤如下。 1 样本前处理 哺乳动物细胞：提前准备55℃冰浴。
（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。 （2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到 500ug/ml，37℃孵育4~6小时。 动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。 （1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。 （2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h, 可以过夜裂解，每小时颠倒2~3次）。 （3）如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A于样品中，室温孵育2min。 （4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。 2 DNA提取过程 （1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去） （2）将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗2~3次。 （3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE（60℃），或去离子水（pH）7.0），室温静 置1min，12000r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的 ＤＮＡ置于－２０℃保存。
一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与
酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅速透析，浓缩与醇析而获得多糖沉淀。
1．4 生物酶提取法 酶技术是近年来广泛应用到有效成份提取中的一项生物技术，在多糖的提取过程中，使用酶可降低提取条件，在比较温和的条件中分解植物组织，加速多糖的释放或提取。此外，使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、蛋白质等的产物，常用的酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶等。 1．5 超声提取法 超声波是一种高频率的机械波，其主要原理是利用超声波产生的“空化作用”对细胞膜的破坏，有利用植物有效成分的释放，而且超声波能形成强大的冲击波或高速射流，有效地减小、消除与水相之间的阻滞层，加大了传质效率，有助于溶质的扩散。另外，超声波的热效应使水温基本在57℃，对原料有水浴作用。超声波提取与传统的提取方法相比，有提取效率高、时间短、耗能低等优点。超声提取的影响因素有：超声时间、超声频率（一般低频中提取效率高，但也有例外）、料液比和温度等。 1．6 微波提取 微波是频率介于300MHz和300GHz之间的非电离电磁波，微波提取的原理是微射线辐射于溶剂并透过细胞壁到达细胞内部，由于溶剂及细胞液吸收微波能细胞内部温度升高，压力增大，当压力超过细胞壁的承受能力时，细胞壁破裂，位于细胞内部的有效成份从细胞中释放出来，传递转移到溶剂周围被溶剂溶解。微波技术应用于植物细胞破壁，有效地提高了收率。具有穿透力强、选择性高、加
植物多糖及其提取方法 1 前言 多糖是自然界和生物体中广泛存在的物质，它是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。它具有多种生物活性，与生物机能的维持密切相关，与蛋白质、脂类形成的糖蛋白、脂多糖在细胞的识别、分泌以及在蛋白质的加工、转移方面起着不容忽视的作用。近年来，植物、海洋生物及菌类等来源的多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，各种多糖所具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性已相继被发现。我国对多糖研究始于20世纪70年代，植物多糖由于它们独特的功能和低毒性，作为新药发展的方向具有广阔的应用前景，越来越多的研究人员将目光投向植物多糖。 2 植物多糖的结构 植物多糖是由许多相同或不同的单糖以a或p一糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等。多糖有复杂的四级结构，一级结构指糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型及糖链有无分支、分支的位置与长短等；二级结构指多糖主链以氢键为主要次级键而形成的有规则构象；三、四级结构是指以二级结构为基础，糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序地空间产生规则构象。植物多糖的
主链与支链形成了特殊的构型一凹形槽。凹形槽是一级结构与构象的体现。凹形槽的支链与活性关系为：支链度越大，凹形槽越多，生物活性越大。近年来，人们对多糖的结构和活性的研究不断深入，进一步阐明了多糖作用机制与结构的关系，其多样性的生理活性更加受到重视。 3 植物多糖的功能 多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。 (1)免疫调节功能。由于现代医学、细胞生物学及分子生物学快速发展，人们对免疫系统的认识越来越深入。免疫系统紊乱，会导致人体衰老和多种疾病的发生。植物多糖是一种免疫调节剂。多糖对肌体的免疫调节作用，包括激活巨噬细胞，激活网状内皮系统，激活T和B细胞，激活补体，进干扰素的生成，促进白细胞介素的生成，诱生肿瘤坏死因子等。 2)抗肿瘤活性植物多糖主要是通过增强机体的免疫功能来达到杀伤肿瘤细胞的目的，许多高等植物中都含有抗肿瘤活性的多糖，如芦荟多糖、香菇多糖提取物、人参多糖具有
