Asr基因家族的研究进展_杨晔

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (6): 817–827 doi: 10.13592/ki.ppj.2016.0162817收稿 2016-04-14 修定 2016-05-28资助 贵州省高层次创新型人才培养计划(黔科合人才[2015]4031号)和贵州省研究生教育创新基地建设(黔教研合CXJD 字[2014]001)项目。

* 通讯作者(E-mail: mshzhang@)。

植物花青素合成酶ANS 基因的研究进展李小兰, 张明生*, 吕享贵州大学生命科学学院, 山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室, 贵阳550025摘要: 花青素合成酶ANS 是植物花青素生物合成途径末端的关键酶, 催化无色花色素转变为有色花青素。

本文通过对ANS 基因结构和功能进行综述, 旨在为更多植物ANS 基因的克隆及功能分析、花青素合成分子调控机制探索、花青素的开发利用等提供参考资料。

关键词: 花青素合成酶; 基因功能; 表达调控; 花青素; 逆境胁迫花青素是植物次生代谢产物, 属于黄酮类水溶性天然色素, 主要以糖苷形式存在于表皮细胞的液泡中, 使植物的花、果实、种皮等器官呈现红、蓝、紫等颜色(顾林等2007; 张彬2011)。

花青素具有多种生理功能, 对植物自身方面, 能吸引昆虫传粉、防止植物受紫外辐射、保护DNA 不受破坏、使细胞分化、抵御低温、防止病害以及使生命过程正常进行等; 对人类健康方面, 具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能(张彬2011)。

无色花青素双加氧酶/花青素合成酶(leucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase, LDOX/ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶, 催化无色花色素到有色花色素的转变(亓希武等2013; Jaakola 2013; Nakajima 等2001)。

ERF转录因子研究进展高浩;竺锡武【摘要】ERF(Ethylene-responsive factor)转录因子是AP2/ERF大家族中的一个大的亚家族,仅含1个AP2/ERF结构域,每个成员都含有1个由大约60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域.有研究表明,每种植物有100种以上ERF转录因子,其功能各不相同,分别具有调节植物生长发育、抗生物胁迫和非生物胁迫的作用等.本文就ERF转录因子的研究现状及发展趋势进行分析,以期为ERF转录因子的应用提供参考.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】3页(P130-131,134)【关键词】ERF转录因子;功能;作用机理【作者】高浩;竺锡武【作者单位】湖南人文科技学院,湖南娄底 417000;湖南人文科技学院,湖南娄底417000【正文语种】中文【中图分类】Q943随着环境条件的恶化，植物在生长发育过程中受到的非生物因素和生物因素影响会更多，如高温、低温、干旱、盐碱、病虫害等。

在不断适应环境和进化过程中，植物形成了复杂有效的逆境胁迫应答体系，可以调节植物使其能够适应新的生长环境。

其中，在转录水平的调控过程中转录因子发挥了非常重要的作用[1]。

转录因子又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子[2]。

AP2/ERF家族转录因子对植物非常重要，可以调控植物整个生命周期的生长发育和逆境[3-7]。

根据AP2结构域的数目和结构特点，AP2/ERF家族转录因子可分为4个亚族（ERF、DREB、AP2、RAV）和单独成员（Soloist）[4-5，8]。

ERF（Ethylene-responsive factor）转录因子是 AP2/ERF大家族中的一个大的亚家族，仅含1个AP2/ERF结构域，在结构域序列的第14位和第19位分别是丙氨酸和天冬氨酸。

dohl0.3969/j.issn.2095-3887.2021.03.009KISS1R 基因调控哺乳动物繁殖性能的研究进展李华振，储明星(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重E 实验室，北京100193)摘要:青春期的长短和机体发育水平对动物的生产力有很大影响。

缩短青春期、提高初情期繁殖轴器官发育水平以及优化幼畜出生日期等对提高动物的繁殖效率具有重要意义。

KISSIR 基因及其配体能刺激下丘脑释放GnRH ，继而调控雌性动物的卵巢发育和卵巢颗粒细胞的增殖，从而影响动物的 繁殖性能。

文章总结了目前关于KISS1R 基因在动物发情周期、性早熟、性晚熟和青春期发育等繁殖 性能中的作用，以期为后续研究提供借鉴。

关键词:哺乳动物;KISS1R ;繁殖性能中图分类号:S814.8文献标识码:A文章编号:2095-3887(2021 )03-0048-06Research Progress on the Reproductive Performance Regulation of K ISSIR in MammalsLI Huazhen , CHU Mingxing(Key Laboratory of Animal Genetics , Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ,Inst i t u te of Animal Science , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100193, China )Abstract : The time of adolescence and the level of development had a great influence on animal productivity.Shortening puberty , improving the development level of reproductive axis organs in the first estrus and optimizing the date of birth would improve re ­productive efficiency in animals.Research in recent years has shown that KISS1R plays an important role in regulating animal go ­nad development and reproduction .Many past studies haverevealed that KISS1R was important in animal reproduction and youth development.KISS1R was expressed at different levels in the hypothalamic-pituitary-gonad (HPG ) axis tis ­sues of seasonal estrus animals.This article summarized the收稿日期：2021-01-13基金项目：国家自然科学基金项目⑶861143012)；国家肉羊产业技术体系专项(CARS-38)；中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS13)作者简介:李华振(1992-),男，硕士,主要从事绵羊分子育种研究工作通信作者:储明星,研究员,博士，博士生导师,主要从事羊优异繁殖性状分子 机理研究工作[7]张晨，李静，王云鹏，等•全收粪法与不同内源指示剂法测定山羊 饲粮中养分消化率的比较[]•动物营养学报,2020,32(7)： 3274-3281.[8 ]王文奇，侯广田，罗永明，等•不同精粗比全混合颗粒饲粮对母羊营养物质表观消化率、氮代谢和能量代谢的影响[]•动物营养学报,2014,26(11)：3316-3324.[9] 李 ， ，王 ，等. 不同精粗 对9烷排放与生长性能及营养物质消化率的影响[J ]-饲料工业， 2019，40(11) 12-18.[ 10] ， 国， ，等. 精粗 对分率和尿瞟吟衍生物排出量的影响[]•饲料研究,2015(19)： 40-44.[11]石蕊•不同精粗比日粮对奶山羊养分消化及瘤胃、肝脏脂肪酸代谢的影响[D ]•南京:南京农业大学,2013:41-42.[12].不同精粗 与 生指标变化的研究[D ] •银川：宁夏大学,2019： 64-65-[13] 崔树和，李香子,高青山，等•不同精粗比膨化玉米秸秆饲料对延生产性 生 指 [ J ] . 研究, 2016( 4)21-26.[14] ,王振 , 同 ,等.不同精粗对 机体内定性[ J ].学 , 2008( 4)455-459.[15] 施力光，赵春萍，曹婷，等•不同日粮精粗比对海南黑山羊抗氧化性能的影响[J ]-中国草食动物科学,2015,35(1)： 29-31.[16] 张帆，崔凯，毕研亮,等•妊娠后期母羊饲粮精料比例对羔羊生长性能、消化性能及血清抗氧化指标的影响[J ].动物营养学报， 2017,29(10) 3583-3591.current role of KISS1R in animal estrus cycle+precocious puberty+late puberty+puberty development+hoping to provide a refer­ence for follow-up research.Keywords:mammals;KISS1R;reproductive performanceKISS1受体(KISSI receptor,KISS1R)又名GPR54,是KISS1基因编码的神经肽Kisspeptin在动物体内的受体。

中国畜牧兽医㊀２０１９,４６(５):１４２９Ｇ１４３８C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 绵羊骨骼肌生长发育调控基因研究进展孙燕勇１,付绍印１,２,３,祁云霞２,何小龙２,孙德欣２,方勤圆２,陈㊀欣２,刘永斌２∗,张文广１∗(１．内蒙古农业大学动物科学学院,内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室,呼和浩特０１００１８;２．内蒙古农牧业科学院,呼和浩特０１００３１;３．内蒙古A T C G 生物信息研究所,呼和浩特０１００２０)摘㊀要:骨骼肌发育是一个复杂的过程,其中包括肌细胞的形成与增殖㊁肌管和肌纤维的形成及最后的成熟过程.骨骼肌生长发育直接影响到绵羊的生产性能.随着测序技术的发展,更多人尝试从基因层面来阐述骨骼肌发育过程中系统的调控网络,挖掘与肉品质㊁产肉性能等重要功能性状相关的分子标记.肌细胞增强因子２(M E F ２)是控制肌肉基因表达的保守且功能显著的转录因子,在调节肌肉生成㊁神经发育与分化等方面起作用.成肌细胞决定因子(m y o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n ,M y o D )基因家族调控肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟.为了更深入地认识与绵羊骨骼肌生长发育相关的调控基因的功能,作者从骨骼肌的结构特点入手,重点介绍M E F ２与M y o D 基因家族的结构与功能,以及非编码R N A 对骨骼肌中基因表达的调控作用.关键词:绵羊;骨骼肌;M E F ２基因;M y o D 基因;生长发育中图分类号:S ８１３．３文献标识码:AD o i :１０．１６４３１/j．c n k i ．１６７１Ｇ７２３６．２０１９．０５．０２１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):修回日期:２０１８Ｇ１１Ｇ２０基金项目:国家自然科学基因(３１５６０６２２㊁３１７６０６５８);国家肉羊产业技术体系建设项目(C A R S Ｇ３８)作者简介:孙燕勇(１９８８Ｇ),女,河北张家口人,博士生,研究方向:动物遗传育种与繁殖,E Ｇm a i l :t u r e _f a i t h ６＠１６３．c o m ∗通信作者:刘永斌(１９７７Ｇ),男,研究员,硕士生导师,研究方向:动物遗传育种与繁殖,E Ｇm a i l :yb l i u １１７＠１２６．c o m 张文广(１９７３Ｇ),男,教授,博士生导师,研究方向:数量基因组学暨性状遗传机理,E Ｇm a i l :a c t g n m b i ＠a l i yu n ．c o m R e s e a r c hA d v a n c e s o nR e gu l a t i o nG e n e s o fG r o w t ha n d D e v e l o p m e n t o f S k e l e t a lM u s c l e i nS h e e pS U N Y a n y o n g １,F US h a o y i n １,２,３,Q IY u n x i a ２,H EX i a o l o n g ２,SU N D e x i n ２,F A N G Q i n y u a n ２,C H E N X i n ２,L I U Y o n g b i n ２∗,Z H A N G W e n g u a n g１∗(１．K e y L a b o r a t o r y o f A n i m a lG e n e t i c s ,B r e e d i n g a n dR e p r o d u c t i o no f t h e I n n e rM o n go l i a A u t o n o m o u s R e g i o n ,C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,I n n e rM o n go l i a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,H o h h o t ０１００１８,C h i n a ;２．I n n e rM o n g o l i aA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l&A n i m a lH u s b a n d r y Sc i e n c e s ,H o h h o t ０１００３１,C h i n a ;３．I n s t i t u t e o f A T C G ,N e iM o n g o l i aB i o ＧI n fo r m a t i o n ,H o h h o t ０１００２０,C h i n a )A b s t r a c t :S k e l e t a lm u s c l e d e v e l o p m e n t i s a c o m p l e x p r o c e s s i n v o l v i n gt h e f o r m a t i o n a n d p r o l i f e r a Ｇt i o no fm u s c l ec e l l s ,t h ef o r m a t i o no fm u s c l ed u c t sa n d m u s c l ef i b e r s ,a n dt h ef i n a lm a t u r a t i o n p r o c e s s ．T h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t o f s k e l e t a lm u s c l ed i r e c t l y af f e c t s t h e p r o d u c t i o n p e r f o r m Ｇa n c e i n s h e e p ．W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f s e q u e n c i ng t e ch n o l o g y ,m o r e a n dm o r e p e o p l e a r e t r yi n gt o e l u c i d a t e t h e s y s t e m a t i c r e g u l a t o r y n e t w o r ko f s k e l e t a lm u s c l e d e v e l o pm e n t f r o mt h e g e n e t i c l e v Ｇe l ,a n de x p l o r e t h em o l e c u l a rm a r k e r s r e l a t e d t o t h e i m p o r t a n t f u n c t i o n a l t r a i t s s u c h a sm e a t qu a l i Ｇt y an dm e a t p r o d u c t i o n p e r f o r m a n c e ．C e l l e n h a n c e m e n t f a c t o r ２(M E F ２)i s a c o n s e r v e d a n d f u n c Ｇt i o n a l t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t h a t c o n t r o l s t h e e x p r e s s i o no fm u s c l e g e n e s a n d p l a y s a r o l e i n r e gu l a Ｇ中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀t i n g m u s c l e g e n e r a t i o n,n e u r a l d e v e l o p m e n t a n dd i f f e r e n t i a t i o n．M y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n(M y o D) g e n e f a m i l y r e g u l a t e s t h ed i f f e r e n t i a t i o no fm y o c y t e sa n dt h em a t u r a t i o no f s k e l e t a lm u s c l es y sＧt e m．