体外抗氧化实验方案
一、DPPH自由基清除法
[原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
ON2
NONN2
NO2
当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]
1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M
取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 Vc溶液
(0.25mg/ml)
称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液
1.3 预试
取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、
200μL。浓度梯度mg/ml为
0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400
μg/ml 2.5、5、 10、20、40
1.4 测量
A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。 0 A值的测量:
取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。加样表如下:
表1 加样表
样品液甲醇总体积 DPPH测试液
30μL 970μL 2 mL 3mL
60μL 940μL 2 mL 3mL
120μL 880μL 2 mL 3mL
240μL 760μL 2 mL 3mL
480μL520μL 2 mL 3mL
1.5 正式测量
方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A. 0
[实验结果]
清除率(抑制率)的计算公式:
AA,0 Inhibition % = 100%，A0
二、FRAP法分析维生素C抗氧化作用实验原理:
3+参照Benzie与Strain的方法，原理为Fe-三吡啶三吖嗪(TPTZ)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色3并于593nm处具有最大光吸收，根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。
实验试剂
醋酸钠(三水)，冰醋酸，TPTZ，FeCl3?6HO，FeSO4?6HO 22
不同梯度FeSO4溶液配制:称取695mgFeSO?6HO，定容至25ml，即100mM，按梯度配42
制成10、25、100、150、200、400、500μM溶液
TPTZ工作液配制:
(1)称取1.02g乙酸钠(三水)，加4ml冰醋酸，定容至25ml(调整pH=3.6) (2)称取TPTZ粉末 7.8mg(小心腐蚀皮肤)，溶于2.5ml 40mM HCl溶液中，溶液澄清透明。 (3)称取1.35g FeCl3?6HO 溶于25ml水中，取2.5ml溶液定容至25ml，即20mM的FeCl溶23液。混匀三种溶液(10:1:1)制成TPTZ工作液，现配现用。
不同梯度Vc溶液配制:
取Vc溶于水，配成含Vc5、10、20、30、40、50μg/ml溶液(预实验)
实验步骤
(1)标准曲线的测定:按10:1:1比例，精确量取醋酸钠溶液，TPTZ溶液和不同梯度FeSO溶4液，混匀后于37?反应10min，测定593nm处吸光度，以醋酸钠溶液调零。以FeSO坐浓度为纵4标(表示为FRAP值)，吸光度为横坐标，绘制FRAP标准曲线。
(2) 取100μL不同浓度的Vc溶液，加入1.9mlTPTZ工作液混匀后37?反应
30min，测定593nm
处吸光度，以醋酸钠溶液调零，样品抗氧化活性(FPAP value)以达到同样吸光度所需的FeSO4
表示。进行平行实验。毫摩尔数
九、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test 1 范围 本规范规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则、要求和方法。 本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。 2 规范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997) 3试验目的 本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性。 4 定义 染色体型畸变(Chromosome-type aberration)：染色体结构损伤，表现为在两个染色单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 染色单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 染色体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染色体数目的变化。 结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染色体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。 有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。 5 试验基本原则 在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。 6 试验方法 6.1 试剂和受试物制备 6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚硝基脲(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。 6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。 6.1.3 受试物 6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必
