3.2.5 体外抗氧化实验
发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用
利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：
()
%100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (1)
式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10
mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光
度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10
mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：
1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，
不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精
准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精
准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、
测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用
DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以无水乙醇为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率：
()
%100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (2)
式中A 对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 无水乙醇补充
体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检
样品后的无DPPH·的反应体系的吸光度（用3mL 无水乙醇补充体积）。
上述是针对那些遇酒精不浑浊的情况
注意事项：
1、 本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个
比色皿要一致。石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”；玻璃比色皿要
么什么都不写，要么写着 “G ”。
如果样品遇到酒精大量浑浊，则
DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以纯水为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率：
()%100A A A -A ?-=
对照样品空白样品对照清除率 (2) 式中A
对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 纯水补充体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样
品后的无DPPH·的反应体系的吸光度（用3mL 纯水补充体积）。
（3）对羟自由基的清除作用
在一系列50 mL 具塞试管中加入0.8 mL 的HAc —NaAc 缓冲溶液
(0.2mol/L,pH=5.0)，1.0 mL的孔雀绿溶液(100mL,纯水配制，1×10-4 mol·L-1)，2.2 mL的EDTA—Fe2+溶液(2×10-2 mol·L-1,注意不要吸入底部沉淀，沉淀太多则滤纸过滤后使用，以防止不均匀)，1.4 mL的H2O2溶液(体积分数为0.3%，每次用新的，不超过一个月)，用去离子水稀释到10 mL并涡旋振荡混匀，放置45 min后，在617 nm下测定其吸光度A b，同时测定不加H2O2时体系在617 nm下的吸光度如A0，则羟自由基的产生量△A=A0-A b。△A越大，表示生成的羟自由基越多。
上述体系中加入H2O2之前放1 mL待测样品，测定其吸光度A s，则羟自由基清除率可按下式计算：
清除率×100%
(3)
式中A s0为加入待测样品后未加H2O2的反应体系的吸光度。
注意事项：
1、本实验所用的两个比色皿杯子可以石英也可是是玻璃的，但是两个
比色皿要一致。石英的，上面会写着“Q”,或“S”；玻璃比色皿要
么什么都不写，要么写着“G”。
2、H2O2 要稀释十倍再使用，母液是3%的尽量用新买的双氧水。
3、EDTA-Fe2+溶液有浑浊和沉淀，影响实验效果，配置后，立即一层
滤纸过滤，用滤液测定，每次测定时注意底部有无沉淀，和结晶析
出，如有，请过滤后使用，以保证每个试验点的试剂是均一的。
4、孔雀绿溶液按需配置，因为含铜离子。
5、注意每一试验管的最后体积为10ml，由于先加的在试管底部，后加
在试管顶部，为混合均匀，请用涡旋振荡器涡旋振荡试管，确保肉
眼看到上下颜色均一。设计实验时请计算好要补充的水的体积，打
印或抄写好。养成好习惯。
6、每天的实验都要测定1%Vc的祛自由基效果，以便于横向和纵向比
较。
