扫描电子显微镜（Scanning Electronic Microscopy, SEM）扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点是，①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X 射线能谱仪装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析，因此它是当今十分有用的科学研究仪器。
电子束与固体样品的相互作用
扫描电镜从原理上讲就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息。通过对这些信息的接受、放大和显示成像，获得对是试样表面性貌的观察。
具有高能量的入射电子束与固体样品的原子核及核外电子发生作用后，可产生多种物理信号如下图所示。
电子束和固体样品表面作用时的物理现象
一、背射电子
背射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子，其中包括弹性背反射电子和非弹性背反射电子。
弹性背反射电子是指倍样品中原子和反弹回来的，散射角大于90度
的那些入射电子，其能量基本上没有变化（能量为数千到数万电子伏）。非弹性背反射电子是入射电子和核外电子撞击后产生非弹性散射，不仅能量变化，而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽，从数十电子伏到数千电子伏。
从数量上看，弹性背反射电子远比非弹性背反射电子所占的份额多。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度，如下图所示。
电子束在试样中的散射示意图
背反射电子产额和二次电子产额与原子序束的关系背反射电子束成像分辨率一般为50-200nm（与电子束斑直径相当）。背反射电子的产额随原子序数的增加而增加（右图），所以，利用背反射电子作为成像信号不仅能分析新貌特征，也可以用来显示原子序数衬度，定性进行成分分析。
二、二次电子
二次电子是指背入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核和外层价电子间的结合能很小，当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能的能量后，可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生在比较接近样品表层处，那些能量大于材料逸出功的自由电子可从样品表面逸出，变成真空中的自由电子，即二次电子。
二次电子来自表面5-10nm的区域，能量为0-50eV。它对试样表面状态非常敏感，能有效地显示试样表面的微观形貌。由于它发自试样表层，入射电子还没有被多次反射，因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别，所以二次电子的分辨率较高，一般可达到5-10nm。扫描电镜的分辨率一般就是二次电子分辨率。
二次电子产额随原子序数的变化不大，它主要取决与表面形貌。三、特征X射线
特征X射线试原子的内层电子受到激发以后在能级跃迁过程中直接
释放的具有特征能量和波长的一种电磁波辐射。 X射线一般在试样
的500nm-5m m深处发出。
四、俄歇电子
如果原子内层电子能级跃迁过程中释放出来的能量不是以X射线的
形式释放而是用该能量将核外另一电子打出，脱离原子变为二次电子，这种二次电子叫做俄歇电子。因每一种原子都由自己特定的壳层能量，所以它们的俄歇电子能量也各有特征值，能量在50-1500eV范围内。俄歇电子是由试样表面极有限的几个原子层中发出的，这说明俄歇电子信号适用与表层化学成分分析。
扫描电子显微镜的基本原理和结构
下图为扫描电子显微镜的原理结构示意图。由三极电子枪发出的电子束经栅极静电聚焦后成为直径为50mm的电光源。在2-30KV的加速电压下，经过2-3个电磁透镜所组成的电子光学系统，电子束会聚成孔径角较小，束斑为5-10m m的电子束，并在试样表面聚焦。末级透
镜上边装有扫描线圈，在它的作用下，电子束在试样表面扫描。高能电子束与样品物质相互作用产生二次电子，背反射电子，X射线等信号。这些信号分别被不同的接收器接收，经放大后用来调制荧光屏的亮度。由于经过扫描线圈上的电流与显象管相应偏转线圈上的电流同步，因此，试样表面任意点发射的信号与显象管荧光屏上相应的亮点
一一对应。也就是说，电子束打到试样上一点时，在荧光屏上就有一亮点与之对应，其亮度与激发后的电子能量成正比。换言之，扫描电镜是采用逐点成像的图像分解法进行的。光点成像的顺序是从左上方开始到右下方，直到最後一行右下方的像元扫描完毕就算完成一帧图像。这种扫描方式叫做光栅扫描。
扫描电镜由电子光学系统，信号收集及显示系统，真空系统及电源系统组成。
1 电子光学系统
