第九章 翻译后翻译修饰的鉴定
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Target lysine -amino group
Ub carboxy terminus
Target protein
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泛素化过程(死亡之吻)
泛 素
大量研究证实,这种泛素调节的蛋白质降解过程
化 在生物体中的作用非常重要。通常有30%新合成
过 的蛋白质通过泛素化被销毁。因此,可以认为,
程 泛素化是一个把关的过程。比如,P53蛋白质可
1.反相液相色谱(RP-HPLC)分离磷酸肽 经RP-HPLC分离,肽混合物成分可以被简化,磷酸 肽可根据其疏水性被分离。RP-HPLC系统可以与电 喷雾(ESI)质谱连接,直接检测和鉴定肽混合物中的 磷酸肽,尤其适用于没有被放射性标记的分析样品。
2.IMAC分离/富集磷酸肽
固相金属亲和色谱(IMAC)最初用于纯化含组氨酸的蛋 白质,现在常被用于选择性地富集磷酸化肽段。 IMAC柱填料构成是色谱填料-交联剂-金属螯合剂。常用 的金属离子为Fe3+、Ga3+或Cu2+等,被螯合到固定相上, 通过静电作用,使磷酸基团选择性地被吸附,用高pH 溶液或磷酸盐洗脱后即为富集的磷酸肽。
培养约2h后裂解细胞提取蛋白质,随后进行2D电泳分离, 放射自显影检测磷酸化蛋白质。
局限性
对某些磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质,只能掺入少 量的放射性磷酸盐,有可能检测不到。
放射性标记方法虽然灵敏而且直观,但是因为存在放射 性污染的问题。
2.抗体免疫印迹检测法
用抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质进行免疫印迹反 应检测。 1. 抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好 2. 抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的特异性不太高。
蛋白质磷酸化的定量问题,即磷酸化蛋白质与 其相应非磷酸化蛋白质的比例,也是蛋白质组研 究非常关心的问题。
第一节 磷酸化蛋白质的鉴定
一 生物体内的蛋白质磷酸化修饰
蛋白质磷酸化是最常见、最重要的共价修饰方式。在哺 乳动物细胞周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化的 修饰。
蛋内质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着生 命活动的所有过程。
蛋白质的磷酸化是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP γ 位的磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基上的过程, 其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的,为蛋白质的脱磷 酸化。
局限性 IMAC技术对丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化都 有效,但是IMAC柱上的正电荷位点同样可与肽段 中的天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸残基结合,从而对 特异性和非特异性肽段同时富集。
3.化学修饰 将磷酸肽上的磷酸基团用另一种亲和配基取 代,再用亲和提取的方法从混合中分离富集磷 酸肽。 需要样品量较大,主要用于高丰度蛋白质检测。
图7-4是这一方法的简要示意图。
33到48位,序列为FQSEEQQQTEDELDK,该肽段质荷比的 理论值为m/z 1982.9,但是在其中的第35位丝氨酸残基上有 一个磷酸基团,使该肽段的质量数增加了80而成为质荷比为 m/z 2062.9的峰
2.串联质谱
在CID条件下,磷酸化氨基酸的侧链与磷脂结合位点发 生断裂,产生磷酸基团的特异性片段,即报告离子。带 有磷酸基团的肽片段 在阴离子模式下产生分子质量丢失79u(PO3 - ) 在阳离子模式下产生分子质量丢失98u(H3 P O 4 )
Phosphorylation 磷酸化
大部分细胞过程实际上是被可逆的 蛋白磷酸化所调控的, 至少有30%的 蛋白被磷酸化修饰。
当磷酸化作用后,蛋白质便具有了 电荷,从而使结构发生变化,进一 步引起蛋白质活性的变化.
信号传导----级联式磷酸化
Acetylation 乙酰化
是细胞内蛋白质翻译后修饰的一 种重要形式。组蛋白等许多蛋白 都可以发生乙酰化。
这三位科学家发现,一种被称为泛素的多肽 在需要能量的蛋白质降解过程中扮演着重要 角色。它就像标签一样,被贴上标签的蛋白 质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”,在那 里被降解。
泛素(Ubiquitin): 是由76个氨基酸组成的高度保守 的多肽链,广泛分布于各类细胞。
泛素化:泛素共价地结合于底物蛋白质的赖氨酸残基, 被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并迅速降解, 泛素的这种标记作用是非底物特异性的。
存在放射性污染的问题; 一次只能分析一个目的蛋白质,不适应蛋白质组大规
模、整体分析的策略。
现在技术
① 磷酸化蛋白质的分离,最常用的是二维凝胶电泳技术; ② 磷酸化蛋白质的检测,通常用32P放射性标记放射自显
影和抗磷酸氨基酸抗体免疫反应的方法; ③ 磷酸化蛋白质的识别,可以用肽质量指纹谱方法或串
联质谱测序方法; ④ 磷酸化位点的鉴定,可用磷酸酶法、串联质谱测序法
而酪氨酸的磷酸化则由 于磷酸基团连在苯环上, 不会发生β消除,相对 是较稳定的
二.磷酸化蛋白质组分析 传统技术
比较磷酸化蛋白质的二维磷酸肽图,通过磷酸化多肽的共迁移 证明体内和体外磷酸化位点相同与否。
局限性
间接确定了体内蛋白质的磷酸化位点; 一般都要采用放射性标记磷酸化蛋白质和磷酸化肽段,
蛋白激酶 (Protein kinase, PK)催化蛋白质的含羟基氨基 酸(丝/苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯。
蛋白质磷酸酯酶 (Protein phosphatase, PPase) 催化磷 酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。
真核细胞蛋白质的磷酸化翻译后修饰一般是O-磷酸化, 磷酸化位点在蛋白质的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨 酸(Tyr)残基侧链的羟基上。
原核生物中蛋白质的磷酸化位点常在组氨酸(His)、天冬 氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),此外,在赖氨酸(Lys)、精氨酸 (Arg)和半胱氨酸(Cys)也会发生磷酸化修饰。
不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点(不 同的氨基酸顺序)。
蛋白质磷酸化过程中的质量与结构变化
丝氨酸和苏氨酸磷酸化 是不稳定的,在碱性条 件下,磷酸基团易脱去, 发生β消除作用,再脱 去一分子水
Ubiquitin: Proteins are usually tagged for selective destruction in proteolytic complexes called proteasomes by covalent attachment of ubiquitin, a small, compact, highly conserved protein.
回顾与总结
生化方法:GST pull down,免疫共沉淀 分子生物学方法:生物模型及工作原理
酵母双杂交 噬菌体展示技术
第九章 蛋白质翻译后修饰的鉴定
Post-Translational Modifications (PTM)
酰胺化 甲硫基化
氨甲酰化三棕榈酸 瓜氨酸化
次磺酸 亚磺酸
脱酰胺化 三棕榈酸化
样品制备 制备型2D胶电泳 分析型2D胶电泳
CBB染色 膜转印
磷酸氨基酸抗体免疫检测 磷酸化蛋白质
找出相应的
CBB染色得到
磷酸化蛋白质 图谱比较 全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
磷酸化蛋出质组的抗体免疫印迹分析策略
四、磷酸肽的分离和富集
由于蛋白质磷酸化的化学计量值较低,磷酸化肽段的 信号丰度会比相应未磷酸化肽段的丰度要低。因此需 要分离富集磷酸肽。 常用的分析方法是将蛋白质酶解成肽段,找到被磷酸 化修饰的肽段,并对该肽段进行序列分析,确定发生 磷酸化的氨基酸位点。
(二碳酸二叔丁酯)
(半胱胺基)
(碘乙酰凝胶)
五、磷酸化肽段的识别
1. MALDI-TOF-MS结合磷酸酶水解分析法 ①将磷酸化蛋白用蛋白水解酶水解为肽片段; ②磷酸(酯)酶使磷酸化肽段脱磷酸,失去一个HPO3 分 ③用质谱分析磷酸酶作用前后肽质量谱的差异,寻找质
量数减少80 Da或80倍数的肽段; ④确定发生磷酸化的肽段及磷酸化的数目。
死 亡
以抑制细胞发生癌变,但如果对P53蛋白质的生
之 产把关不严,就会导致人体抑制细胞癌变的能力
吻 下降,诱发癌症。
The life cycle of a protein
损伤
泛素化
损伤
泛素化
磷酸化
糖基化 棕榈酰化
最常见修饰包括磷酸化和糖基化,在生命活动中具有 重要的调控作用,因此也是目前蛋白质组中翻译后 修饰研究的热点。
甲酰化
硫辛酸化
豆蔻酸化 亚硝基化 辛基化 棕榈酰化
磷酸吡哆醇化 磷酸泛酰巯基乙胺化
Glycosylation 糖基化
是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价 结合的过程。
葡萄糖(Glc) 甘露糖(Man) 半乳糖(Gal) N-乙酰葡糖胺(GlcNAC) 唾液酸,泛指的(Sia)
Folded protein structure (schematic)
An isopeptide bond links the terminal carboxyl of ubiquitin to the ε-amino group of a lysine residue of a " condemned" protein.
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Ubiquitin Isopeptide Bond
(1)母离子扫描 负离子模式下,所有的磷酸化多肽都会产生-PO3 3 - 特 性负离子(79u),扫描磷酸肽丢失79u离子的谱峰, 具有高选择性和灵敏度。 由于磷酸肽的测序需要在阳离子模式下进行,因此采用 母离子扫描很难进行序列分析。
(2)中性丢失扫描 是指串联质谱分析中对CID作用后丢失的中性 H3 P O 4 ( m / z 9 7 . 9 ) 离子
等。
蛋白质磷酸化分析的困难
蛋白质的磷酸化研究还未达到常规的实验水平,就目前而 言,磷酸化蛋白质的研究就是磷酸化肽段的研究。
① 磷酸化蛋白质的相对丰度较低; ② 蛋白质磷酸化是动态的,存在多种形式; ③ 细胞内有许多磷酸酯酶,需要加入磷酸酯酶抑制剂; ④ 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段,呈负电性,在质