《免疫调节》教学设计 教材：人教版《普通高中课程标准实验教科书生物必修3 稳态与环境》第2章第4节一、教学背景分析 （一）教材的地位与作用 “第4节免疫调节”包括“免疫系统的组成”“免疫系统的防卫功能”“免疫系统的监控和清除功能”及“免疫学的应用”四部分内容。分2课时学习：第1课时，免疫系统及免疫的类型；第2课时，免疫失调引起的疾病及免疫学的应用。 教材将免疫系统列为调节系统之一，突出免疫系统对于机体稳态维持的作用，意在从更深层次上揭示生命活动的整体性，对于引导学生认识生命系统结构和功能的整体性具有重要的意义。同时也揭示了机体内各个系统之间联系的复杂性和多样性，说明了生命现象内在联系之间的普遍性。 另外，免疫学知识涉及到我们生活的方方面面，与学生的实际生活联系较多，将其放在必修模块对于全体高中学生“形成积极健康的生活方式”是不可或缺的。 （二）教学对象分析 免疫调节内容在义务教育教材中就已经涉及，艾滋病、过敏反应以及免疫学的应用的相关知识，学生已经通过报刊杂志、广播电视等传播媒体有所了解。教师的任务是要结合学生已有的认识，让学生从生物学角度作科学的了解，同时要注意引导学生形成正确的科学价值观，激发学生的责任感。 （三）对教学目标的阐述 根据课程标准的要求、本节教材特点及学生的认知情况，把教学目标拟定如下： 1.知识与技能目标： （1）概述免疫系统的组成。 （2）概述免疫系统在维持稳态中的作用。 （3）通过探讨分析体液免疫和细胞免疫的机制。 （4）关注艾滋病的流行和预防。 （5）培养从报刊杂志、互联网中直接获取资料或数据的能力。 2.过程与方法目标： （1）通过资料搜集、讨论的形式了解艾滋病及其防治。 （2）以图解、问题串、和讨论的方式学习免疫系统的防卫功能。 3.情感态度与价值观目标： （1）让学生了解艾滋病发展的严峻形势，以及每一个人的责任和义务。 （2）了解艾滋病的病因和预防，认识到艾滋病患者是HIV的受害者，需要得到我们的关爱。 （3）倡导关爱健康、珍爱生命的生活理念。 （四）重、难点的分析与突破
1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度
2010-2017年部分免疫调节高考题整理 （2010全国新课标卷T2）下列关于免疫细胞的叙述，错误的是 A．效应T细胞可以释放淋巴因子 B． T淋巴细胞可以产生多种抗体 C．吞噬细胞和淋巴细胞均属于免疫细胞 D.一个效应B淋巴细胞只能产生一种抗体 【答案】B 解析：抗体是由效应B细胞产生的，而效应T细胞能产生淋巴因子。（2011高考大纲卷T5）研究发现两种现象：①动物体内的B细胞受到抗原刺激后，在物质甲的作用下，可增殖、分化为效应B细胞；②给动物注射从某种细菌获得的物质乙后。此动物对这种细菌具有了免疫能力。则这两种物质中 A．甲是抗体，乙是抗原 B.甲是抗体，乙是淋巴因子’ C.甲是淋巴因子，乙是抗原 D.甲是淋巴因子，乙是抗体 【答案】C （2011年新课标卷T30）（10分）回答问题： （1）人体肝细胞可产生一种分泌蛋白（称为蛋白A），运出细胞后进入血液。已知内质网、核糖体和高尔基体参与了蛋白A的合成或运输，则这些细胞器在蛋白A合成和运输过程中行使功能的顺序是______、_______、________。人体的胰岛细胞中________（含有、不含有）蛋白A基因。 （2）为了研究小鼠在接受大肠杆菌碱性磷酸酶（AKP）刺激后其体内抗体水平的变化，提取大肠杆菌AKP，注射到小白鼠腹腔内，进行第一次免疫。一段时间后，检测到抗体水平达到峰值。在这个过程中，_________细胞在淋巴因子的作用下增值、分化形成的_______细胞可以产生抗体。经过一段时间后，再用大肠杆菌AKP进行第二次免疫，________可以快速增殖、分化并产生大量抗体。上述免疫属于__________（特异性、非特异性）免疫。 【答案】（1）核糖体? 内质网? 高尔基体? 含有? （2）B? 浆? 记忆? 特异性。 【解析】分泌蛋白先由内质网上的核糖体初步合成，然后由内质网和高尔基体依次进行加工、包装和运输。这反应了细胞器之间的分工协作，也是反应生物膜在结构与功能方面相互联系的实例。
抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在
着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果
体外抗氧化实验方案 一、DPPH自由基清除法 [原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 ON2 NONN2 NO2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M 取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 Vc溶液 (0.25mg/ml) 称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、 200μL。浓度梯度mg/ml为 0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400 μg/ml 2.5、5、 10、20、40 1.4 测量 A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。 0 A值的测量: 取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。加样表如下: 表1 加样表 样品液甲醇总体积 DPPH测试液 30μL 970μL 2 mL 3mL 60μL 940μL 2 mL 3mL 120μL 880μL 2 mL 3mL 240μL 760μL 2 mL 3mL 480μL520μL 2 mL 3mL 1.5 正式测量 方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A. 0 [实验结果] 清除率(抑制率)的计算公式:
细胞株在适当的培养基中保持10% FBS。 从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。 #22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司 (12384 - 1 - ap)。抗ub (P4D1)、抗rpa32 (9H8)、抗brca1 (D9)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗rad51 (N1C2)是从GeneTex购买的。反 γH2AX(05 - 636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05 - 1572) 从微孔被购买。Anti-BRCA2(推上a303国道- 435 a)和 anti-γH2AX架a300型(- 081 a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1 (NB100-304)购自Novus Biologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HA anti-β-actin抗体 购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。 CRISPR / Cas9敲除 (sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAAT CCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCC ACCTCGG-3′)。gRNA序列被克隆到载体中。 LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染 sgRNA-puro随后与2μg /毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆 抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。 重组蛋白表达和下拉试验。 构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列 被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21 (DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15 h在18°C添加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞 然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物 用16000g离心30min，得到的上清液与他的Mag Sepharose Ni (GE Healthcare)孵育，纯化His- rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化 分别是GST和GST- uchl3蛋白。 体外GST-UCHL3拉试验,50μg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5% BSA 在4°C 2 h其次是孵化与50μg His-UCHL3额外2 h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his 抗体检测His-RAD51，用Coomassie blue染色GST-UCHL3 体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验 对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除 U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL 62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2% SDS、10%甘油,20毫米NEM,1
免疫调节 、考纲要求: 二、考点梳理： 考点1、免疫系统的组成 1、免疫器官是免疫细胞________ 、_________ 和________ 的场所，主要有____________ 、 ___________ 、淋巴结、脾脏和扁桃体。 2、免疫细胞是指发挥免疫作用的细胞，位于________ 、______ 和淋巴结中，主要有吞噬细胞， ________ （在胸腺中成熟）、 _______ （在骨髓中成熟）、 ______ 、________ 、___________ 等。 3、免疫活性物质由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质，主要有浆细胞产生 的_________ 、T细胞产生的__________ 和溶酶体。 思考：1、抗体的分布、化学本质、来源和作用分别是什么？抗毒素、凝集素与抗体有何关系？ 2、抗原的特性有哪些？外毒素、凝集原与抗原有何关系? 例1、挪威科学家最新的研究显示，气候变暖将提高人类患腺鼠疫的可能性。这种疫病是由鼠疫杆 菌（宿主为啮齿动物）引起的，鼠疫杆菌释放类毒素，使患者出现中毒性休克综合征。科学家从病愈患者的血清中提取的抗毒素对腺鼠疫患者有显著疗效。下列说法正确的是（） A. 类毒素是一种抗原，能引起人体的免疫反应 B. 抗毒素是一种抗体，是由效应 T细胞产生的淋巴因子 C?类毒素和抗毒素的化学本质都是蛋白质 D .该免疫过程属于细胞免疫 变式1、如图表示人体内各类血细胞生成的途径，a?f表示不同种类的细胞，请你判断下列说法中错误的是 _吞瞬细血 — f +舷皿T创H月包 A. 造血干细胞形成多种细胞，要经过细胞增殖和细胞分化过程 B. 各类细胞来源相同但功能不同，根本原因是不同细胞表达的基因不同 C. c和d在不同的场所发育而成 D. 当再次受抗原刺激后，机体具有更强烈的免疫反应，主要与 c和d有关 变式2、可被人体免疫系统直接识别的是（） A. 血液中Q浓度的变化 B.血糖浓度的变化 C?环境中温度的变化 D .感染人体的流感病毒 变式3、将同种大鼠分为A、B两组，A组大鼠除去淋巴细胞后，产生抗体的能力丧失：从B组大 鼠中获得淋巴细胞并转移到 A组大鼠后，发现A组大鼠能够重新获得产生抗体的能力。请回答： （1）、上述实验可以说明_____________ 是免疫反应所需的细胞. ⑵、为了证明接受了淋巴细胞的 A组大鼠重新获得了产生抗体的能力，需要给 A组大鼠注射，任何检测相应的抗体。 （3）、动物体内能产生特异性抗体的细胞称为________ 。在抗体，溶菌酶、淋巴因子和编码抗体