电子光学系统由电子枪，电磁透镜，扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为产生物理信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。
<1>电子枪：
其作用是利用阴极与阳极灯丝间的高压产生高能量的电子束。目前大多数扫描电镜采用热阴极电子枪。其优点是灯丝价格较便宜，对真空度要求不高，缺点是钨丝热电子发射效率低，发射源直径较大，即使经过二级或三级聚光镜，在样品表面上的电子束斑直径也在5-7nm，因此仪器分辨率受到限制。现在，高等级扫描电镜采用六硼化镧（LaB6）或场发射电子枪，使二次电子像的分辨率达到2nm。但这种电子枪要求很高的真空度。
扫描电子显微镜的原理和结构示意图
<2>电磁透镜
其作用主要是把电子枪的束斑逐渐缩小，是原来直径约为50m m的束斑缩小成一个只有数nm的细小束斑。其工作原理与透射电镜中的电磁透镜相同。扫描电镜一般有三个聚光镜，前两个透镜是强透镜，用来缩小电子束光斑尺寸。第三个聚光镜是弱透镜，具有较长的焦距，在该透镜下方放置样品可避免磁场对二次电子轨迹的干扰。
<3>扫描线圈
其作用是提供入射电子束在样品表面上以及阴极射线管内电子束在
荧光屏上的同步扫描信号。改变入射电子束在样品表面扫描振幅，以
获得所需放大倍率的扫描像。扫描线圈试扫描点晶的一个重要组件，它一般放在最后二透镜之间，也有的放在末级透镜的空间内。
<4>样品室
样品室中主要部件是样品台。它出能进行三维空间的移动，还能倾斜和转动，样品台移动范围一般可达40毫米，倾斜范围至少在50度左右，转动360度。样品室中还要安置各种型号检测器。信号的收集效率和相应检测器的安放位置有很大关系。样品台还可以带有多种附件，例如样品在样品台上加热，冷却或拉伸，可进行动态观察。近年来，为适应断口实物等大零件的需要，还开发了可放置尺寸在Φ125mm 以上的大样品台。
2 信号检测放大系统
其作用是检测样品在入射电子作用下产生的物理信号，然后经视频放大作为显像系统的调制信号。不同的物理信号需要不同类型的检测系统，大致可分为三类：电子检测器，应急荧光检测器和X射线检测器。在扫描电子显微镜中最普遍使用的是电子检测器，它由闪烁体，光导管和光电倍增器所组成（见下图）。
当信号电子进入闪烁体时将引起电离；当离子与自由电子复合时产生可见光。光子沿着没有吸收的光导管传送到光电倍增器进行放大并转变成电流信号输出，电流信号经视频放大器放大后就成为调制信号。这种检测系统的特点是在很宽的信号范围内具有正比与原始信号的
输出，具有很宽的频带（10Hz-1MHz）和高的增益(105-106),而且噪音很小。由于镜筒中的电子束和显像管中的电子束是同步扫描，荧光屏上的亮度是根据样品上被激发出来的信号强度来调制的，而由检测器接收的信号强度随样品表面状况不同而变化，那么由信号监测系统输出的反营养品表面状态的调制信号在图像显示和记录系统中就转
换成一幅与样品表面特征一致的放大的扫描像。
3 真空系统和电源系统
真空系统的作用是为保证电子光学系统正常工作，防止样品污染提供高的真空度，一般情况下要求保持10-4-10-5mmHg的真空度。电源系统由稳压，稳流及相应的安全保护电路所组成，其作用是提供扫描电镜各部分所需的电源。
扫描电子显微镜的几种电子像分析
扫描电子显微镜的主要性能
一放大倍数
当入射电子束作光栅扫描时，若电子束在样品表面扫描的幅度为As，在荧光屏阴极射线同步扫描的幅度为Ac，则扫描电镜的放大倍数
为:
由于扫描电镜的荧光屏尺寸是固定不变的，因此，放大倍率的变化是通过改变电子束在试样表面的扫描幅度来实现的。如果荧光屏的宽度As=100mm，当As=5mm时，放大倍数为20倍，如果减少扫描线圈的电流，电子束在试样上的扫描幅度见效为Ac=0.05mm，放大倍数可达2000倍。可见改变扫描电镜的放大倍数十分方便。目前商品化的扫描电镜放大倍数可以从20倍调节到20万倍左右。
二分辨率
分辨率是扫描电镜的主要性能指标。对微区成分分析而言，它是指能分析的最小区域；对成像而言，它是指能分辨两点之间的最小距离。分辨率大小由入射电子束直径和调制信号类型共同决定。电子束直径越小，分辨率越高。但由于用于成像的物理信号不同，例如二次电子和背反射电子，在样品表面的发射范围也不相同，从而影响其分辨率。一般二次电子像的分辨率约为5-10nm，背反射电子像的分辨率约为50-200nm。
X射线也可以用来调制成像，但其深度和广度都远较背反射电子的发射范围大，所以X射线图像的分辨率远低于二次电子像和背反射电子像。
三景深
景深是指一个透镜对高低不平的试样各部位能同时聚焦成像的一个
能力范围。
与透射电镜景深分析一样，扫描电镜的景深也可表达为Df ? 2Δγ0 /α，，式中α为电子束孔径角。可见，电子束孔径角是决定扫描电镜景深的主要因素，它取决于末级透镜的光栅直径和工作距离。
