下载文档原格式
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
DNA测序技术发展史一代二代三代测序技术简要原理及比较一、一代测序技术一代测序技术最早出现于1977年，由Sanger和Gilbert等人开发。
其原理基于DNA链延伸，即通过将DNA链合成过程中加入少量的dideoxy核苷酸（ddNTP），使得DNA链延伸在一些特定位置停止，并通过凝胶电泳分析停止位置来确定每个核苷酸的顺序。
一代测序技术的特点是：1.准确性较高，可以达到99.99%的准确率。
2.读长较短，一般为500至1000个碱基。
3.测序过程复杂，需要进行多次扩增和凝胶电泳分析，耗时较长。
二、二代测序技术二代测序技术的发展始于2005年，它采用大规模并行的方式进行测序，实现了高通量测序。
主要的二代测序技术包括454测序、illumina测序和Ion Torrent测序。
454测序技术采用循环化学法，通过将DNA片段固定在微小的载体上，然后进行多次扩增和测序，最后通过压缩气体冲击来释放碱基，从而实现测序。
illumina测序技术采用桥式扩增法，通过将DNA固定在玻璃芯片上的小孔中，并用荧光标记核苷酸进行扩增和测序，最后通过激光扫描来检测荧光信号。
Ion Torrent测序技术是一种基于半导体芯片原理的测序技术，通过检测氢离子的释放来确定DNA序列。
二代测序技术的特点是：1.高通量：可以同时测序数百万甚至数十亿个片段。
2.快速：通常只需几个小时到几天的时间完成测序。
3.读长较短：大部分二代测序技术的读长在100至1000个碱基之间。
4.相对较低的测序准确率：一般在99%左右。
三、三代测序技术三代测序技术是指第三代测序技术，它的发展始于2024年。
三代测序技术主要包括单分子测序和纳米孔测序。
单分子测序技术（如PacBio和Nanopore）通过将DNA片段转化为单分子，然后通过观察单分子的扩增和测序来获得DNA序列。
纳米孔测序技术则是将DNA分子引入纳米孔中，通过纳米孔内的电信号变化来确定碱基对的序列。
一代、二代、三代测序技术(2014-01-22 10:42:13)转载第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一、初现庐山真面目——一代测序：又称Sanger测序（多分子，单克隆）历史：第一代DNA测序技术（又称Sanger测序）在1975年，由Sanger等人开创，并在1977年完成第一个基因组序列（噬菌体X174），全长5375个碱基。
研究人员经过30年的实践并对技术及测序策略的不断改进（如使用了不同策略的作图法、鸟枪法），2001年完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。
二、江山辈有人才出——二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但其测序成本高通量低等缺点，使得de novo测序、转录组测序等应用难以普及。
经过数据不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。
1、Illumina 原理：桥式PCR 4色荧光可逆终止激光扫描成像主要步骤：①DNA文库制备——超声打断加接头②Flowcell——吸附流动DNA片段③桥式PCR扩增与变性——放大信号④测序——测序碱基转化为光学信号优势劣势：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。
而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。
2、Roche 454油包水PCR 4种dNTP车轮大战检测焦磷酸水解发光主要步骤：①DNA文库制备——喷雾打断加接头②乳液PCR——注水入油独立PCR③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号优势劣势：454技术优势测序读长较长，平均可达400bp，缺点是无法准确测量类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，可能导致结果不准确。
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
在细胞测序中使用的基因组测序技术基因组测序是指在一个生物体中测定所有基因组DNA序列的过程。
它已成为现代生物学研究中的重要工具，产生了面向多个方面的巨大科学成果和世界级项目。
1. 第一代测序技术（Sanger测序）Sanger测序是第一代测序技术，由Frederick Sanger在1977年发明。
该技术通过使用DNA聚合酶和特殊标记的dNTPs来扩增DNA，并在扩增过程中逐渐终止反应。
然后通过凝胶电泳将这些碎片分离，并确定其顺序。
这个技术已广泛用于基因组测序，包括人类基因组计划。
2.第二代测序技术（高通量测序）第二代测序技术是指大规模并行化测序技术。
其中最具代表性的技术包括Illumina公司的测序平台。
这些平台使用DNA分子和适配体的延伸、断裂、扩增和连接过程，使得大量DNA片段在同一时间内重复测序。
这种高通量技术比第一代测序技术更快速、成本更低，并可大大增加测序数据的产量。
3.第三代测序技术（单分子测序）第三代测序技术与第二代技术有所不同，它通过直接测量单个DNA分子的序列，而不需要扩增或插入连接。