多糖的分离纯化及生理作用 多糖包括植物多糖、动物多糖和微生物多糖。人们已发现多糖不仅是机体的能量来源和骨架成分，而月还具有多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用等多种生物活性。 多糖的提取和纯化 1. 多糖的提取 1.1 热水浸提法：其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥 首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2－5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧化钠的真空干燥器中减压干燥（若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时，可直接冷冻干燥）,干燥后可得粉末状的粗多糖。 1.2 微波辅助提取法： 其原理为利用不同极性的介质对微波能的不同吸收程度，使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使萃取物质从基体或体系中分离出来，进入到介电常数小，微波吸收能力较差的萃取剂中。由于微波能极大加速细胞壁的破裂，因而应用于中草药中有效成分的提取能极大加快提取速度，增加提取产率。而且由于其选择性好，提取后基体能保持良好的性状，提取液也较一般的提取方法澄清。聂金源等在柴胡多糖和黄酮化合物的提取[18]中对微波辅助提取法、超声辅助法和索氏提取法进行比较，发现微波辅助提取法所需时间最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。 1.3 超声辅助法： 其原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取[16]。超声波辅助法与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点[17]。 1.4 索氏提取法： 将植物粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃条件下提取至无色（一般为6小时）。过滤，滤渣挥发干燥完溶媒后加入80%乙醇，再提取6小时，过滤，滤渣乙醇挥发干燥后加蒸馏水。回流提取2次，趁热过滤，滤液减压浓缩，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃干燥，称重。 1.5 醇提法： 先后将90%和50%乙醇加入植物粉末中，振荡充分再抽滤。滤液中加入足量无水乙醇，至于4℃冰箱中过夜。减压抽滤，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通风干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。 醇提法方法简单，易于操作，但提取率较低，乙醇使用量大，不宜大规模提取使用。 2.多糖的纯化方法纯化是将多糖混合物分离为单一多糖的过程，纯化的方法主要有以下几种： 2.1 分部沉淀法根据各种多糖在不同浓度的低级醇或丙酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同浓度下析出的沉淀，经反复溶解与沉淀后，直到测得的物理常数恒定（最常用的是比旋光度测定或电泳检查）。这种方法适合于分离各种溶解度相差较大的多糖。为
四大经典核酸纯化方法 核酸抽提与纯化是分子生物学试验的基础，核酸纯化方法是影响提取核酸质量高低的最重要因素，也是下游分子生物学试验成败的关键。目前常见的核酸纯化方法有PC 抽提/醇沉淀方法、高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法、离心柱法和生物磁珠法，这几种方法各有其优势和劣势。 一、PC抽提法 PC 抽提是去除蛋白质有效的手段，但超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。且每次抽提都会损失部分核酸。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除DNA 的特点，在RNA 抽提时获得DNA 残留极少的RNA。不过有一点要提醒的是，某些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用PC 抽提的，否则核酸必定降解。PC抽提最大的优势是成本低廉，对实验条件要求较低，对于经费紧张的实验室较为实用。 二、高盐沉淀法 高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松的去除蛋白质所可以用于大规模抽提，但其不足之处是纯度(蛋白质残留) 不够稳定，蛋白质的沉淀效率在4℃会更好一些。 三、离心柱法 离心柱纯化法，是目前试剂盒提取广泛应用的方法。其最大特点是受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高(虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底。其致命弱点是样品过量，提取效率较低，且需要反复离心，操作复杂，成本也较高。 四、生物磁珠法 生物磁珠法是将纯化介质包被在纳米级生物磁珠表面，通过介质对核酸的吸附，在外加磁场下使核酸附着于磁珠定向移动，从而达到固液分离纯化的作用。 威斯腾生物400-675-6758
多糖的提取和纯化 多糖的提取和纯化多糖的提取和纯化摘要本文较 详细地介绍了多糖的提取和纯化方法，为多糖的研究和生产提供参考依据。关键词多糖；提取；纯化；活性炭多糖（polysacharides，PS），又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过苷键连接而成的，具有广泛生物活性的天然大分子化合物。它广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物（细菌和真菌）与动物体内。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作为广谱免疫促进剂，具有免疫调节功能，能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系统疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用[10]，黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗辐射，增强免疫功能等生物学作用[6]，麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用[7-8]，动物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，银杏外种皮粗多糖具有抗衰老、抗过敏、降血脂、止咳祛痰、减肥等功能[11]。另外，多糖作为药物，其毒性极小，因而多糖