扫描电镜的末级透镜采用小孔径角，长焦距，所以可以获得很大的景深，它比一般光学显微镜景深大100-500倍，比透射电镜的景深大10 倍。由于景深大，扫描电镜图像的立体感强，形态逼真。对于表面粗糙的端口试样来讲，光学显微镜因景深小无能为力，透射电镜对样品要求苛刻，即使用复型样品也难免出现假像，且景深也较扫描电镜为小，因此用扫描电镜观察分析断口试样具有其它分析仪器无法比拟的优点。
扫描电子显微镜的几种电子像分析
我们在电子束于固体样品的相互作用一节中曾介绍过，具有高能量的入射电子束与固体样品的原子核及核外电子发生作用后，可产生多种物理信号：二次电子，背射电子，吸收电子，俄歇电子，特征X射线。下面分别介绍利用这些物理信号进行电子成像的问题。
一、二次电子像
1、二次电子产额
由于二次电子信号主要来自样品表层5-10nm深度范围，因此，只有当其具有足够的能量克服材料表面的势垒才能使二次电子从样品中发射出来。下图示出了二次电子产额与入射电子能量的关系。
二次电子产额与入射电子能量的关系上图说明了入射电子能量E较低时，随束能增加二次电子产额δ增加，而在高束能区，δ随E增加而逐渐降低。这是因为当电子能量开始增加时，激发出来的二次电子数量自然要增加，同时，电子进入到试样内部的深度增加，深部区域产生的低能二次电子在像表面运动过程中被吸收。由于这两种因素的影响入射电子能量与δ之间的曲线上出现极大值，这就是说，在
低能区，电子能量的增加主要提供更多的二次电子激发，高能区主要是增加入射电子的穿透深度。对于金属材料，
Emax=100-800eV,δmax=0.35-1.6, 而绝缘体的
Emax=300-2000eV,δmax=1-10。
除了与入射能量有关外，δ还与二次电子束与试样表面法向夹角有关，三者之间满足以下关系：δ∝1/cosθ。可见，入射电子束与试样夹角越大，二次电子产额也越大。这是因为随θ角的增加入射电子束在样品表层范围内运动的总轨迹增长，引起价电子电离的机会增多，产生二次电子数量就增加；其次，是随着θ角增大，入射电子束作用体积更靠近表面层，作用体积内产生的大量自由电子离开表层的机会增多，从而二次电子的产额增大。
2. 二次电子像衬度
电子像的明暗程度取决于电子束的强弱，当两个区域中的电子强度不同时将出现图像的明暗差异，这种差异就是衬度。
影响二次电子像衬度的因素较多，有表面凹凸引起的形貌衬度（质量衬度），原子序数差别引起的成分衬度，电位差引起的电压衬度。由于二次电子对原子序数的变化不敏感，均匀性材料的电位差别不大，在此主要讨论形貌衬度。
在扫描电镜中，二次电子检测器一般装在与入射电子束轴线垂直的方向上。如将一待测平面样品逐渐倾斜，使其法线方向与入射电子束之间的夹角从零逐渐增大（上图），在右边的二次电子检测器连续地测量样品在不同倾斜情况下发射的电子信号。结果正如δ∝1/cosθ式所示，对给定的入射电子束强度，二次电子信号强度随样品倾斜角增大二增大。
根据这一原理可知，因为实际样品表面并非光滑的，对于同一入射电子束，与不同部位的法线夹角是不同的，这样就会产生二次电子强度的差异。
右图样品由三个小刻面组成，其中θC＞θA＞θB。按照以上规则，会有δC＞δA＞δB，结果在荧光屏上可以看到，C小刻面的像比A 和B都亮，B刻面最暗。
此外，由于二次电子探测器的位置固定，样品表面不同部位相对于探测器的方位角不同，从而被检测到的二次电子信号强弱不同。
例如，在样品上的一个小山峰的两侧，背向检测器一侧区域所发射的二次电子有可能达不到检测器，从而就可能成为阴影。为了解决这个问题，在电子检测器上加一正偏压（200-500V）,吸引低能二次电子，使背向检测器的那些区域产生的二次电子仍有相当一部分可以通过
弯曲轨迹到达检测器，从而可减小阴影对形貌显示的不利影响。
(a) 二次电子像 (b)背射电子像
当样品中存在凸起小颗粒或尖角时对二次电子像衬度会有很大影响，其原因是，在这些部位处电子离开表层的机会增多，即在电子束作用
下产生比其余部位高的多的二次电子信号强度，所以在扫描像上可以有异常亮的衬度。
样品形貌对入射电子束激发区域的影响
实际样品表面形貌要比上面所列举的要复杂的多，但不外呼是由具有不同倾斜角的大小刻面、曲面、尖棱、粒子、沟槽等组成。掌握了上述形貌衬度基本原理，在根据有关专业知识，就不难理解复杂形貌的扫描图像特征。
二背射电子像
背射电子信号既可以用来显示形貌衬度，也可以用来显示成分衬度。
1. 形貌衬度
用背反射信号进行形貌分析时，其分辨率元比二次电子低。因为背反射电子时来自一个较大的作用体积。此外，背反射电子能量较高，它们以直线轨迹逸出样品表面，对于背向检测器的样品表面，因检测器无法收集到背反射电子二编程一片阴影，因此在图像上会显示出较强的衬度，而掩盖了许多有用的细节。
2. 成分衬度
成分衬度也成为原子序数衬度，背反射电子信号随原子序数Z的变化比二次电子的变化显著的多，因此图像应有较好的成分衬度。样品中原子序数较高的区域中由于收集到的电子束亮较多，故荧光屏上的图像较亮。因此，利用原子序数造成的衬度变化可以对各种合金进行定性分析。样品中重元素区域在图像上是亮区，而轻元素在图像上是暗区。