附件1： 抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重 1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基 1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶 1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽 1.2 人体试食试验 1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.2.2 超氧化物歧化酶 1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。 2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。 2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。 2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。
抗氧化功能检验方法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 动物实验 1.1 实验动物 选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。 1.2 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3 实验方法 1.3.1 老龄动物 选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型 1.3. 2.1原理 D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。 1.3. 2.2造模方法 选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.3 乙醇氧化损伤模型 1.3.3.1原理
楮实提取物体外抗氧化活性的研究（作者： _________ 单位：___________ 邮编：___________ ） 作者：吴兰芳张振东景永帅杨娟 【摘要】目的探讨楮实提取物的体外抗氧化活性。方法先用80% 乙醇，然后用蒸馏水对楮实进行提取。其中醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分经醇沉、干燥后得到楮实粗多糖。运用羟基（?OH）自由基体系、二苯代苦味基肼（DPPH ）?自由基体系和对 Fe3+的还原能力实验，比较楮实各提取物的抗氧化活性。结果楮实提取物对?OH自由基和DPPH ?自由基均有较好的清除作用，其中总醇提取物对? OH自由基的清除能力最强，其IC50值为0.28 mg/ml;乙酸乙酯提取物对DPPH ?自由基的清除效果最好，其IC50值达到0.08 mg/ml ;各提取物对Fe3+均有较强的还原能力，乙酸乙酯提取物还原效果最为明显。结论楮实提取物具有一定的抗氧 化活性，在抗衰老方面有广泛的应用前景。 【关键词】楮实；抗氧化活性；清除自由基；还原力 【Abstract ] Objective To study the antioxidant activities of extracts from Broussonetia papyrifera in vitro. Methods B.
papyrifera was treated with 80% etha nol and the n the residue was extracted with water. The etha nol extract were extracted respectively by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n _buta nol. At the same time, crude polysaccharide was obta ined by etha nol precipitati on from water extract. The an tioxida nt activities of the above extracts in vitro were compared by the hydroxyl free radical ( OH), DPPH free radical (DPPH )and deoxidization Fe3+ reacti on system. Results The extracts from B. papyrifera had good scavenging effect on the hydroxyl free radical and DPPH free radical. Etha nol extract had the best scave nging effect on hydroxyl free radical system, which corresponding IC50 value was 0.28 mg/ml. Ethyl acetate extacts had the best scavenging effect on DPPH free radical, which corresponding IC50 value reached to 0.08 mg/ml. All of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+. Among of them, ethyl acetate extracts had significant deoxidizati on ability. Con clusi ons Brouss on etia papyrifera has stronger antioxidant activities and will be widely applicated on anti Jaging. 【Key words ] Broussonetia papyrifera; Antioxidant activity; Radical scave nging; Deoxidizati on 楮实子具有活血理气、补肾清肝、明目、利尿的功效，多用于腰膝酸软、虚劳骨蒸、头晕目眩、目生翳膜、水肿胀满等症〔1，2〕。 一些含楮实子的经典方药经多年临床验证具有确切的抗衰老、促智作