I no r d e r t o f u r t h e r u n d e r s t a n d t h e f u n c t i o no f s h e e p s k e l e t a lm u s c l e a n d i t s g r o w t ha n dd eＧv e l o p m e n t r e g u l a t o r yg e n e s,s t a r t i n g f r o mt h e s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f s k e l e t a lm u s c l e,t h i s p a p e r f oＧc u s e s o n t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o no f M E F２a n d M y o D g e n e s f a m i l y a n d t h e r e g u l a t i o no f n o nＧc o d i n gg e n e o n g e n e e x p r e s s i o n i ns k e l e t a lm u s c l e．K e y w o r d s:s h e e p;s k e l e t a lm u s c l e;M E F２g e n e;M y o D g e n e;g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t㊀㊀多年来绵羊骨骼肌生长发育机制的研究备受关注[１],骨骼肌不仅为哺乳动物的运动系统提供保障,同时也为周围组织的葡萄糖氧化和脂肪酸氧化提供重要场所.骨骼肌生长发育是一个渐进的过程,优质的遗传背景是基础,内源性的基因调控作用也是影响因素之一.基因通常不能独立发挥作用,基因之间的相互调节及作用构成了其复杂生物功能.目前已知的转录因子调控网络可以调控肌肉生长㊁形态变化与肌肉分化过程相关基因的表达水平[２].胎儿期是骨骼肌发育的关键时期,大多数肌纤维是在胚胎期形成的.成肌细胞中未分化成熟的细胞融合成长为圆柱形多核细胞,形成肌纤维,该过程主要由肌细胞增强因子２(M E F２)家族[３]和肌肉调节因子调控[４],成肌细胞决定因子(M y o D)家族启动和调控胚胎中肌原性发育的不同区域分化过程.而出生后几周内,肌纤维内部结构的成熟使基因行使更复杂的功能[５].成年绵羊肌肉已经完全成熟,不同的肌纤维类型则成为决定其功能的关键因素.M E F２A活性的增加可以促进快速成肌细胞中肌球蛋白的表达,M E F２结合位点在表达慢肌球蛋白克隆的肌管中发挥作用.此外,非编码R N A(n o nＧc o d i n g R N A,n c R N A)作为一种内源性非蛋白编码转录本,在动物肌肉发育和基因表达中发挥了复杂而精确的调节功能[６].H o r a k等[７]研究发现,微小R N A (m i RＧ１３３㊁m i RＧ２０６和m i RＧ１等)与环形R N A(c i rＧc u l a rR N A s,c i r c R N A s)也能参与调控骨骼肌的生长和发育.鉴于此,笔者从骨骼肌的结构入手,详细阐述了绵羊骨骼肌生长发育中相关基因的调控功能.１㊀骨骼肌的结构１．１㊀骨骼肌概述骨骼肌由骨骼肌纤维构成,包括肌原纤维㊁横小管和肌浆网(图１).肌原纤维是直径约为１μm的长蛋白质束,在光镜下观察肌原纤维由明暗相间的带组成,分别为Ⅰ带和A带,其中明带中央的暗线称为Z线(间线).虽然肌纤维没有光滑的内质网池,但它包含肌浆网.肌浆网包裹着肌原纤维,为肌肉收缩提供钙离子储备,同时周期性地扩张终池.这些肌纤维在两个终池之间形成管状内折,称为横向小管(T细管).骨骼肌的发育比较复杂,包括肌细胞的形成㊁增殖[９],肌管和肌纤维的形成,以及最后成熟过程[１０].在脊椎动物胚胎期,多功能干细胞开始分化成肌肉始祖细胞,再次分化成为肌细胞,随后在一定内环境条件下融合成肌管,最终形成肌纤维[１１].肌纤维是肌肉的基本单位,由于肌纤维的异质性造成动物出生后发育过程中存在不同特性和功能的肌肉组织.１．２㊀骨骼肌肌纤维的分类与特性骨骼肌纤维类型有不同的分类方法:第一类是依据骨骼肌生理形态的物理分类方法,即按照肌肉颜色不同分为红肌与白肌;第二类则根据化学反应分类,即在肌球蛋白A T P酶(A T P a s e)与湖泊酸脱氢酶(S D H)化学染色的条件下,根据肌球蛋白A T P 酶在不同酸碱环境的活性差异,可以将骨骼肌纤维分为Ⅰ型㊁Ⅱa型㊁Ⅱb型[１２],在肌球蛋白A T P酶㊁αＧ磷酸甘油脱氢酶或琥珀酸脱氢酶染色下,依据骨骼肌纤维收缩的差异将肌纤维分为快收缩酵解型(F G)㊁快收缩氧化酵解型(F O G)和慢收缩氧化型(S O)[１３];第三类是根据肌纤维的氧化和收缩的性质,并结合肌球蛋白重链M y H C(m y o s i nh e a v y c h a i n s)异构体的表达特性进行分类,采用免疫组化方法对肌纤维类型鉴定,根据骨骼肌肌球蛋白重链同功型差异将肌纤维分为４个亚型:快速酵解型(Ⅱb型)㊁中间型(Ⅱx型)㊁慢速氧化型肌纤维(Ⅰ型)和快速氧化型(Ⅱa型)[２].肌纤维的数量在出生后基本恒定,但是肌纤维的大小与肌纤维类型转化会随着畜禽的生长发育而改变,即经历一个肌纤维成熟的过程.这种相互转化一般是依照Ⅰ型ѳңⅡa型ѳңⅡx型ѳңⅡb 型之间不断变化的[１４](图２).０３４１㊀５期孙燕勇等:绵羊骨骼肌生长发育调控基因研究进展M y o f i b r i l ,肌原纤维;B a s a l l a m i n a ,基膜;G l y c o ge n ,糖原;C e l lm e m b r a n e ,细胞膜;F i l a m e n t of a c t i n ,丝状肌动蛋白;F i l a m e n t o f t i t i n ,丝状肌;S a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m ,肌浆网;Ab a n d ,A 带;H b a n d ,H 带;Ml i n e ,M 线;M i t o c h o n d r i a ,线粒体;Ⅰb a n d ,Ⅰ带;T e r m i n a l c i s t e r n ,终池;Z l i n e ,Z 线;G i r d l e o f d e s m i n ,结蛋白束带;F i l a m e n t o fm y o s i n ,肌球蛋白长丝;Tt u b u l e ,T 管图１㊀骨骼肌纤维结构[８]F i g．１㊀T h e s t r u c t u r e o fm u s c l e f i b e r [８]图２㊀M E F ２结构与功能的对齐[１５]F i g ．２㊀A l i gn m e n t o f s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n s o fM E F ２[１５]㊀㊀除此之外,激素㊁点刺激㊁神经刺激及强烈运动㊁不同的生理状态等都可能引起不同程度的骨骼肌肌纤维类型的转变[１６],而肌肉的生长主要通过肌肉细胞的肥大来实现,这种肥大是指肌纤维的直径增大,伴随着蛋白质合成的增加,以及部分D N A 数量的增加.研究发现,肌纤维内D N A 的数量随着出生后或负荷运动的出现而增加,而肌细胞核则没有复制D N A 的能力,所以可能是肌纤维之外的地方提供新积蓄的D N A .而关于跨物种比较,绵羊与啮齿类动物有明显的差异,但是绵羊肌肉的纤维类型比小鼠的更接近于人类.因此,绵羊可能是研究骨骼肌更适合的模式动物[１７].２㊀编码基因对绵羊骨骼肌生长发育的调控骨骼肌生长发育研究最多的主要有M E F ２和M yo D 基因家族,在体外细胞培养过程中,M E F ２与M yo D 基因家族成员在基因表达的激活和成纤维细胞向成肌细胞转化中协同作用,在体内,M E F ２是哺乳动物肌肉再生所必需的,它们在多种组织中具有重叠的表达模式,下面主要介绍M E F ２与M y o D 基因家族对骨骼肌生长发育的调控作用.１３４１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀２．１㊀M E F２基因家族对骨骼肌发育的调控M E F２基因家族由M E F２A㊁M E F２B㊁M E F２C 和M E F２D４个基因组成[１８],在调节肌肉生成㊁神经发育与分化等方面起作用.此外,M E F２也是控制肌肉基因表达的保守且功能显著的转录因子.２．１．１㊀M E F２基因的结构与表达㊀㊀M E F２高度保守(图２),如在果蝇㊁秀丽隐杆线虫和海胆中都存在M E F２基因.在脊椎动物基因组中,M E F２A㊁M E F２B㊁M E F２C和M E F２D４个基因密切相关,通过可变剪切的形式产生不同的转录产物.它们编码的蛋白质与含共有序列C T A(A/T)４T A G的D N A 结合,形成同源和异源二聚体.不同M E F２的同种型是否与M E F２共有序列的变体结合尚不清楚[１９]. M E F２的关键功能域包括N末端MA D S盒和相邻的M E F２结构域,它们对于D N A结合和二聚化是必不可少的,且这些区域在来自不同物种的所有M E F２蛋白上表现出广泛的序列相似性.C末端区域为转录激活提供保障[２０],但该区域序列在不同的M E F２蛋白中有很大差异.M E F２蛋白可以结合D N A,这种强亲和力的结合使D N A发生弯曲[２０],此过程中MA D S盒决定D N A结合的特异性, M E F２结构域能够调节D N A结合亲和力.近期已经确定了与D N A结合的M E F２A的同源二聚体高度保守的MA D S/M E F２结构域的晶体和溶液结构[２１],但是M E F２结构/功能关系仍有待分析.研究M E F２在肌肉分化中的可能作用,首先是确定其在胚胎发育过程中的表达模式.此外,明确单个基因的表达模式及每个基因的最终同种型,这些可以解释表型与个体基因产物作用的关系.骨骼肌中的M E F２与骨骼肌特异性M R F相反,M E F２s 在心脏和平滑肌等许多组织中表达并起作用[２２].