由于背反射电子离开样品表面后沿着直线运动，检测到的背反射电子信号强度要比二次电子低的多，所以粗糙表面的原子序数衬度往往被形貌衬度所掩盖。为了避免形貌衬度对原子衬度的干扰，被分析的样品只需抛光不必进行腐蚀。
对有些既要进行形貌观察又要进行成分分析的样品，可采用一种新型的背散射电子检测器。它由一对硅半导体组成，以对称于入射束的方位装在样品上方。将左右两个检测器各自得到的电信号进行电路上的加减处理，便能得到单一信息。对于原子序数信息来说，进入左右两个检测器的信号，其大小和极性相同，而对于形貌信息，两个检测器得到的信号绝对之相同，其极性恰恰相反。根据这种关系，如果将亮各检测器得到的信号相加，便能得到反映样品原子序数的信息；如果相减便能得到形貌信息。
硅半导体对检测器工作原理
(a)成分有差别，形貌无差别 (b) 形貌有差别，成分无差别 (c)成分
形貌都有差别
铝合金抛光表面的背反射电子像 (a) 成分像 (b) 形貌像
图(a)试采用A+B方式获得的成分像，而图(b)则是采用A-B获得的形
貌像。
三吸收电子像
吸收电子也是对样品中原子序数敏感的一种物理信号。由入射电子束于样品的相互作用可知：i I=i B+i A+i T+i S式中，i I是入射电子流，i B，
i T和i S分别代表背散射电子，透射电子于二次电子的电流，而i A为吸收电子电流。对于样品厚度足够大时，入射电子不能穿透样品，所以透射电子电流为零，这时的入射电子电流可表示为：i I=i B+i A+i S 由于二次电子信号与原子序数（Z>20时）无关（可设i S=C），则吸收电子电流为：i A= (i I-C) - i B在一定条件下，入射电子束电流是一定的，所以吸收电流与背散射电流存在互补关系。
奥氏体铸铁的显微组织
(a)背散射电子像 (b)吸收电子像
在图上可以看出，在背散射电子像上的石墨条呈现暗的衬度，而在吸收电子像上呈现亮的衬度。
扫描电镜S E M制样步 骤 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
扫描电镜观察制样步骤 固定： 1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入 5ml 的离心管中, 2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时 3、置于 4℃冰箱中固定12小时。 冲洗： 用 0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗 3 次，每次 10 分钟。每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。Or 离心 脱水： 分别用浓度为30%， 50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟， 干燥： 将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥 12 小时。粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上 预处理好的样品放入干净离心管中待检。 SEM上机测样--测定条件参数设置 分子克隆实验指南第三版，1568页： 25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制； 先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4 配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需： 0.1mol/L K2HPO4，80.2ml 0.1mol/L KH2PO4，19.8ml 混合即是，不用酸碱调PH。 参考文献： DOI:?10.1021/es902165y Microbial fuel cell?based on Klebsiella pneumoniae biofilm Selecting?anode-respiring bacteria based on?anode?potential: phylogenetic, electrochemical, and?microscopic?characterization A severe reduction in the cytochrome C content of?Geobacter sulfurreducens?eliminates its capacity for extracellular electron transfer 2