实验室常用溶液及试剂配制 一、实验室常用溶液、试剂的配制-------------------------------------------------------1 表一普通酸碱溶液的配制 表二常用酸碱指示剂配制 表三混合酸碱指示剂配制 表四容量分析基准物质的干燥 表五缓冲溶液的配制 1、氯化钾-盐酸缓冲溶液 2、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 3、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钾缓冲溶液 4、乙酸-乙酸钠缓冲溶液 5、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液 6、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液 7、氨水-氯化铵缓冲溶液 8、常用缓冲溶液的配制 二、实验室常用标准溶液的配制及其标定-----------------------------------------------4 1、硝酸银（C AgNO3=0.1mol/L）标准溶液的配制 2、碘（C I2=0.1mol/L）标准溶液的配制 3、硫代硫酸钠（C Na2S2O3=0.1mol/L）标准溶液的配制 4、高氯酸（C HClO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 5、盐酸（C HCl=0.1mol/L）标准溶液的配制 6、乙二胺四乙酸二钠（C EDTA =0.1mol/L）标准溶液的配制 7、高锰酸钾（C K2MnO4=0.1mol/L）标准溶液的配制 8、氢氧化钠（C NaOH=1mol/L）标准溶液的配制 三、常见物质的实验室试验方法 ----------------------------------------------------------6 1、柠檬酸（C6H8O7·H2O） 2、钙含量测定（磷酸氢钙CaHPO4、磷酸二氢钙Ca（H2PO4）2·H2O、钙粉等） 3、氟（Fˉ）含量的测定 4、磷（P）的测定 5、硫酸铜（CuSO4·5H2O） 6、硫酸锌（ZnSO4·H2O） 7、硫酸亚铁（FeSO4·H2O） 8、砷 9、硫酸镁（MgSO4） 四、维生素检测--------------------------------------------------------------------------------8 1、甜菜碱盐酸盐 2、氯化胆碱
1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度
实验室常用试剂、缓冲液的配制 1 MTris-HCI(pH7.4,7.6,8.0) 组份浓度1 MTris-HCI 配制量1 L 配制方法1.称量121.1 gTris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 4. 将溶液定容至1 L。 5. 咼温咼压火菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1 C,溶液的pH值大约降低0.03个单位。 1.5 MTris-HCl(pH8.8) 组份浓度1.5 MTris-HCl 配制量1 L 配制方法1.称量181.7 gTris置于1 L烧杯中。 2. 加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调节pH值至8.8。 4. 将溶液定容至1 L。 5. 高温高压火菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化 差异很大，温 度每升高1 C,溶液的pH值大约降低0.03个单位。 10 X TEBuffer(pH7.4,7.6,8.0) 组份浓度100 mMTris-HCl,10 mMEDTA 配制量1 L 配制方法1.量取下列溶液，置于 1 L烧杯中。 2. 向烧杯中加入约800ml的去离子水，均匀混合 3. 将溶液定容至1 L后，高温高压火菌。 4. 室温保存。 3 M醋酸钠(pH5.2) 组份浓度配制量配制方法PBSBuffer 组份浓度137 mMNaCl,2.73 M琴磁柚 IQO ml 1. N.1OAC - 3H.OH于100-200 m：疑杯中.加人對40讪的去两子水披扌半渚孵 2、加入冰酯敌讷帑pH值至4 3加去离子庆粕増液證容至20ml. mMKCl,10 mMNa2HPO4,2 mMKH2PO4 配制量1 L 配制方法1.称量下列试剂，置于 1 L烧杯中。 2. 向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
1、2，4－二硝基苯肼溶液 I．在15mL浓硫酸中，溶解3克2，4－二硝基苯肼。另在70mL95％乙醇里加20mL 水，然后把硫酸苯肼倒入稀乙醇溶液中，搅动混合均匀即成橙红色溶液（若有沉淀应过滤）。 Ⅱ．将1.2克2，4一二硝基苯肼溶于50mL30％高氯酸中，配好后储于棕色瓶中，不易变质。 I法配制的试剂，2，4－二硝基苯肼浓度较大，反应时沉淀多便于观察。Ⅱ法配制的试剂由于高氯酸盐在水中溶解度很大，因此便于检验水中醛且较稳定，长期贮存不易变质。2、卢卡斯（Lucas）试剂 将34克无水氯化锌在蒸发皿中强热熔融，稍冷后放在干燥器中冷至室温。取出捣碎，溶于23mL浓盐酸中（比重1.187）。配制时须加以搅动，并把容器放在冰水浴中冷却，以防氯化氢逸出。此试剂—般是临用时配制。 3、托伦（Tollens）试剂 I．取0.5mL10％硝酸银溶液于试管里，滴加氨水，开始出现黑色沉淀，再继续滴加氨水，边滴边摇动试管，滴到沉淀刚好溶解为止，得澄清的硝酸银氨水溶液，即托伦试剂。 Ⅱ．取一支干净试管．加入1mL5％硝酸银，滴加5％氢氧化钠2滴，产生沉淀，然后滴加5％氨水，边摇边滴加，直到沉淀消失为止，此为托伦试剂。 无论I法或Ⅱ法，氨的量不宜多，否则合影响试剂的灵敏度。I法配制的Tollens试剂较Ⅱ法的碱性弱，在进行糖类实验时，用I法配制的试剂较好。 4、谢里瓦诺夫（Seliwanoff）试剂 将0.05g间苯二酚溶于50mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100mL。 5、希夫（Schiff）试剂 在100mL热水中溶解0.2g品红盐酸盐，放置冷却后，加入2g亚硫酸氢钠和2mL浓盐酸，再用蒸馏水稀释至200mL。 或先配制l0mL二氧化硫的饱和水溶液，冷却后加入0.2g品红盐酸盐，溶解后放置数小时使溶液变成无色或淡黄色，用蒸馏水稀释至200mL。 