已知绵羊肌肉中M E F２C与Ⅱ型肌球蛋白重链基因表达呈正相关[２３],而在具有单独的M E F２A㊁M E F２B㊁M E F２C和M E F２D基因的哺乳动物中情况更为复杂.２．１．２㊀M E F２在肌肉中的作用㊀㊀M E F２在肌肉分化领域中的突出地位源于早期哺乳动物细胞培养和果蝇发育期间的两个发现,以及后来在各种模型系统中的工作.这些研究中第一次揭示了M E F２蛋白和M R F之间的功能性相互作用[２４].M R F最明显的特征是其可以将成纤维细胞转化为成肌细胞.当M R F与M E F２共转染时,这种能力大大增强[２４].具体而言,是M y o D与M E F２A㊁M E F２C和M E F２D,以及肌细胞生成素与M E F２C的协同作用,这种功能性配合需要M E F２和M R F的D N A结合结构域之间的直接物理相互作用.研究表明, M E F２与M R F这两种蛋白可以通过两种方式激活基因表达:①通过结合分离的D N A位点;②通过M E F２与M R F物理交互的单一位点.虽然肌肉基因C R M s通常包含这两种方式的结合位点[２５],但第二种激活方式的发现意味着M E F２与M R F也可以通过另一个结合位点激活转录,这为M R F如何通过不含有M R F结合位点的D N A序列诱导肌肉基因表达提供了解释.MR F的突变分析显示,D N A结合域中的丙氨酸和苏氨酸与肌肉基因激活密切相关[２６].然而,这些氨基酸不是D N A结合所必需的,因此它们可能是与肌肉基因激活所需的共调节因子相互作用所必需的.值得关注的是,M E F２和MR F s在成纤维细胞的肌原性转化和基因表达方面的相互协同作用需要这两种特异性氨基酸,这表明M E F２因子是M R F s的共调节因子[２６],然而仍然缺乏这种直接相互作用的确切体内证据.有研究通过功能丧失模型,即 显性/阴性 M E F２细胞来证明M R F对成纤维细胞的肌源性转化需要M E F２家族协同,相同的模型也抑制C２C１２成肌细胞形成肌管[２７].最近,该实验室使用M E F２特异性s h R N A敲除M E F２A表达的方法也发现其损害了C２C１２肌管的形成[２８].这些细胞培养研究一起指出了M E F２的有趣功能,但对M E F２在动物发育中肌肉分化过程的基因表达进行探究也是未来研究的关键.然而,对脊椎动物的这种分析由于上述４种密切相关的M E F２基因而变得复杂,它们在多种组织中具有重叠的表达模式.马晓萌[２９]对３４３只乌珠穆沁绵羊M E F２B 基因多态性与生长性状进行了关联分析,结果发现, M E F２B基因下游调控区GңA(r s４１７０１４７４５A＞G)的突变位点与４月龄乌珠穆沁羊胸围和体重呈极显著相关,与６月龄体重呈显著相关㊁与６月龄胸围呈极显著相关.张春兰[３０]研究比较了小尾寒羊与杜泊羊臂二头肌转录组,试图筛选肌肉生长和发育相关的基因,结果发现绵羊肌球蛋白轻链家族成员M Y L１㊁M Y L２㊁M Y L３和M Y L４基因均包括５个外显子,它们的起始密码子上游５ᶄ侧翼序列中含有大量M E F２㊁M y o D和M y o G转录因子的结合位点,肌球蛋白是较粗较长的肌纤维的主要成分,对于肌肉生长与收缩具有重要意义[３１].张莉等[３２]利用全基因组关联分析挖掘绵羊体重性状的遗传标记和功能基因,结果有１０个S N P s位点在全基因水平上与２３４１㊀５期孙燕勇等:绵羊骨骼肌生长发育调控基因研究进展产奶后日增重相关,且部分位点落在绵羊注释基因M E F２B上.２．２㊀M y o D基因家族对骨骼肌发育的调控生肌调节因子(M R F s)也称为肌决定因子家族(M D F s),在骨骼肌中表达的生肌调节因子称为M y o D基因家族,M y o D家族成员至少有４个: M y o D１㊁肌细胞生成素(M y o G)㊁生肌因子５(m y fＧ５)和生肌因子６(m y fＧ６/M R F４),该家族主要调控肌细胞分化和骨骼肌系统的发育成熟[３３].２．２．１㊀M y o D基因的结构与功能㊀㊀M y o D是肌原性碱性螺旋－环－螺旋(bＧH L H)转录因子(包括M y f５㊁M R F４和M y o G)的一部分,由６８个氨基酸残基组成.bＧH L H的结构高度保守,与靶位点ＧC A N N T G结合后可以激活肌肉生长基因的表达. M y o D基因家族序列同源性很高,都含有丰富的精氨酸和赖氨酸的碱性区域,此区域内的几个氨基酸与D N A结合后可以激活肌肉基因进行转录[３４].家族内成员共同起作用以启动和执行哺乳动物胚胎中肌原性发育的不同区域分化程序.激活M y o D㊁M y f５或M R F４对于确定骨骼肌祖细胞很有必要,且这些上游肌肉调节因子诱导M y o G的表达,进而驱动成肌细胞的终末分化[３５].２．２．２㊀M y o D基因在肌肉中的作用㊀㊀１９８７年, D a v i s首次发现了M y o D基因调控肌肉发育过程[３６],M y o D及其家族成员M y o G㊁M y f５和M y f６被定位到人１１与１２号染色体上[３７].M y o D与M y f５在家族中最先表达[３８](图３),可以调控㊁启动成肌细胞的融合与分化.成肌细胞是肌细胞发育的基础,也是最终形成肌肉的原材料.M y o D在bＧH L H E蛋白二聚体伴侣和同源框蛋白P b x[３９]的背景下起作用,以结合增殖的成肌细胞和分化的肌管中的相关靶基因.此外,M y o D激活其他肌肉调节因子(如M E F２㊁M y o G㊁l n c R N A和m i c r o R N A)的表达,这些肌肉调节因子联合起来诱导骨骼肌分化过程[４０].M y o D可以重建肌肉基因增强子结合位点的染色质,并激活先前沉默位点的转录.研究发现,M y o D募集组蛋白乙酰转移酶和染色质重塑复合物[４１]以使基因组区域(接近其结合位点)可被其他转录因子结合.被称为 先驱 的转录因子能够在转录惰性染色质中获得它们的结合位点,而其他转录因子只能在基因组已经转录活跃的区域中进入它们的结合位点[４２],如M y o D能够充当 先驱 转录因子;A s c l１(与M y o D一样是bＧH L H蛋白)与其他转录因子B r n２和M y t１l共同作用,通过充当 先驱 转录因子将成纤维细胞重编码为神经元身份[４３],在这种情况下,A s c l１可以占据成纤维细胞中大多数同源基因组位点.相比之下,B r n２和M y t１l 本身不能进入成纤维细胞染色质,但需要A s c l１来指定它们的结合位点. 先驱 转录因子与 跟随者 转录因子的区别在于前者对核小体表面部分D N A 结合基序的靶向能力.有趣的是,M y o D还需要指导以正确获取其一些关键转录目标,M y o D与同源框蛋白P b x１的相互作用对于M y o D与肌原蛋白启动子的初始相互作用至关重要.B u c k i n g h a m等[４４]比较了乾华美利奴羊与小尾寒羊的背最长肌的转录组数据,结果筛选出４０５个可能与肌肉生长发育㊁骨骼肌组织发育有关的差异基因,并参与肌细胞发育的生物过程.与小尾寒羊相比,乾华美利奴羊背最长肌中M y o G㊁M y o D显著上调,M y f６显著下调,由于M y o G和M y f６主要参与成肌细胞的融合与分化,M y o D是骨骼肌卫星细胞增殖的标记基因[４５],所以这可能为乾华美利奴羊与小尾寒羊肉品质差异提供了理论指导.项露颉[４６]分析了不同品种绵羊背最长肌㊁胸肌与半腱肌中M y o D基因的表达水平,结果发现,M y o D基因蛋白在３个部位中均有表达,且表达量依次为:乾华美利奴羊＞乾寒杂交羊＞小尾寒羊,这暗示不同品种绵羊肌肉分化存在差异.P e n a g a r i c a n o等[４７]对不同母体营养水平下胎儿背最长肌的转录组进行了测序,结果发现,显著差异基因基本都与骨骼肌发育相关.R e h f e k d t等[４８]报道,饲喂低蛋白日粮的妊娠母猪与饲喂相同能量但高蛋白日粮的母猪相比,其新生仔猪的肌肉分化与肌纤维数量均受到影响,且仔猪更胖,但是高淀粉母体日粮并不会影响绵羊后代的肌肉重量,但可能会影响到肌肉的形态和组织学[４９].丝裂原活化蛋白激酶(m i t o g e nＧa c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e,MA P K)信号通路作为一类促进肌肉发育的转录因子,该通路上的基因从成肌细胞发育到肌管形成过程中持续表达[５０].丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶１(MA P K p h o s p h a t a s eＧ１,MK PＧ１)可以抑制MA P K的功能,过表达MK PＧ１后长期维持细胞分化状态从而无法形成肌管.研究证明MA P K信号通路的抑制因子同样会对M R F s与M E F２有效,可降低M R F s与M E F２的活性,所以推测MR F s和M E F２正向调控MA P K通路,维持肌肉分化状态(图３).３３４１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀M y o D,成肌细胞决定因子;M y f５,生肌调节因子５;M y o G,肌细胞生成素;M E F２,肌细胞增强因子２;MA P K,丝裂原活化蛋白激酶;MK PＧ１,丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶１M y o D,M y o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n;M y f５,M y o g e n i cf a c t o r５;M y o G,M y o g e n i n;M E F２,M y o c y t ee n h a n c e rf a c t o r２; MA P K,M i t o g e nＧa c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e;MK PＧ１,MA P K p h o s p h a t a s eＧ１图３㊀肌肉发育的基本过程[３８]F i g．