TEM和SEM的异同比较分析以及环境扫描电镜,场发射电镜与传统电镜相比较的技术特点和应用 xrd是x射线衍射，可以分析物相，SEM是扫描电镜，主要是观察显微组织，TEM是透射电镜，主要观察超限微结构。AES 是指能谱，主要分析浓度分布。STM扫描隧道显微镜，也是观察超微结构的。AFM是原子力显微镜，主要是观察表面形貌用的。 TEM: 透射电子显微镜（英语：Transmission electron microscope，缩写TEM），简称透射电镜，是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。通常，透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍，用于观察超微结构，即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”。TEM是德国科学家Ruskahe和Knoll在前人Garbor和Busch的基础上于1932年发明的。 编辑本段成像原理透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况：
吸收像：当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理TEM透射电镜 。衍射像：电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射钵的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。相位像：当样品薄至100A以下时，电子可以穿过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。 编辑本段组件电子枪：发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。聚光镜：将电子束聚集，可用于控制照明强度和孔径角。样品室：放置待观察的样品，并装有倾转台，用以改变试样的角度，还有装配加热 、冷却等设备。物镜：为放大率很高的短距透镜，作用是放大电子像。物镜是决定透射电子显微镜分辨能力和成像质量的关键。中间镜：为可变倍的弱透镜，作用是对电子像进行二次放大。通过调节中间镜的电流，可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。透射镜：为高倍的强透镜，用来放大中间像后在荧光屏上成像。此外还有二级真空泵来对样品室抽真空、照相装置用以记录影像。 编辑本段应用透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后
扫描电子显微镜（Scanning Electronic Microscopy, SEM） 扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点是，①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X射线能谱仪装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析，因此它是当今十分有用的科学研究仪器。 电子束与固体样品的相互作用 扫描电镜从原理上讲就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息。通过对这些信息的接受、放大和显示成像，获得对是试样表面性貌的观察。 具有高能量的入射电子束与固体样品的原子核及核外电子发生作用后，可产生多种物理信号如下图所示。 电子束和固体样品表面作用时的物理现象 一、背射电子 背射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子，其中包括弹性背反射电子和非弹性背反射电子。 弹性背反射电子是指倍样品中原子和反弹回来的，散射角大于90度的那些入射电子，其能量基本上没有变化（能量为数千到数万电子伏）。非弹性背反射电子是入射电子和核外电子撞击后产生非弹性散射，不仅能量变化，而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽，从数十电子伏到数千电子伏。 从数量上看，弹性背反射电子远比非弹性背反射电子所占的份额多。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度，如下图所示。 电子束在试样中的散射示意图 背反射电子产额和二次电子产额与原子序束的关系背反射电子束成像分辨率一般为50-200nm （与电子束斑直径相当）。背反射电子的产额随原子序数的增加而增加（右图），所以，利用背反射电子作为成像信号不仅能分析新貌特征，也可以用来显示原子序数衬度，定性进行成分分析。 二、二次电子 二次电子是指背入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核和外层价电子间的结合能很小，当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能的能量后，可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生在比较接近样品表层处，那些能量大于材料逸出功的自由电子可从样品表面逸出，变成真空中的自由电子，即二次电子。