此外，也可将0.5g品红盐酸盐溶于l00mL热水中，冷却后用二氧化硫气体饱和至粉红色消失，加入0.5g活性炭，振荡过滤，再用蒸馏水稀释至500mL。 本试剂所用的品红是假洋红（Para-rosaniline或Para-Fuchsin），此物与洋红（Rosaniline或Fuchsin）不同。希夫试剂应密封贮存在暗冷处，倘若受热或见光，或露置空气中过久，试剂中的二氧化硫易失，结果又显桃红包。遇此情况，应再通入二氧化硫，使颜色消失后使用。但应指出，试剂中过量的二氧化硫愈少，反应就愈灵敏。 6、0.1％茚三酮溶液 将0.1g茚三酮溶于124.9mL95％乙醇中，用时新配。 7、饱和亚硫酸氢钠 先配制40％亚硫酸氢钠水溶液，然后在每100mL的40％亚硫酸氢钠水溶溶液中，加不含醛的无水乙醇25mL，溶液呈透明清亮状。 由于亚硫酸氢钠久置后易失去二氧化硫而变质，所以上述溶液也可按下法配制：将研细的碳酸钠晶体（Na2CO3?10H2O）与水混合，水的用量使粉末上只覆盖一薄层水为宜，然后在混合物中通入二氧化硫气体，至碳酸钠近乎完全溶解，或将二氧化硫通入1份碳酸钠与3份水的混合物中，至碳酸钠全部溶解力止，配制好后密封放置，但不可放置太久，最好是用时新配。 8、饱和溴水 溶解15克溴化钾于100mL水中，加入10g溴，振荡即成。 9．莫利许（Molish）试剂
1DEPC水(1‰) 1000ml 水 1ml DEPC 根据需要确定要配的体积，泡实验器具的DEPC水静止4小时后备用，泡24小时。配液体的DEPC水37℃过夜，送至高压，然后配相关溶液。 20.1M tris(ph 7.5) 12.114g tris 1000ml DEPC水 用HCL调ph至7.5，高压备用。 3 4%PFA的配制(ph 7.0)40g PFA 1000ml 0.1m tris(DEPC水配制高压) 将溶液持续加热至60℃左右，搅拌之至完全溶解，注意温度不要超过65℃，否则PFA降解失效。 30.2% 甘油/0.1M tris 20ml 甘油 980ml 0.1Mtris 4 20XSSC Nacl 175.3g （ph 7.0）柠檬酸钠88.2g DEPC水1000ml 分别稀释至2XSSC和0.2XSSC备用 5 HEPES 溶液HEPES 23.8g (ph6.8-8.0)DEPC H2O 100ml 6 50X Denhaldt′s 液 聚蔗糖（Ficoll 400）0.2g 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinypyrrolidone) 0.2g 牛血清蛋白（BSA）0.2g DEPC 水20ml 7 预杂交buffer Deinoized formanmid 5ml 20X SSC 1.5ml 1M HEPES 0.5ml 50X Denhanldt′s液1ml 龟精DNA 0.6ml(4ug/ul) DEPC水 1.4ml 龟精DNA 要先95℃10-15min加热变性，随即冰浴。杂交buffer分装后-20℃保存。 8Washing buffer (ph7.5) maleic acid 5.8g NACL 4.4g Tween（吐温） 1.5ml 定容至500ml溶质浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 0.3% Tween 9Maleic acid buffer (ph7.5) Maleic acid 5.8g Nacl 4.4g 定容至500ml 溶质的浓度最后分别为0.1M maleic acid 0.15M nacl 10Detection buffer
体外抗氧化实验方案 一、DPPH自由基清除法 [原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 ON2 NONN2 NO2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M 取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 Vc溶液 (0.25mg/ml) 称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、 200μL。浓度梯度mg/ml为 0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400 μg/ml 2.5、5、 10、20、40 1.4 测量 A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。 0 A值的测量: 取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。加样表如下: 表1 加样表 样品液甲醇总体积 DPPH测试液 30μL 970μL 2 mL 3mL 60μL 940μL 2 mL 3mL 120μL 880μL 2 mL 3mL 240μL 760μL 2 mL 3mL 480μL520μL 2 mL 3mL 1.5 正式测量 方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A. 0 [实验结果] 清除率(抑制率)的计算公式:
高中生物实验试剂配制方法 1、斐林试剂 试剂甲：将34.5克结晶硫酸铜溶于500亳升水中，加0.5亳升硫酸，混合均匀。 试剂乙：将125克氢氧化钠和137克酒石酸钾钠溶于500毫升蒸馏水中。（贮于带橡皮塞的瓶中） ※临用时试剂甲与试剂乙等量混合 ※斐林试剂是由氢氧化钠的质量分数为0.1 g/mL的溶液和硫酸铜的质量分数为0.05 g/mL的溶液配制而成的。它与可溶性的还原性糖(葡萄糖、果糖和麦芽糖)在加热的条件下，能够生成砖红色的氧化亚铜沉淀 因此，斐林试剂常用于检测可溶性的还原性糖的存在与否。2、双缩脲试剂 取10 g氢氧化钠放入量筒中,加水至100 mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中,配成质量浓度为0.1 g/mL的氢氧化钠溶液,瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂A。 取1 g硫酸铜放入量筒中,加水至100 mL,待充分溶解后倒入试剂瓶中,配成质量浓度为0.01 g/mL的硫酸铜溶液(蓝色)。瓶口塞上胶塞,贴上标签,写上试剂B。