的研究已引起人们极大的兴趣。由于多糖具有的生物活性与其结构紧密相关，而多糖的结构又是相当复杂的，所以在这一领域的研究相对缓慢。但人们在多糖的分离提取与纯化方面已做出了不少工作。1. 多糖的提取[12]1.1 热水浸提法：1.1.1多糖提取条件的优选根据文献报道[13]：影响热水浸提多糖的因素主要有提取时间、提取次数、溶剂体积、浸提温度、pH值、醇析浓度和植物颗粒大小等。在试验前对上述多种因素利用正交实验法做出优选，才能选出最佳提取方案。1.1.2其步骤为：原料→粉碎→脱脂→粗提（2－3次）→吸滤或离心→沉淀→洗涤→干燥首先除去表面脂肪。原料经粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加热搅拌或回流1－3小时，脱脂后过滤得到的残渣一般用水作溶剂（也有用氢氧化钾碱性水液、氯化钠水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氢氧化钠作为提取溶剂）提取多糖。温度控制在90－100℃，搅拌4－6小时，反复提取2－3次。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤。也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上清液混合（得到的多糖若为碱性则需要中和）。然后浓缩，再加入2 －5倍低级醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，与多糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤。将洗干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷和氢氧
食用菌多糖的提取方法有水提法、碱提法和酶提法等，其中酶提法是利用酶对细胞结构的破坏作用，使存在于细胞内部的多糖释放出来，从而提高了多糖的得率。 本次实验采用纤维素酶和果胶酶对紫蘑菇进行水解，研究香菇多糖的最佳提取工艺，并探讨蘑菇粒度、蘑菇溶解方法以及酶法提取中多糖提取效果的评价方法。 可以同步做三组对比试验：⑴采用水提，不加酶；⑵采用酶法提取；⑶采用酶空白（只加酶，不加蘑菇粉）。 由于酶中也含有少量的糖类成分，其存在将会对蘑菇多糖的提取产生影响。因此，在计算酶法提取多糖的效果时，要减去酶本身所引入的糖。在确定最佳酶浓度时更要考虑。 一、实验流程：蘑菇干燥→粉碎过筛→加水浸泡0.5h→调PH→加入纤维素酶→提取→离心过滤→测多糖提取率 式中：n一提取液稀释倍数； C一提取液中多糖的浓度（mg/mL）； V一提取液体积（mL）； m一蘑菇的质量（mg）。 测定时取三个平行样，结果数据为平行样的平均数值。 二、具体实验步骤： 1、多糖标准曲线的绘制 精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖标准品100mg,置于100 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL分别置于50 mL 容量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀。精密吸取上述各种溶液2.0 mL,分别加入5%苯酚溶液1.0 mL,摇匀,迅速加入5.0 mL浓硫酸,振摇5min,置沸水浴上加热15 min,然后置冷水浴中冷却30 min,随行空白,在490 nm波长处测定吸光度。以标准溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并计算其标准曲线回归方程。 （1）精密度试验:精密吸取1.0 ml供试液按“标准曲线的制备”项下操作，分别测定吸光度，求得RSD。 （2）重现性及多糖含量测定:精密称取巴西蘑菇多糖0.1000g，按“供试液
核酸提取纯化系统参数要求 一、数量：一套 二、预算：230000元 三、技术参数 1.用途：全自动核酸提取纯化系统，标签蛋白纯化、噬菌体淘洗、食源性微生物（O157大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏杆菌等）富集无需离心或过滤操作, 核酸产物直接用于定量PCR检测、测序； 2.适用样本来源：血液、体液、动植物组织、拭子、培养细胞、细菌、病毒、土壤等标本； 3.工作原理：磁珠法，可在不同样品板/管间移动，经转移、洗脱、释放等步骤，直接提取纯化核酸，蛋白等样品； 4.样品通量：> 20个； 5.工作体积：30-5000μl，至少配两种磁头，标准磁头30-1000μl；大体积磁头200-5000μl；洗脱体积：30-200μl或更宽泛； 6.仪器自动装卸磁套，由软件制定任意放置位置，无需手工操作； 7.有温度控制功能，最高温度75℃或以上，温度精准度：±1℃； 8.有独立于96深孔板的洗脱模块，洗脱模块同时有加热和制冷模块，产物可设置低温保存，低温至4℃，维持样本的生物活性； 9.含中文、英文在内9种语言彩色图形化用户界面，实时显示温度和实验进程信息，倒计时显示，可独立使用，无需电脑； 10.主机内置程序分类管理功能，至少具有200个程序存储空间； 12.提供专门的磁珠纯化配套软件，可由用户独立，自由编程，或导入现成试剂
盒运行程序，还可导出并保存纯化程序、可由用户优化设置程序步骤，输出运行报告，具有样本及耗材信息管理和追溯功能，具有用户管理权限设置功能，提供10种以上不同规则，灵活自定义用户权限，可配备条码阅读器； 13.振荡模式：至少5种混匀速度方式与时间自由循环组合，有磁珠预收集、干燥、暂停等多种动作设置； 14.试剂开放并兼容用户自定义实验方案：兼容进口或国产磁珠试剂； 15.可提供原厂预分装试剂盒； 16.内置紫外灯用于方便、有效的杀菌； 17.提供原厂技术支持和售后服务； 18.具有CE认证，具有CDFA国家级医疗器械注册证； 19.要求在签订合同后三十天内完成供货。