Pacific Biosciences（PacBio）和Oxford Nanopore Technologies（ONT）是两种著名的第三代测序技术。
这些技术使用较长的读片长度，有助于解决重复序列和基因组重组等问题。
细胞测序中基因组测序技术的应用：1.基因组组装和注释：基因组测序技术可用于获取物种基因组的全序列，从而进行基因组组装和注释的工作。
这可以帮助科学家们理解生物体基因组的结构和功能，从而研究一种生物体的遗传特性。
2.功能基因组学：通过基因组测序得到的信息可以帮助科学家们寻找功能基因和非编码RNA等生物体中重要的功能分子。
这些信息有助于研究基因之间的相互作用和调控网络。
3.突变和变异的检测：基因组测序技术可以用于检测基因组中的各种突变和变异。
这包括SNPs（单核苷酸多态性）、InDel（插入/缺失）、结构变化等。
基因测序三代技术介绍基因测序是指对一个个体的基因组进行测序，以了解其基因组的组成和功能。
基因测序的三代技术是指第三代测序技术，它相比于传统的第一代和第二代技术具有更高的效率和准确性。
第一代测序技术是指Sanger测序技术，它是20世纪70年代中期发展起来的一种测序方法。
该技术通过对DNA链延伸的方式进行测序，通过引入特殊的ddNTP（二聚脱氧核苷酸）来终止延伸反应，从而得到一系列不同长度的DNA片段。
这些片段经过分离和序列分析后，可以确定原始DNA序列。
虽然Sanger测序技术具有高准确性和可靠性，但它的测序速度较慢，且成本较高。
第二代测序技术是指高通量测序技术，也被称为下一代测序技术。
这些技术的共同特点是能够同时进行大量的测序反应，从而大大提高了测序速度和效率。
其中常用的第二代测序技术包括454测序、Illumina测序和Ion Torrent测序等。
这些技术的原理各不相同，但都以DNA扩增和片段测序为基础。
通过将DNA样品分割成小片段，并在特定条件下进行扩增和测序，然后利用计算机算法将这些片段拼接成完整的DNA序列。
相比于第一代测序技术，第二代测序技术的测序速度更快，成本更低，适用于大规模的基因组测序。
而第三代测序技术则是在第二代测序技术的基础上进一步发展起来的。
与第二代测序技术相比，第三代测序技术具有更高的通量和准确性，能够直接读取单个DNA分子的序列。
目前主要的第三代测序技术包括PacBio测序和Nanopore测序。
PacBio测序利用了DNA聚合酶的特殊性质，能够在DNA链合成过程中检测到单个碱基的添加，并实时记录下来。
Nanopore测序则利用了纳米孔的特性，通过将DNA片段引入纳米孔中，通过测量电流变化来确定碱基的序列。
这些技术的出现使得基因测序更加高效和精确。
基因测序的三代技术在许多领域都有广泛的应用。
例如，在医学领域，基因测序可以用于研究人类疾病的遗传基础，从而为疾病的预防和治疗提供依据。
一代、二代、三代测序技术(2014-01-22 10:42:13)转载▼第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。
其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂（双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂）通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反应分四组进行，每一组分别用四种ddNTP（双脱氧核苷酸）中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD 测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
DNA测序技术的发展和其最新进展DNA测序技术是指对DNA分子的序列进行分析和研究的技术手段。
随着科技的不断发展，DNA测序技术也在不断进步和演变。
以下是DNA测序技术的发展历程和最新进展：1. 第一代测序技术（Sanger测序）：20世纪70年代发展起来的Sanger测序技术是第一代DNA测序技术。
该技术基于DNA合成链终止原理，通过引入一种特殊的二进制核苷酸（ddNTP）来阻止DNA链延伸，从而确定DNA的序列。
虽然Sanger测序技术准确可靠，但是速度较慢且昂贵。
2. 第二代测序技术（高通量测序）：2005年以后，高通量测序技术的发展使DNA测序速度大幅提升，成本显著降低。
高通量测序技术包括454、Illumina、Ion Torrent等多种技术平台。
这些技术利用多个并行反应来进行快速大规模测序，数据生成速度快，适用于基因组学研究和临床检测。
3. 第三代测序技术（单分子测序）：第三代测序技术突破了传统测序技术的限制，实现了对单个DNA分子的直接测序。
这些技术包括SMRT（Single-Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
第三代测序技术具有高通量、长读长、快速和低成本的特点，可用于对复杂基因组结构、基因突变和转录组的研究。
最新进展：1. 快速测序：DNA测序速度不断提升，目前已经可以在短时间内完成耗时较长的全基因组测序和全外显子组测序。
这样快速测序技术的应用使得大规模人群的基因组信息获取成为可能。
2. 单细胞测序：单细胞测序技术可以对个体细胞进行测序，揭示人体各个细胞类型的基因表达和遗传变异情况。
这种技术的应用有助于揭示疾病发生和发展的机制，并为个体化医疗提供依据。
3. 元基因组学测序：元基因组学是指对微生物群落中所有基因组的研究。
元基因组学测序技术能够高通量地对微生物群落进行测序，帮助研究人员深入了解微生物的多样性和功能。
4. CRISPR技术在测序中的应用：CRISPR基因编辑技术不仅可以用于基因修饰，还可以用于DNA测序和基因组编辑。
双脱氧链终止法又称为Sanger法原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5h内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5cM，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
杂交测序技术杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法, 该方法不同于化学降解法和Sanger 法, 而是利用 DNA杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列序检测速度快, 采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。
但该方法误差较大, 且不能重复测定焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发展起来的一种新的DNA序列分析技术，它通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。
既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析的单核苷酸多态性(SNP)检测及等位基因频率测定等。
1 焦磷酸测序技术的原理及步骤焦磷酸测序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(1ueiferase)和双磷酸酶(apyrase)4种酶催化同一反应体系的酶级联化学发光反应，反应底物为5’-磷酰硫酸(APS）和荧光素。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
在每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由Pyrogram TM转化为一个峰值，其高度与反应中掺人的核苷酸数目成正比。
根据加入dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。
在实验过程中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被虫荧光素识别。
由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解产物的浓度，近年来，单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein，SSBP)和纯化Spisomer dATPaS的使用dATPotS降解产物抑制双磷酸酶活性的这一问题得到较好解决，使得测序长度可达100 bp，拓展了该技术在遗罗氏454的GS FLX测序技术利用了焦磷酸测序原理，主要包括以下步骤：1）文库准备将基因组DNA打碎成300-800 bp长的片段 ( 若是sn RNA 或 PCR 产物可以直接进入下一步 ) ，在单链DN A的3’端和5’端分别连上不同的接头。
2）连接带接头的单链 DNA 被固定在DNA 捕获磁珠上。
每一个磁珠携带一个单链 DNA片段。
随后扩增试剂将磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了许多只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
3）扩增每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增 (乳液PCR)，从而排除了其它序列的竞争。
整个DNA片段文库的扩增平行进行。
对于每一个片段而言，扩增产生几百万个相同的拷贝。
乳液 PC R 终止后，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
4）测序携带D NA 的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。
PTP 孔的直径 ( 29 μm ) 只能容纳一个磁珠 ( 20 μm ) 。
放置在 4个单独的试剂瓶里的 4种碱基，依照 T、A、C、G的顺序依次循环进入 PTP板，每次只进入一个碱基。
如果发生碱基配对, 就会释放一个焦磷酸。
这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度 CCD 捕获到。
有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列与其它第二代测序平台相比，454 测序法的突出优势是较长的读长，目前GS FLX 测序系统的序列读长已超过400 bp 。
虽然454平台的测序成本比其他新一代测序平台要高很多，但对于那些需要长读长的应用，如从头测序，它仍是最理想的选择。
Solexa测序技术Illumna公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序 (Sequencing by Synthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。