３㊀T h e b a s i c p r o c e s s o fm u s c l e d e v e l o p m e n t[３８]３㊀非编码R N A在骨骼肌发育中的作用在哺乳动物全基因组中,编码蛋白的基因仅占１．２％.由于转录是哺乳动物的普遍现象,大多数基因组的转录产物会产生许多非编码R N A.非编码R N A是指不编码蛋白质的R N A,包括t R N A㊁s n R N A㊁l n c R N A㊁c i r c R N A与m i c r o R N A等,其中l n c R N A是一类长度超过２００n t的非编码R N A分子.哺乳动物中４％~９％的基因组序列为l n c R N A[５１].l nＧc R N A广泛参与组织细胞的增殖㊁分化㊁凋亡㊁自噬等,尤其参与发育过程.３．１㊀l n c R N A s对绵羊骨骼肌的调控作用越来越多的研究表明,一些功能性l n c R N A s在肌肉生物学方面起调控作用[５２].在肌生成过程中, l n cＧM D１是最早发现的l n c R N A s之一,它通过与m i c r o R N A s(如m i RＧ１３５㊁m i RＧ１３３)竞争性结合,上调M E F２C与MAM L１(m a s t e r m i n dＧl i k e t r a n s c r i pＧt i o n a l c o a c t i v a t o r１)基因的表达,从而激活肌肉晚期分化[５３].另一种已知的l n c R N A,发育多能性相关因子２(d e v e l o p m e n t a l p l u r i p o t e n c yＧa s s o c i a t e d ２,D p p a２)上游结合肌肉l n c R N A,通过相互作用沉默其邻近基因并将多个D N A乙基转移酶募集至其启动子区域来发挥功能[５４].在成年绵羊快型肌纤维形成过程中,l i n cＧMY H在快肌型肌纤维的细胞核中特异性表达,阻止了慢肌基因的表达[５５].l n c R N A可能编码隐藏的功能性多肽,参与肌肉性能的调节[５６].此外,l i n cＧR AM[５７]与l n cＧm g[５８]是两个新发现的l n c R N A s,已经载入到肌肉分化与再生的功能性l n c R N A数据库中.有报道发现,M E G３在神经发育期间表达,这表明该基因可能涉及肌肉性能的调节[５９].L i等[６０]通过R N AＧS e q比较１１０d胚胎与２~３岁成年绵羊背最长肌,共获得１５６６个l n c R N A s,且在两者中差异表达的有４０４个,这些差异基因主要富集到W n t信号通路[６１]㊁钙调信号通路[６２]㊁间隙连接[６３]㊁甲状腺激素的合成[６４]等通路上.多个l n c R N A可能靶向同一个基因,如M e f２(l n c_０００３１７㊁l n c_００００８６㊁l n c_０００８４４),m y o D(L n c_０００８１９㊁l n c_０００３１７),V d r(l n c_０００７０２)和c h a r g e s (l n c_０００８３６㊁l n c_０００６６１㊁l n c_０００９０４㊁E N S O AＧR T００００００２７２０４)[５９].３．２㊀c i r c R N A s对绵羊骨骼肌的调控作用c i r c u l a rR N A s(c i r c R N A s)是非编码R N A的一种环状结构,最早从植物病毒与乙肝病毒中发现[６５].研究发现,c i r c R N A s参与调控不同年龄的猴子骨骼肌[６６]与鸡胚骨骼肌[６７]的生长发育.S u n 等[６８]比较了长白猪与蓝塘猪背最长肌转录组,结果筛选出５５６６个差异表达l n c R N A s与４３６０个差异表达c i r c R N A s,并指出l n c R N A对猪骨骼肌发育有潜在的转录后调控作用.L i等[６９]使用R N AＧS e q分析了产前(胚胎)㊁产后(成年)哈萨克绵羊肌肉中４３４１㊀５期孙燕勇等:绵羊骨骼肌生长发育调控基因研究进展c i r c R N A s的表达情况,获得５０８６个差异表达c i r c R N A s,且许多c i r c R N A s与大量肌肉相关的m i R N A s(m i RＧ１４３㊁m i RＧ１３３㊁m i RＧ２３等)存在互作效应.更有趣的是,一些c i r c R N A s同时包含不同m i R N A s的目标位点,如o a r_c i r c_０００１４１３同时包含多种m i R N A s目标位点,这些m i R N A s分别为m i RＧ１３３㊁m i RＧ１２５㊁m i RＧ１３４㊁m i RＧ１０３㊁m i RＧ１０７㊁m i RＧ１１８５㊁m i RＧ１８１㊁m i RＧ２１８㊁m i RＧ３２９,c i r c R N A (c i r c H I P K３)通过结合到９个m i R N A s的１８号结合位点来发挥调控细胞生长的功能.因此, c e R N A㊁c i r c R N A s能够与多种m i R N A s互作,进而在肌肉生长发育中起到广泛的内源性调控作用.３．３㊀m i c r o R N A s对绵羊骨骼肌的调控作用m i c r o R N A s(m i R N A s)是内源性的长度较小的一类非编码R N A s(约２２n t),它可以对靶m R N A s 进行反向调节[７０].至少有上百种m i R N A s能够调控大多数的转录组,并广泛调节动物发育的生物过程[７１].据报道,m i RＧ１和胰岛素样生长因子１(i n s uＧl i nＧl i k e g r o w t h f a c t o r１,I G FＧ１)互相调节,以调控肌肉细胞的生长与分化[７２],在骨骼肌卫星细胞分化过程中,m i RＧ１和m i RＧ２０６急剧上升,抑制成对盒转录因子P a x７的表达,限制卫星细胞的增殖潜能,导致卫星细胞的分化,最终影响肌肉生长与发育[７３].骨骼肌细胞外基质(e x t r a c e l l u l a rm a t r i x,E C M)在肌肉纤维的传输㊁维护和修复上起着重要的作用.在受伤和患病状态下,E C M可以明显地适应这种异常状态,这是一种具有临床表现和改变肌肉功能的特性.细胞外结缔组织为肌肉提供强化效果,增强肌肉的抵抗拉伸能力,这表明细胞外基质结构成分可以影响肌肉发育㊁维持肌肉结构.另外,作为m i RＧ１２５a的旁系同源基因,m i RＧ１２５b通过调节胰岛素样生长因子２(i n s u l i nＧl i k e g r o w t hf a c t o r２,I G FＧ２)来调节骨骼肌肌细胞生成与肌肉再生[７４].R o b e r t s 等[７５]基于芯片试验认为m i RＧ６７５是肌肉发育不良的分子标记物.m i RＧ６７５Ｇ３p㊁m i RＧ３７８和m i RＧ１２５aＧ５p可能涉及调节肌肉生长的环节[７６].肌肉是全身代谢的主要参与者,生长激素在肌肉生长和肌肉群中起着至关重要的作用[７７].P E R１受肌肉中生长激素的调控[７８].C A４属于碳酸酐(C A),老鼠骨骼肌纤维细胞膜外层上C A能运输乳酸[７９],因此,C A可能与肌肉p H有关,这是影响肉品质的一个重要因素[８０].可见,对相关m i R N A s的了解将有助于更好地认识与肌肉生长和发育的调控机制.４㊀小㊀结研究基因对骨骼肌生长发育的影响,不仅可以绘制出调控肌肉发育的基因网络系统,而且可以将筛选出的关键调控基因用于指导生产.以往对绵羊骨骼肌l c r o R N A㊁l n c R N A和m i R N A的整合分析较少,且多集中于从家畜表型入手寻找差异基因,这对于发育机制的整体描述仍然存在不足.今后利用不同组学及不同物种的比较组学分析等展开对骨骼肌差异的研究,将为研究骨骼肌生长发育提供新的方向.参考文献(R e f e r e n c e s):[１]㊀C HA R G ESB,R U D N I C K IM A．C e l l u l a r a n dm o l e cＧu l a r r e g u l a t i o no fm u s c l e r e g e n e r a t i o n[J]．P h y s i o l o gＧi c a l R e v i e w s,２００４,８４(１):２０９Ｇ２３８．[２]㊀Y I N H,L ID,WA N G Y,e ta l．M y o g e n i cr e g u l a t o r yf a c t o r(M R F)e x p r e s s i o n i s a f f c t e d b y e x e r c i s e i n p o s t n aＧt a l c h i c k e ns k e l e t a lm u s c l e s[J]．G e n e,２０１５,５６１(２):２９２Ｇ２９９．[３]㊀E D MO N D S O N D G,L Y O N S G E,MA R T I N J F,e t a l．