※双缩脲试剂使用时，先向蛋白质溶液中加入NaOH溶液（2mL），振荡摇匀，然后再加入3~4滴CuSO4溶液，与蛋白质发生紫色反应，因此，双缩脲试剂常用于检测蛋白质的存在与否 注意∶林试剂和双缩脲试剂都由NaOH溶液和CuSO4溶液组成，但二者有如下三点不同： （1）溶液浓度不同 斐林试剂中NaOH溶液称为斐林试剂甲，其浓度为0.1g/ml,CuSO4溶液称为斐林试剂乙，其浓度为0.05g/ml；双缩脲试剂中NaOH溶液（双缩脲试剂A）的浓度为0.1g/ml，CuSO4溶液（双缩脲试剂B）的浓度为0.01g/ml。 （2）使用原理不同 斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的Cu2O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。 鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂，发生的是双缩脲反应。双缩脲反应实质是在碱性环境下的Cu2+与双缩脲试剂发生的紫色反应。而蛋白质分子中含有很多与双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）结构相似的肽键，所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生紫色反应，可以用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。
常用试剂的配制 1．无Ca2+、Mg2+Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO 3 0.175g Na 2HPO 4 ·12H 2 O 0.076g KH 2PO 4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚红 2.5ml 将上述成分依次溶解或加入到双蒸水中, 最后补加双蒸水至500ml, 以5.6%NaHCO 3调整 pH 值至7.4，4℃冰箱保存备用。 2．甲基红试剂 （1）成份 甲基红 0.1g 蒸馏水 200ml 95％乙醇 300ml （2）用途：测定甲基红反应。 3．Hanks液（原液） 原液甲： NaCl 160g KCl 8g MgSO 4·7H 2 O 2g MgCl 2·6H 2 O 2g 上述试剂加入800ml双蒸水。溶解。 CaCl 2 2.8g溶于100ml双蒸水 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 原液乙： Na 2NPO 4 ·12H 2 O 3.04g KH 2PO 4 1.2g 葡萄糖 20g 加入800ml双蒸水，溶解。 0.4%酚红溶液100ml 上述二液混合，加双蒸水至1000ml，再加2ml氯仿防腐，4℃保存。 使用时甲,乙原液按下列比例配成Hanks 液使用液：原液甲1份、原液乙1份、双蒸水18份滤过，8磅20min灭菌，放4℃冰箱保存，使用前用NaHCO 3 调整PH值。 4．0.4%酚红溶液 称取0.4g酚红置研钵中研碎，逐渐加入0.lmol/LNaOH并不断研磨，直到所有的颗粒
几乎完全解，加入0.lmol/LNaOHl0ml，然后倒入容量瓶中，并加蒸馏水至l00ml,棕色瓶保存备用。 5．pH7.2 Tris-NH 4 CI溶液(红细胞崩解液） Tris (三羟甲基氨基甲烷) 1.03g NH 4 Cl（氯化氨) 3.735g 加双蒸水至500ml，用浓HCl调pH=7.2，10磅15min灭菌后放4℃保存。 6．0.05moI/L pH8.6 巴比妥缓冲液 巴比妥 1.84g 加蒸馏水 200ml 加热溶解 巴比妥纳 10.3g 叠氮纳 0.2g 加蒸馏水溶解 , 并补加到 1000ml 。 7．磷酸盐缓冲液(PB) A 液：为 0.2mol/L 磷酸二氢钠水溶液 ,NaH 2PO 4 ·H 2 O 27.6g, 溶于蒸馏水中, 最 后补加蒸馏水至 1000ml 。 B 液：为 0.2mol/L 磷酸氢二钠水溶液 ,Na 2HPO 4 .7H 2 O 3.6g（或 Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g, 或Na 2HPO 4 · 2H 2 O 35.6g ）, 加蒸馏水溶解，最后加水至 1000ml。若再加 蒸馏水至200ml则成为0.1mol/LPB。 8．0.1mol/LPH8.4 硼酸缓冲液（BBS） 硼酸钠（Na 2B 4 O 7 .10H 2 O） 0.46g 硼酸（H 2BO 3 ） 0.51g 加蒸馏水至100ml 溶解。9．PH7.4 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法一： 0.2mol/L Na 2HPO 4 （ Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 71.6g加蒸馏水至1000ml） 0.2mol/L NaH 2PO 4 （NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 35.6g加蒸馏水至1000ml） 取0.2mol/L Na 2HPO 4 81.0ml 加0.2mol/L NaH 2 PO 4 19ml,再加1900mlH 2 O和 17gNaCl即为PH7.4 0.01mol/L PBS。 PH7.4 0.01mol/L PBS再加入0.05%Tween-20即为ELISA试验的洗涤液。 配制方法二： 甲液（0.1mol/LKH 2PO 4 溶液）：KH 2 PO 4 13.608g，加蒸馏水至1000ml。 乙液（0.1mol/L Na 2HPO 4 溶液）：Na 2 HPO 4 35.814g，加蒸馏水至1000ml。 取甲液19ml，乙液81ml NaCl8.5g、Tween-20 0.5ml混合后加蒸馏水至1000ml即可。
【最新整理，下载后即可编辑】 3.2.5 体外抗氧化实验 发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。 （1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率： () %100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (1) 式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。 注意事项： 1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,
或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不 写，要么写着 “G ”。 2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪 头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。 3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个 平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。 4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人 换枪。 （2）对DPPH ·的清除作用 DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。 取待检样品l mL 与120μmol·L -1的DPPH·溶液3 mL 加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30 min ，以无水乙醇为空白，在517 nm 下测定其吸光度，并按下式计算清除率： () %100A A A -A ?-=对照样品空白样品对照清除率 (2) 式中A 对照为未加待检样品的DPPH·反应体系的吸光度(用1mL 无水乙醇补充体积)；A 样品为加入待检样品后的DPPH·反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无DPPH·的反
实验常用试剂、缓冲液的配制方法 1、1M Tris-HCl□组份浓度1 M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）□配制量1L □配置方法1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 pH值浓HCl 7.4 约70mL 7.6 约60mL 8.0 约42mL 4. 将溶解定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 2、1.5 M Tris-HCl□组份浓度1.5 M Tris-HCl （pH8.8）□配制量1L □配置方法1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 用浓盐酸调pH值至8.8。 4. 将溶液定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 3、10×TE Buffer□组份浓度100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA （pH 7.4，7.6，8.0）□配制量1L □配置方法1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。 1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0）100mL 500 mM EDTA（pH8.0）20mL 2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。 3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。 4. 室温保存。 4、3 M 醋酸钠□组份浓度3 M 醋酸钠 （pH5.2）□配制量100mL □配置方法1. 称取40.8gNaOAc?3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。 2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。 3. 加入去离子水将溶液定容至100mL。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5、PBS Buffer□组份浓度137 mM NaCl，2.7mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4 □配制量1L □配置方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。 NaCl 8 g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.27g 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加HCl将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。 6、10 M醋酸铵□组份浓度10 M醋酸铵 □配制量100mL □配置方法1. 称量77.1g醋酸铵置于100～200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。 2.加去离子水将溶液定容至100mL。 3.使用0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。 注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚□配置方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。 2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。 3. 苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下： ①液化苯酚应贮存于-20℃，此时的苯酚呈现结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68℃水浴中使苯酚充分溶解。 ②加入羟基喹啉（8-Quinolinol）至终浓度0.1％。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色。有助于方便识别有机相。 ③加入等体积的1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。 ④重复操作步骤③。 ⑤加入等体积的0.1M Tris-HCl（pH8.0），使用磁力搅拌器搅拌15分钟，静置使其充分分层后，除去上层水相。 ⑥重复操作步骤⑤，稍微残留部分上层水相。 ⑦使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。 ⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。 8、苯酚/氯仿/异戊醇□配置方法 1. 说明：从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯/酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白（25 ：24 ：1）质变性并有助于液相与有机相的分离，而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。 2. 配置方法：将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇（24：1）均匀混合后，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。
抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在
着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果
常规试剂配制和测定方法 一、溶液的配制 1. Mandels营养盐溶液（1000 mL） 名称重量（g） 硫酸铵（(NH4)2SO4）14 磷酸二氢钾（KH2PO4）20 尿素（H2NCONH2） 3 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 3 氯化钙（CaCl2·2H2O） 4 注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。 2. Mandels微量元素溶液（1000 mL） 名称重量（g） 氯化钴（CoCl2·6H2O） 硫酸锌（ZnSO4·7H2O） 硫酸锰（MnSO4·H2O） 硫酸亚铁（FeSO4·7H2O） 注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。 3. DNS试剂的配制（1000 mL） （1）取：3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）7.5 g 氢氧化钠（NaOH ）14.0 g 充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min） （2）加入：酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）216.0 g 苯酚（在50 ℃水浴中融化）mL 偏重亚硫酸钠（Na2S2O5） 6.0 g
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。 注意：倒入瓶中时要尽量装满！！ 4. 考马斯亮蓝G-250的配制（1000 mL） 称考马斯亮蓝G-250 100 mg即0.1g溶于50mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含%（w/v）考马斯亮蓝 G-250，%（w/v）乙醇，%（w/v）磷酸。 5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（1000 mL） 名称分子量Mn 重量(g) 柠檬酸（C6H8O7·H2O）210 210 NaOH 40 准确称取柠檬酸210 g，溶于约750 mL煮沸（10 min）蒸馏水中，待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5 g，完全溶解后将上述溶液转移到1000 mL容量瓶中，冷却后将容量瓶定容到1000 mL（原始）。（检验方法：取1.0 M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍，测定稀释液的pH值，pH值应为） 6. 标准糖溶液的配制和标准方程的测定 （1）标准糖溶液的配制 准确称取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 ℃烘干3 h），蒸馏水溶解，全部转移至1 L容量瓶内，摇匀，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。 取9个100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸馏水定容，摇匀。即为0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖标准溶液。 取6个30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分别吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入mL柠檬酸缓冲液，蒸馏水定容，摇匀。即为1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。（2）标准方程的测定： ①葡萄糖/木糖标准方程的测定
植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定 一、原理 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。 二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在 450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1) D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。三、材料、仪器设备及试剂1、[仪器设备]紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管：10ml1支，2ml1支；剪刀1把。
第38卷第3期2802009年5月 卫生研究 JO U R N A L O F H Y G I E N E R ES EA R C H V01.38N o.3 M ay2009 文章编号:1000-8020(200903.02∞.04 几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究 刘小兵朴建华1田园 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050 论著 摘要:目的研究生物活性物质体外抗氧化能力评价方法,应用体外理化环境下建立起来的评价方法对受试物进行初步抗氧化能力评估。方法联合应用2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐(AB T S 法与铁离子还原/抗氧化能力测定法(r aA P法用于生物活性物质体外抗氧化能力研究。在A B T S法中。使用 紫外可见分光光度计734nm波长下测定以槲皮素、姜黄素、D L-a.生育酚和原花青素等为代表的生物活性物 质;在FR A P法中,运用酶标仪,595nm波长处测定同样受试物的抗氧化能力。结果A B TS法:槲皮素和姜黄 素的抗氧化活性T E A C值分别约为2.02和0.50;而l g D L-a.生育酚、原花青素清除自由基的能力相当于
2.06m m ol、2.897m m ol的Trol ox清除自由基的能力;F RA P法:抗氧化活性以1.O m m ol/L FeS04为参考标准,槲皮 素、姜黄素和Tr ol ox摩尔当量约为5.73、1.18和2.09;而D L-a.生育酚和原花青素抗氧化活性分别是207.7m g、 156.36r ag。结论A B TS法与FR A P法联合应用,操作简便、结果可靠,尤其适宜作为生物活性物质体外抗氧 化能力的评价方法。 关键词:生物活性物质氧化应激中图分类号:R151.2Q591A B T S法FR A P法抗氧化能力 文献标识码:A R ese a r ch on t he eval uat i on m et hods f or ant i oxi dant capaci t y of s ever al bi oact i ve s ubs t ances/n vi t r o LI U X i aobi ng,P I A O Ji anhua,TI A N Y ua n I nst i t ut e of N u t r i ti on a nd F oo d Saf et y,C hi nes e C ent er f or D i seas e C ont r ol a nd Pr event i on,B eij i ng100050,C h i na A bst r act:O bj ect t ve T o s t udy t he eval u at i on m e t h ods f or ant ioxi dant capaci t y of bioacti ve s ubs t B nce i n础阳,an d t O appl y t he m e t h ods w h i ch i s es t abl i s hed i n physi eochem i ea l envi r onm ent i n or der t o g i v e t he pr eli m i nar y as se韶,m ent of t e st subj e ct s.M et hods7r he co m bi ne d appli cat i on of A B T S and F R A P m e t h ods i n t he as s es s m ent https://www.doczj.com/doc/5d12463568.html, i ng t he U V—V I S