Genome Analyzer技术的基本原理是将基因组DN A 打碎成约100-200个碱基的小片段，在片段的两个末端加上接头 ( adapter )。
将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上。
另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构。
通过30轮扩增反应，每个单分子被扩增大约1 000 倍，成为单克隆的 DNA簇，随后将DNA 簇线性化。
在下一步合成反应中，加入改造过的 DNA聚合酶和带有4种荧光标记的d NTP。
在DNA 合成时，每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐，激发生物发光蛋白发出荧光。
用激光扫描反应板表面，在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后，将这些荧光基团化学切割，恢复3’端黏性，随后添加第二个核苷酸。
如此重复直到每条模板序列都完全被聚合为双链。
这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DN A 片段的序列Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng ，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50 bp ，每次运行后可获得超过20 G B的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。
SOLiD 测序技术SOLiD 全称为Supported Oligo Ligation Detetion ，是 ABI（应用生物系统）公司于2007年底推出的全新测序技术，目前已发展到SOLiD 3 Plus。
与454和Solexa的合成测序不同，S OLiD 是通过连接反应进行测序的。
其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。
具体步骤包括：1）文库准备 SOLiD 系统能支持两种测序模板：片段文库 ( fragment library )或配对末端文库( mate-paired library) 。
片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接头，制成文库。
该文库适用于转录组测序、RNA定量、mi RNA研究、重测序、3’，5’RACE 、甲基化分析及 ChIP 测序等。
配对末端文库是将基因组 D NA 打断后，与中间接头连接，环化，然后用 EcoP15 酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，最后加上两端的接头，形成文库。
该文库适用于全基因组测序、SNP 分析、结构重排及拷贝数分析等。
2）扩增 SOLiD用的是与 454 技术类似的乳液 PCR 对要测序的片段进行扩增。
在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物，进行乳液PCR ( emulsion PCR ) 。
PCR反应结束后，磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同一DNA模板的扩增产物。
3）微珠与玻片连接乳液PCR 完成之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，微珠上的模板经过3’修饰，可以与玻片共价结合。
SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
含有 DNA 模板的磁珠共价结合在SOLiD玻片表面，SOLiD测序反应就在SOLiD玻片表面进行。
每个磁珠经SOLiD测序后得到一条序列。
4）连接测序 SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。
探针的5’端用4种颜色的荧光标记，探针3’端第1、2 位碱基是 ATCG 4种碱基中的任何两种碱基组成的碱基对，共 16 种碱基对，因此每种颜色对应着4种碱基对。
3 - 5 位是随机的3个碱基。
6 - 8 位是可以和任何碱基配对的特殊碱基。
单向SOLiD测序包括5轮测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应, 得到原始颜色序列。
SOLiD序列分析软件根据“双碱基编码矩阵”把碱基序列转换成颜色编码序列，然后与 SOLiD原始颜色序列进行比较。
由于双碱基编码规则中一种颜色对应4种碱基对，前面碱基对的第二个碱基是后面碱基对的第一个碱基, 所以一个错误颜色编码就会引起连锁的解码错误，改变错误颜色编码之后的所有碱基。
SOLiD序列分析软件可以对测序错误进行自动校正，最后解码成原始序列。
因为SOLiD系统采用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，提供内在的校对功能，得到的原始碱基数据的准确度大于99.94 %，而在 15X 覆盖率时的准确度可以达到99.99 9 % ，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。