M e f２g e n eＧe x p r e s s i o n m a r k st h ec a r d i a ca n ds k e l e t a lＧm u s c l e l i n e a g e s d u r i n g m o u s e e m b r y o g e n e s i s[J]．D e v e l o p m e n t,１９９４,１２０(５):１２５１Ｇ１２６３．[４]㊀Y O K O Y AMAS,A S A HA R A H．T h em y o g e n i c t r a nＧs c r i p t i o n a l n e t w o r k[J]．C e l l a n d M o l e c u l a rL i f eS c iＧe n c e s,２０１１,６８(１１):１８４３Ｇ１８４９．[５]㊀G I U D I C EJ,L O E H RJA,R O D N E Y G G,e ta l．A lＧt e r n a t i v es p l i c i n g o ff o u rt r a f f i c k i n gg e n e sr e g u l a t e sm y o f i b e r s t r u c t u r ea n ds k e l e t a lm u s c l e p h y s i o l o g y[J]．C e l l R e p o r t s,２０１６,１７(８):１９２３Ｇ１９３３．[６]㊀G O N GC,L IZ,R AMA N U J A N K,e t a l．Al o n g n o nＧc od i n g R N A,l n c M y o D,re g u l a t e ss k e l e t a lm u s c l ed i fＧf e r e n t i a t i o nb y b l o c k i ng I M P２Ｇm e d i a t e dm R N At r a n sＧl a t i o n[J]．D e v e l o p m e n t a l C e l l,２０１５,３４(２):１８１Ｇ１９１．[７]㊀H O R A K M,N O V A KJ,B I E N E R T O V AＧV A S K U J．M u s c l eＧs p e c i f i cm i c r o R N A s i ns k e l e t a lm u s c l ed e v e lＧo p m e n t[J]．D e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,２０１６,４１０(１):１Ｇ１３．[８]㊀L I E B E RRL．S k e l e t a lm u s c l e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n,& p l a s t i c t i t y:T h e p h y s i o l o g i c a l b a s i so f r e h a b i l i t a t i o n[M]．L i p p i n c o t tW i l l i a m s&W i k i n s,２００２．[９]㊀Z HA O X,MOD,L IA,e t a l．C o m p a r a t i v e a n a l y s e s b y s e q u e n c i n g o ft r a n s c r i p t o m e sd u r i n g s k e l e t a l m u s c l ed e v e l o p m e n tb e t w e e n p i g b r e e d sd i f f e r i n g i n m u s c l eg r o w t hr a t ea n df a t n e s s[J]．P L o SO n e,２０１１,６(５):e１９７７４．[１０]㊀X U Y,Q I A N H,F A N GX,e t a l．D i f f e r e n t i a l p r o t e o m ea n d t r a n s c r i p t o m ea n a l y s i so f p o r c i n es k e l e t a lm u s c l e５３４１中㊀国㊀畜㊀牧㊀兽㊀医４６卷㊀d u r i n g de v e l o p m e n t[J]．J o u r n a l of P r o t e o m i c s,２０１２,７５(７):２０９３Ｇ２１０８．[１１]㊀B U C K I N G HA N M,R E L A I X F．T h e r o l e o f p a xg e n e s i n t h ed e v e l o p m e n t o f t i s s u e sa n do r g a n s:p a x３a n d p a x７r e g u l a t e m u s c l e p r o g e n i t o rc e l l f u n c t i o n s[J]．A n n u a l R e v i e w o f C e l l D e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,２００７,２３(２３):６４５Ｇ６７３．[１２]㊀C H O IY M,N AM K W,C H O EJH,e t a l．G r o w t h,c a r c a s s,f i b e r t y p e,a n dm e a t q u a l i t y c h a r a c t e r i s t i c s i nL a r g e W h i t e p i g s w i t h d i f f e r e n tl i v e w e i g h t s[J]．L i v e s t o c k S c i e n c e,２０１３,１５５(１):１２３Ｇ１２９．[１３]㊀P E T E RJB,B AMA R DRJ,E D G E R T O N VR．M e t aＧb o l ic p r o f i l e s o f t h r e e f i b e r t y p e s o f s k e l e t a lm u s c l e i ng u i n e a p i g s a n d r a b b i t s[J]．B i o c h e m i s t r y,１９７２,１１(１４):２６２７Ｇ２６３３．[１４]㊀A U S O N I S,G O R Z A L,S C H I A F F I N O S,e ta l．E e pＧr e s s i o no fm y o s i nh e a v y c h a i n i s o f o r m s i ns t i m u l a t e df a s ta n ds l o w r a t m u s c l e s[J]．J o u r n a lo f N e u r oＧs c i e n c e t h eO f f i c i a l J o u r n a l o f t h eS o c i e t yf o rN e uＧr o s c i e n c e,１９９０,１０(１):１５３Ｇ１６０．[１５]㊀M I C HA E L V,T A Y L O R,S I MO N M,e t a l．M e f２a n d t h e s k e l e t a lm u s c l ed i f f e r e n t i a t i o n p r o g r a m[J]．S e m iＧn a r s i nC e l l&D e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,２０１７,７２:３３Ｇ４４．[１６]㊀S C H I A F F I N OS,S A N D R IM,MU R G I A M．A c t i v i t yＧd e p e n d e n t s i g n a l i n gp a t h w a y sc o n t r o l l i n g m u s c l ed iＧv e r s i t y a n d p l a s t i c i t y[J]．P g y s i o l o g y,２００７,２２(４):２６９Ｇ２７８．[１７]㊀H E MM I N G SK M,D A N I E LZCTR,B U T T E R YPJ,e t a l．D if f e r e n t i a l e f f e c t so fs h o r tＧt e r mβag o n i s ta n dg r o w t hh o r m o n e t r e a t m e n t so ne x p r e s s i o no fm y o s i nh e a v y c h a i nI I B a n d a s s o c i a t e d m e t a b o l i c g e n e si ns h e e p m u s c l e[J]．A n i m a l,２０１５,９(２):２８５Ｇ２９４．[１８]㊀B L A C KBL,O L S O N E N．T r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l o f m u s c l e d e v e l o p m e n t b y m y o c y t e e n h a n c e rf a c t o rＧ２(M E F２)p r o t e i n s[J]．