NOx的测定试剂配制 1、1.00g/L盐酸萘乙二胺贮备液：称取0.50g(N-l-萘基)乙二胺盐酸盐(C10H7NH(CH2)NH2·2HCl)于500ml容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液贮于密闭的棕色试剂瓶中，在冰箱中冷藏可稳定三个月。 2、显色液：称取5.0g对氨基苯磺酸(NH2C6H4S03H)，溶解于约200ml热水中，将溶液冷却至室温，全部移入1000ml容量瓶中，加入50.0ml盐酸萘乙二胺贮备液和50ml冰乙酸，用水稀释至标线。此溶液于密闭的棕色瓶中，在25℃以下暗处存放，可稳定三个月。若呈现淡红色，应弃之重配。 3、吸收液：临用时将显色液和水按4+1(V/V)比例混合，即为吸收液。吸收液的吸光度不超过0.005(540nm，lcm比色皿，以水为参比)。否则，应检查水、试剂纯度或显色液的配制时间和贮存方法。 4、亚硝酸钠标准贮备液：准确称取0.3750g亚硝酸钠(NaN02，优级纯，预先在干燥器内放置24h)溶解于水，移入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线。贮于密闭的棕色试剂瓶中，可稳定三个月。此溶液每毫升含0.250mg亚硝酸根。 5、亚硝酸钠标准使用液：吸取亚硝酸钠标准贮备液1.00ml于100ml容量瓶中，用水稀释至标线。临用前现配。此溶液每毫升含2.5μg亚硝酸根。 6、硫酸溶液C(1/2H2S04)＝lmol/L：取15ml硫酸(ρ＝1.84g/m1)徐徐加入500ml水中。 7、酸性高锰酸钾溶液：称取25g高锰酸钾，稍微加热使其全部溶解于500ml水中，然后加入lmol/L硫酸溶液500ml，混匀，贮于棕色试剂瓶中。
SO 2的测定试剂配制 1、环己二胺四乙酸二钠溶液C(CDTA-2Na)＝0.0050mol/L ：称取1.82g 反式-l ，2-环己二胺四乙酸((trans-1，2-Cyclohexylenedinitrilo)tetraacetic acid ，简称CDTA)，加入1.50mol/L 的氢氧化钠溶液6.5ml ，溶解后用水稀释至100ml 。 2、甲醛缓冲吸收液贮备液：吸取36%～38%的甲醛溶液5.5ml ，0.050mol/L 的CDTA-2Na 溶液20.0ml ；称取2.04g 邻苯二甲酸氢钾，溶解于少量水中；将三种溶液合并，用水稀释至100ml ，贮于冰箱，可保存10个月。 3、甲醛缓冲吸收液：用水将甲醛缓冲吸收液贮备液稀释100倍而成，此吸收液每毫升含0.2mg 甲醛，临用现配。 4、氢氧化钠溶液C(NaOH)＝1.50mol/L 。 5、0.60％(m/V)氨磺酸钠溶液：称取0.60g 氨磺酸(H 2NSO 3H)于烧杯中，加入1.50mol/L 氢氧化钠溶液4.0ml ，搅拌至完全溶解后稀释至100ml ，摇匀。此溶液密封保存可使用l0d 。 6、碘贮备液C(1/2I 2)＝0.10mol/L ：称取12.7g 碘(I 2)于烧杯中，加入40g 碘化钾和25ml 水，搅拌至完全溶解后，用水稀释至1000ml ，贮于棕色细口瓶中。 7、碘使用液C(1/2I 2)＝0.05mol/L ：量取碘贮备液250ml ，用水稀释至500ml ，贮于棕色细口瓶中。 8、0.5％(m/V)淀粉溶液：称取0.5g 可溶性淀粉，用少量水调成糊状，慢慢倒入100ml 沸水中，继续煮沸至溶液澄清，冷却后贮于试剂瓶中。临用现配。 9、碘酸钾标准溶液C(1/6KIO 3)＝0.1000mol/L ：称取3.5667g 碘酸钾(KIO 3，优级纯，经110℃干燥2h)溶解于水，移入1000ml 容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。 10、盐酸溶液(1+9)。 11、硫代硫酸钠贮备液C(Na 2S 2O 3)＝0.10mol/L ：称取25.0g 硫代硫酸钠(Na 2S 2O 3·5H 2O)，溶解于1000ml 新煮沸并已冷却的水中，加入0.20g 无水碳酸钠(Na 2CO 3)，贮于棕色细口瓶中，放置一周后备用。如溶液呈现混浊，必须过滤。 12、硫代硫酸钠标准溶液C(Na 2S 2O 3)＝0.05mol/L ：取250.0ml 硫代硫酸钠贮备液，置于500ml 容量瓶中，用新煮沸并已冷却的水稀释至标线，摇匀。 标定方法：吸取三份0.1000mol/L 碘酸钾标准溶液10.00m1分别置于250ml 碘量瓶中，加入70ml 新煮沸并已冷却的水，加入1g 碘化钾，摇匀至完全溶解后，加入(1+9)盐酸溶液10ml ，立即盖好瓶塞，摇匀。于暗处放置5min 后，用硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液至浅黄色，加入2ml 淀粉溶液，继续滴定溶液至蓝色刚好褪去为终点。硫代硫酸钠标准溶液的浓度按下式计算： V C 00 .101000.0?= （2-1-1） 式中：C ——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L ； V ——滴定所消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml 。 13、0.05％(m/V)乙二胺四乙酸二钠盐(Na 2EDTA)溶液：称取0.25gNa 2EDTA(C 10H 14N 2O 8Na 2·2H 2O)，溶解于500ml 新煮沸但已冷却的水中，临用现配。 14、二氧化硫标准溶液：称取0.200g 亚硫酸钠(Na 2SO 3)，溶解于200mlNa 2EDTA 溶液中，缓缓摇匀以防充氧，使其溶解。放置2～3h 后标定。此溶液每毫升相当于320～400μg 二氧化硫。 标定方法：吸取三份20.00ml 二氧化硫标准溶液，分别置于250ml 碘量瓶中，加入50ml 新煮沸但已冷却的水、20.00ml 碘使用液及lml 冰乙酸，盖塞，摇匀。于暗处放置5min 后，用硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液至浅黄色，加入2ml 淀粉溶液，继续滴定至溶液蓝色刚好