扫描电镜SEM
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扫描电子显微镜（Scanning Electronic Microscopy, SEM）扫描电镜（SEM）是介于透射电镜和光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点是，①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X 射线能谱仪装置，这样可以同时进行显微组织性貌的观察和微区成分分析，因此它是当今十分有用的科学研究仪器。 电子束与固体样品的相互作用 扫描电镜从原理上讲就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样上 扫描，激发出各种物理信息。通过对这些信息的接受、放大和显示成像，获得对是试样表面性貌的观察。 具有高能量的入射电子束与固体样品的原子核及核外电子发生作用后，可产生多种物理信号如下图所示。
电子束和固体样品表面作用时的物理现象 一、背射电子 背射电子是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子，其中包括弹性背反射电子和非弹性背反射电子。 弹性背反射电子是指倍样品中原子和反弹回来的，散射角大于90度的那些入射电子，其能量基本上没有变化（能量为数千到数万电子伏）。非弹性背反射电子是入射电子和核外电子撞击后产生非弹性散射，不仅能量变化，而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽，从数十电子伏到数千电子伏。 从数量上看，弹性背反射电子远比非弹性背反射电子所占的份额多。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度，如下图所示。 电子束在试样中的散射示意图
扫描电子显微镜知识A—Z / SEM的构造 扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope：SEM）是观察样品表面的装 置。用很细的电子束（称为电子探针）照射样品时，从样品表面会激发二次电子，在电子探针进行二维扫描时，通过检测二次电子形成一幅图像，就能够观察样品的表面形貌。 SEM的构造 装置的结构 SEM由形成电子探针的电子光学系 统、装载样品用的样品台、检测二次电 子的二次电子检测器、观察图像的显示 系统及进行各种操作的操作系统等构 成（图1），电子光学系统由用于形成电 子探针的电子枪、聚光镜、物镜和控制 电子探针进行扫描的扫描线圈等构成， 电子光学系统（镜筒内部）以及样品周 围的空间为真空状态。 图1 SEM的基本结构
图2 电子枪的构造图 电子枪 电子枪是电子束的产生系统，图2是热发射电子枪的构造图。将细（0.1 mm左右）钨丝做成的灯丝（阴极）进行高温加热（2800K左右）后，会发射热电子，此时给相向设置的金属板（阳极）加以正高圧（1～30kV），热电子会汇集成电 子束流向阳极，若在阳极中央开一个孔，电子束会通过这个孔流出，在阴极和阳极之间，设置电极并加以负电圧，能够调整电子束的电流量，在这个电极（被称 为韦氏极）的作用下，电子束被细聚焦，最细之处被称为交叉点（Crossover)，成为实际的光源(电子源)，其直径为15～20μm。 以上说明的是最常用的热发射电子枪，此外还有场发射电子枪和肖特基发射电子枪等。热发射电子枪的阴极除使用钨丝外，还使用单晶六硼化镧(LaB6)，LaB6由于活性很强，所以需要在高真空中工作。
透镜的构造 电子显微镜一般采用利用磁铁作用的磁透镜。当 绕成线圈状的电线被通入直流电后，会产生旋转 对称的磁场，对电子束来说起着透镜的作用。由 于制作强磁透镜（短焦距的透镜）需要增加磁力 线的密度，如图3所示，线圈的周围套有铁壳（轭 铁），磁力线从狭窄的开口中漏洩出来，开口处被 称作磁极片（极靴），经精度极高的机械加工而成。 磁透镜的强度能随通入线圈的电流改变而改变， 这是光学透镜所不具备的特长。 图3 磁透镜的构造 SEM的景深 在观察有纵深感的样品时，如果近处聚焦了，远处就离焦。在这种情况下，远、 近图像模糊圈大，叫做景深大，如果远、近图像模糊圈小，叫做景深小。图8 如所示，电子探针的平行度高（孔径角小），即使焦点变化很大，图像也保持聚 焦，如果电子探针有一定的角度（孔径角大），焦点即使变化很小，图像离焦也 很严重。象光学显微镜不使用电子探针时，从样品方向看到的物镜角度（孔径角） 小景深则大，角度大景深则小。另一方面，即便是图像模糊，在倍率低的时候 感觉不到，但在倍率增大的时候能够发现，也就是说，景深也随放大倍率的变 化而改变。 图9 SEM和光学显微镜的景深图8 电子探针孔径角和景深