A n n u a lR e v i e w o f C e l la n dD e v e l o p m e n t a lB i o l o g y,１９９８,１４(１):１６７Ｇ１９６．[１９]㊀DE S J A R D I N SC A,N A Y A FJ．T h e f u n c t i o no f t h e M E F２f a m i l y o g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n c a r d i a c d e v e lＧo p m e n t,c a r d i o g e n o m i c s,a n dd i r e c tr e p r o g r a m m i n g[J]．J o u r n a lo f C a r d i o v a s c u l a r D e v e l o p m e n ta n d D i sＧe a s e,２０１６,３(３):２６．[２０]㊀M E I E R HA N S D,S I E B E R M,A L L E MA N N R K．H i g h a f f i n i t y b i n d i n g o f M E RＧ２C c o r r e l a t e s w i t hD N Ab e n d i n g[J]．N e c l e i c A c i d sR e s e a r c h,１９９７,２５(２２):４５３７Ｇ４５４４．[２１]㊀WU Y,D E Y R,HA N A,e ta l．S t r u c t u r e o ft h e MA D SＧb o x/M E F２d o m a i no fM E F２Ab o u n d t oD N Aa n di t si m p l i c a t i o nf o r m y o c a r d i n r e c r u i t m e n t[J]．J o u r n a l o f M o l e c u l a rB i o l o g y,２０１０,３９７(２):５２０Ｇ５３３．[２２]㊀P O T T H O F F M J,O L S O N E N．M E F２:A c e n t r a lr e g u l a t o r o fd i v e r s ed e v e l o p m e n t a l p r o g r a m s[J]．D eＧv e l o p m e n t,２００７,１３４(２３):４１３１Ｇ４１４０．[２３]㊀王㊀乐．F o x O１与其调控肌纤维类型相关的研究及对羊肌肉的影响[M]．呼和浩特:内蒙古农业大学,２０１６．WA N GL．T h e s t u d y o f F o x O１a n d g e n e o fm u s c l e f iＧb e rs p ec i f i c a t i o n a n di t s e f f e c to n m e a t q u a l i t y i ns h e e p[D]．H o h h o t:I n n e rM o n g o l i aA g r i c u l t u r a lU n iＧv e r s i t y,２０１６．(i nC h i n e s e)[２４]㊀MO L K E N T I NJD,B L A C KBL,MA R T I NJ F,e t a l．C o o p e r a t i v ea c t i v a t i o no f m u s c l e g e n ee x p r e s s i o nb yM E F２a n d m y o g e n i cb H L H p r o t e i n[J]．C e l l,１９５５,８３(７):１１２５Ｇ１１３６．[２５]㊀KWO N A T,C H O U A Y,A R E N I L L A SDJ,e ta l．V a l i d a t i o n o fs k e l e t a l m u s c l ec i sＧr e g u l a t o r y m o d u l ep r e s i c t i o n s r e v e a l sn u c e o t i d e c o m p o s i t o nb i a s i n f u n cＧt i o n a l e n h a n c e r s[J]．P L o SC o m p u t a t i o n a lB i o l o g y,２０１１,７(１２):e１００２２５６．[２６]㊀B R E N N A N TJ,C HA K R A B O R T Y T,O L S O N E N．M u t a g e n e s i so ft h e m y o g e n i nb a s i cr e g i o ni d e n t i f i e sa na n c i e n t p r o t e i nm o t i f c r i t i c a l f o r a c t i v a t i o no fm y oＧg e n e s i s[J]．P r o c e e d i n g s o f t h eN a t i o n a lA c a d e m y o fS c i e n c e s o f t h eU n i t e dS t a t e s o f A m e r i c a,１９９１,８８(１３):５６７５Ｇ５６７９．[２７]㊀O R N A T S K Y OJ,A N D R E U C C I J J,M C D E R M O T TJC．A d o m i n a tＧn e g a t i v e f o r m o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o rM E F２i n h i b i t s m y o g e n e s i s[J]．T h eJ o u r n a lo f B i oＧl o g i c a lC h e m i s t r y,１９９７,２７２(５２):３３２７１Ｇ３３２７８．[２８]㊀S N Y D E RC M,R I C E A L,E S T R E L L A N L,e ta l．M E F２A r e g u l a t e st h e G t l２ＧD i o３m u c r o R N A m e g aＧc l u s t e r t om od u l a t eWN Ts i g n a l i n g i n s ke l e t a lm u s c l er e g e n e r a t i o n[J]．D e v e l o p m e n t,２０１３,１４０(１):３１Ｇ４２．[２９]㊀马晓萌．乌珠穆沁绵羊M E F２B㊁R I P K２㊁C AMKM T 基因多态性与生长性状的关联分析[D]．北京:中国农业科学院,２０１６．M A X M．S i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m o f M E F２B,R I P K２,C AMKM T g e n e s a n d a s s o c i a t i o n s w i t hg r o w t ht r a i t s i n U j u m q i ns h e e p[D]．B e i j i n g:C h i n e s eA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,２０１６．(i nC h i n e s e) [３０]㊀张春兰．小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组及肌球蛋白轻链基因家族结构特征分析[D]．泰安:山东农业大学,２０１４．Z HA N GC L．T r a n s c r i p t o m ea n a l y s i so fS m a l lＧt a i l e dH a n s h e e p a n dD o r p e r sb i c e p sb r a c h i i a n ds t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i c so fm y o s i nl i g h tc h a i n g e n ef a m i l i e s[D]．T a i a n:S h a n d o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,２０１４．(i nC h i n e s e)[３１]㊀Z HA N GSZ,X U Y,X I EH Q,e t a l．T h e p o s s i b l e r o l e o fm y o s i n l i g h t c h a i n i nm y o b l a s t p r o l i f e r a t i o n[J]．B iＧo l o g i c a l R e s e a r c h,２００９,４２(１):１２１Ｇ１３２．[３２]㊀张㊀莉,刘佳森,徐凌洋,等．绵羊体重性状全基因组６３４１。