核酸的提取、纯化和电泳检测实验报告 分子生物学实验山东大学生命科学学院 核酸的提取、纯化和电泳检测 摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA 的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，本实验采用碱变性法提取E.coli DH5α中Puc19质粒DNA，并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最后获得纯度较高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用RNase 消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质，学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。关键词质粒DNA 碱变性提取法琼脂糖凝胶电泳细菌染色体DNA
引言 1. 核酸分离纯化 1.1总原则 保证核酸一级结构的完整性 化学损伤——缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失； 物理损伤——动作轻柔以减少机械剪切力；尽量低温操作以减少高温损伤； 生物降解——加入相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染 蛋白质——苯酚/氯仿/蛋白酶K RNA污染——RNase 其他DNA——区别变性与复性 有机溶剂——萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子——乙醇沉淀与洗涤 1.2核酸纯化应达到的要求 核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子的污染应降到最低程度排除其他核酸分子的污染 1.3核酸提取的一般过程 破碎细胞（防止核酸酶的作用） 破碎抽提核酸(裂解细胞释放内容物)——关键步骤 核酸的纯化除去杂质（蛋白质、脂类、核酸）4°C最佳和最简单；-70°C是长期保存的良好温度，为一次性保存；-20°C 核酸样品的保存（主要条件时温度和介质）-TE缓冲液最常用
植物多糖的功能 多糖与蛋白质一样，具有生物大分子的复杂结构，具有一定的生理和生物学活性，概括起来多糖的生物活性包括：免疫调节性、抗肿瘤活性、降血糖活性、降血脂活性、抗病毒活性、抗衰老活性(抗氧化活性)、抗疲劳、抗突变活性，除此之外，还具有其他生物活性，包括抗凝血、抗炎、抗菌、抗惊厥、镇静、止喘及降血压等作用。 植物多糖的提取 一、植物多糖的提取 1 溶剂提取法 1．1 水提法 水对植物组织的穿透力强，提取效率高，在生产上使用安全、经济。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。一般植物多糖提取采用热水浸提法，该法所得多糖提取液可直接或离心除去小溶物；或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖进行分离；其中，以乙醇沉淀最为普遍。但以根茎为主的植物体,细胞壁多糖含量高,热水直接提取率不高。此时为破坏细胞壁,增加多糖的溶出，有两种处理方法:一为酶解,二为弱碱溶解。 1．2酸碱提法 有些多糖适合用稀酸提取，并且能得到更高的提取率。但酸提法只在一些特定的植物多糖提取中占有优势，目前报道的并不多。而且即使有优势，在操作上还应严格控制酸度，因为酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂。 有些多糖在碱液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。采用的稀碱多位为0．1mol／L氢氧化钠、氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾。同样，碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸提类似，碱提中碱的浓度也应得到有效控制，因为有些多糖在碱性较强时会水解。另外，稀酸、稀碱提取液应迅速中和或迅
核酸提取纯化常见问题解答 1.AccuPrep?凝胶回收试剂盒常见问题 2.AccuPrep?基因组DNA提取试剂盒常见问题 3.AccuPrep?GMO提取试剂盒常见问题 4.AccuPrep?PCR纯化试剂盒常见问题 5.AccuPrep?质粒提取试剂盒常见问题 6.AccuPrep?粪便DNA提取试剂盒常见问题 7.AccuPrep?病毒RNA提取试剂盒常见问题 8.琼脂糖凝胶回收和PCR纯化常见问题 9.质粒DNA提取操作常见问题 AccuPrep?凝胶回收试剂盒↑TOP Q1. 产量低 A1. 1）凝胶不完全溶化会导致DNA产量的降低。离液盐不足不仅会导致凝胶溶化不完全，DNA被包裹不能释放到溶液中，而且还降低柱子对DNA的亲和力，最终导致DNA产量降低。 2）加入等量的无水乙醇到W缓冲液中了吗? 过浓的W缓冲液会将DNA洗脱，从而导致产量的降低。 3）错误的洗脱缓冲液会降低产量. 洗脱缓冲也不能包含过多的盐. 缓冲液的pH 应调至7.0-8.5。 4）错误的结合条件例如pH过高会导致产量的降低GB缓冲液含有pH指示剂，当颜色为黄色时表示pH 在正常范围内。如果颜色为红色或橘黄色，表示pH已经超出了正常的范围。这时应该加入几滴醋 酸钠溶液去调整pH值到正常范围内。 5）放入了过多的琼脂糖凝胶块。如果放入了超过400mg的琼脂糖凝胶块可能会降低DNA结合柱的吸附力，从而导致DNA产量的降低。 Q2．琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中 A2.琼脂糖凝胶样品悬浮在溶液中，这可能是因为样品中含有WB缓冲液。WB缓冲液中的乙醇会导致悬浮，这种情况下离心样品三次。如果悬浮的状况依然存在，那么打开盖子空气中放置10分钟挥发乙醇，再离心一次。