扫描电镜观察制样步骤 固定： 1、用灭菌镊子挑出少量的的样品（碳粒/碳毡）,放入5ml 的离心管中, 2、加入2.5%戊二醛, 加量为淹没碳粒/碳毡样品为宜,室温固定1小时 3、置于4℃冰箱中固定12小时。 冲洗： 用0.2mol pH 7.4的磷酸缓冲溶液冲洗3 次，每次10 分钟。每次冲洗时先用注射器缓慢吸走上一步骤的冲洗液。Or 离心 脱水： 分别用浓度为30%，50%，75%，90%, 95%, 100% v/v 的乙醇进行脱水，每次10分钟， 干燥： 将样品放在离心管里，置入干燥器中干燥12 小时。粘样：用双面胶将样品观察面向上粘贴在扫描电镜铜板上 预处理好的样品放入干净离心管中待检。 SEM上机测样--测定条件参数设置 分子克隆实验指南第三版，1568页： 25度下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制； 先配0.1mol/L K2HPO4，0.1mol/L KH2PO4 配PH7.4，100ml磷酸钾缓冲液需： 0.1mol/L K2HPO4，80.2ml 0.1mol/L KH2PO4，19.8ml 混合即是，不用酸碱调PH。 参考文献： DOI: 10.1021/es902165y Microbial fuel cell based on Klebsiella pneumoniae biofilm Selecting anode-respiring bacteria based on anode potential: phylogenetic, electrochemical, and microscopic characterization A severe reduction in the cytochrome C content of Geobacter sulfurreducens eliminates its capacity for extracellular electron transfer
扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy, SEM) 扫描电镜(SEM)就是介于透射电镜与光学显微镜之间的一种微观性貌观察手段,可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。扫描电镜的优点就是,①有较高的放大倍数,20-20万倍之间连续可调;②有很大的景深,视野大,成像富有立体感,可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构;③试样制备简单。目前的扫描电镜都配有X射线能谱仪装置,这样可以同时进行显微组织性貌的观察与微区成分分析,因此它就是当今十分有用的科学研究仪器。 电子束与固体样品的相互作用 扫描电镜从原理上讲就就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样 上扫描,激发出各种物理信息。通过对这些信息的接受、放大与显示成像,获得对就是试样表面性貌的观察。 具有高能量的入射电子束与固体样品的原子核及核外电子发生作用后,可产生多种物理信号如下图所示。
电子束与固体样品表面作用时的物理现象 一、背射电子 背射电子就是指被固体样品原子反射回来的一部分入射电子,其中包括弹性背反射电子与非弹性背反射电子。 弹性背反射电子就是指倍样品中原子与反弹回来的,散射角大于90度的那些入射电子,其能量基本上没有变化(能量为数千到数万电子伏)。非弹性背反射电子就是入射电子与核外电子撞击后产生非弹性散射,不仅能量变化,而且方向也发生变化。非弹性背反射电子的能量范围很宽,从数十电子伏到数千电子伏。 从数量上瞧,弹性背反射电子远比非弹性背反射电子所占的份额多。背反射电子的产生范围在100nm-1mm深度,如下图所示。 电子束在试样中的散射示意图
背反射电子产额与二次电子产额与原子序束的关系背反射电子束成像分辨率一般为50-200nm(与电子束斑直径相当)。背反射电子的产额随原子序数的增加而增加(右图),所以,利用背反射电子作为成像信号不仅能分析新貌特征,也可以用来显示原子序数衬度,定性进行成分分析。 二、二次电子 二次电子就是指背入射电子轰击出来的核外电子。由于原子核与外层价电子间的结合能很小,当原子的核外电子从入射电子获得了大于相应的结合能的能量后,可脱离原子成为自由电子。如果这种散射过程发生在比较接近样品表层处,那些能量大于材料逸出功的自由电子可从样品表面逸出,变成真空中的自由电子,即二次电子。 二次电子来自表面5-10nm的区域,能量为0-50eV。它对试样表面状态非常敏感,能有效地显示试样表面的微观形貌。由于它发自试样表层,入射电子还没有被多次反射,因此产生二次电子的面积与入射电子的照射面积没有多大区别,所以二次电子的分辨率较高,一般可达到5-10nm。扫描电镜的分辨率一般就就是二次电子分辨率。 二次电子产额随原子序数的变化不大,它主要取决与表面形貌。 三、特征X射线