免疫调节 题组1免疫系统的组成与功能 1.[2016上海,17,2分]非特异性免疫和特异性免疫在抗原特异性方面显著不同。此外,这两者的主要区别还表现在() 区别非特异性免疫特异性免疫 ①具有免疫持久性具有免疫短促性 ②对抗原缺乏记忆功能对抗原具有记忆功能 ③涉及巨噬细胞的吞噬作用不涉及巨噬细胞的功能 ④包含抗原诱导的细胞增殖与分化不存在免疫细胞的增殖与分化 A.① B.② C.③ D.④ 2.[2016海南,16,2分]下列有关免疫的叙述,正确的是() A.免疫系统相对独立,既不受神经调节,也不受体液调节 B.吞噬细胞可吞噬病原体,也可加工处理病原体使抗原暴露 C.类风湿性关节炎和获得性免疫缺陷综合征均为自身免疫病 D.免疫系统能消灭入侵的病原体,不能清除体内的异常细胞 3.[2015新课标全国卷Ⅱ,5,6分]下列与病原体有关的叙述,正确的是() A.抗体可以进入细胞消灭寄生在其中的结核杆菌 B.抗体抵抗病毒的机制与溶菌酶杀灭细菌的机制相同 C.Rous肉瘤病毒不是致癌因子,与人的细胞癌变无关 D.人感染HIV后的症状与体内该病毒浓度和T细胞数量有关 4.[2015北京理综,1,6分]乙肝疫苗的有效成分是乙肝病毒的一种抗原。接种该疫苗后,人体会产生相应抗体。该抗体() A.由T淋巴细胞产生 B.可与多种抗原结合 C.可裂解乙肝病毒 D.可被蛋白酶水解 5.[2014大纲全国卷,3,6分]下列关于人体淋巴细胞的叙述,错误的是() A.在胸腺中发育成熟的T淋巴细胞可参与细胞免疫 B.效应T细胞可攻击被病原体感染的宿主细胞 C.T淋巴细胞和B淋巴细胞都是由造血干细胞发育成的 D.T细胞释放的淋巴因子不能使受到抗原刺激的B细胞增殖 6.[2017北京理综,31,16分]疟原虫是一种单细胞动物。它能使人患疟疾,引起周期性高热、寒战和出汗退热等临床症状,严重时致人死亡。 (1)在人体内生活并进行细胞分裂的过程中,疟原虫需要的小分子有机物的类别包括 (写出三类)。 (2)进入血液循环后,疟原虫选择性地侵入红细胞,说明它能够并结合红细胞表面受体。
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
【最新整理，下载后即可编辑】 3.2.5 体外抗氧化实验 发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。 （1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率： () %100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (1) 式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。 注意事项： 1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,
或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不 写，要么写着 “G ”。 2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪 头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。 3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个 平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。 4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人 换枪。 （2）对DPPH ·的清除作用 DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。 取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以无水乙醇为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率： () %100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (2) 式中A 对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 无水乙醇补充体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无DPPH·的反
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
专题十七免疫调节 考点一免疫系统的调节与功能 1.(2015·福建卷，2)有一种胰岛素依赖型糖尿病是由于患者体内某种T细胞过度激活为效应T细胞后，选择性地与胰岛B细胞密切接触，导致胰岛B细胞死亡而发病。下列叙述正确的是( ) A.这种胰岛素依赖型糖尿病属于自身免疫病 B.患者血液中胰岛素水平高于正常生理水平 C.效应T细胞将抗原传递给胰岛B细胞致其死亡 D.促进T细胞增殖的免疫增强剂可用于治疗该病 解析本题考查免疫调节相关知识，考查识记和理解能力。难度适中。由于免疫系统异常敏感、反应过度，将自身物质当做外来异物进行攻击而引起的疾病就是自身免疫病，依题意患者体内过度激活的效应T细胞与胰岛B细胞密切接触导致死亡而发病应属于自身免疫病，A正确；胰岛B细胞受损，胰岛素分泌减少，患者的胰岛素水平应低于正常水平，B 错误；效应T细胞直接与胰岛B细胞密切接触，使其裂解死亡，C错误；免疫增量剂促进T细胞增殖将导致效应T细胞数目增多，继而加重病情，D错误。 答案 A 2.(2015·天津卷，2)鸡霍乱病原菌易致鸡死亡。1880年，巴斯德用久置的鸡霍乱病原菌对鸡群进行注射，意外发现全部鸡存活。再次培养新鲜病原菌，并扩大鸡的注射范围，结果仅有部分鸡存活。进一步调查发现，存活鸡均接受过第一次注射。下列分析正确的是( ) A.第一次注射时，所用的鸡霍乱病原菌相当于抗体 B.第一次注射后，鸡霍乱病原菌诱导存活鸡产生了抗性变异 C.第二次注射后，存活鸡体内相应记忆细胞参与了免疫反应 D.第二次注射后，死亡鸡体内没有发生特异性免疫反应 解析本题考查免疫调节的相关知识，考查识记和理解能力。难度中等。鸡霍乱病原菌能引起鸡产生特异性免疫过程，所以第一次注射时，所用的鸡霍乱病原菌相当于抗原，A错误；在选择过程中，变异是不定向的，是本来就存在的，而选择是定向的，第一次注射前，鸡中本来就存在抗性个体和非抗性个体，注射鸡霍乱病原菌后选择了抗性的个体，故抗性个体并非鸡霍乱病原菌诱导产生，B错误；第一次注射后，在抗原的刺激下，鸡体内产生
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified