第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）
NGS之基础篇
2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了
5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNA cluster）、桥式PCR（Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1Gb Analyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了600Gb 的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005
年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA 探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。
NGS之进阶篇
454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C 四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。
454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理、文库制备、
emPCR、反应板准备、上机测序。样品处理主要是针对大片段的DNA 分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp （TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。emPCR是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。