V ol.30,N o.7pp.729-734　July ,2004作　物　学　报ACT A AG RONOMICA SI NICA第30卷第7期2004年7月　729～734页综述水稻eui 基因研究进展张书标　杨仁崔Ξ(福建农林大学作物遗传育种研究所,福建福州350002)摘　要　概述了eui 基因的发现、遗传、作用机理、定位和育种应用,及e 2杂交稻育种技术体系,并展望了eui 基因的应用研究。

关键词　水稻;eui 基因;e 2杂交稻中图分类号:S511Advances in Rice eui G ene StudiesZH ANG Shu 2Biao ,Y ANG Ren 2Cui(Institute o f G enetics &Crop Breeding ,Fujian Agriculture and Forestry Univer sity ,Fuzhou 350002,Fujian ,China )Abstract The studies on the discovery ,genetics ,action mechanism ,mapping and breeding application of eui gene ,as well as the establishment of breeding technology system of eui 2hybrids were reviewed.Prospects of the utilization of eui 2stock in hybrid rice breeding were also discussed.K ey w ords Rice ;eui gene ;eui 2hybrids 纵观水稻育种的历程,每一次新的技术突破都离不开新遗传种质资源的发现和利用。

由于半矮秆基因的发现与利用,矮化育种的成功,水稻产量提高了20%～30%。

内皮PAS1蛋白(EPAS1)基因的研究进展王雪艳;苟潇;李继中【摘要】内皮PAS1蛋白(EPAS1/HIF-2)是细胞应对缺氧时关键的转录因子,在生物体生理及病理过程中有重要作用.文中对EPAS1的结构、分布、表达调控及在病理过程中的作用、高原低氧适应性方面进行了综述,为今后进一步研究EPAS1提供了参考和借鉴.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2013(041)008【总页数】4页(P3316-3318,3376)【关键词】EPAS1;缺氧诱导因子-2;肿瘤发生;低氧适应【作者】王雪艳;苟潇;李继中【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201;云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明650201;云南迪庆州动物疾病防治中心,云南迪庆674400【正文语种】中文【中图分类】S188氧是大部分生物不可或缺的生存基础，当在低氧环境中运动或进行长时间的高强度训练时，有机体内环境会发生改变而使氧平衡状态遭到破坏，细胞就会处于缺氧状态。

低氧会使机体及细胞的生理功能发生改变，严重时可引起一系列损伤和疾病。

因此，生物有机体形成了一套完整的氧感受机制及在不同氧环境下的基因表达调控机制，以适应低氧环境。

在多种调控机制中，低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是最主要的转录因子家族，它能感受细胞内氧气浓度的变化而对多种基因进行调控，与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都存在着密切关系。

HIF最先是由Semenza等［1］于1992年在Hep3细胞中发现的。

HIF是由活性调节亚单位α和结构性表达亚单位β组成的具有转录活性的异源二聚体［2］，它同时结合着一个缺氧反应元件(hypoxia response element，HRE)。

在有氧条件下，HIF会被转录后羟基化的特定氨基酸残基α亚单位控制而失去活性。

目前认为α亚单位存在3种类型，分别为HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，这3种α亚单位虽然功能不同，但结构相似，而且三者均受到氧气调节，其中HIF-1α与HIF-2α氨基酸序列的同源性性达48%［3］。

中国科学 C 辑:生命科学 2008年 第38卷 第7期: 591 ~ 598 www. scichina. com life. scichina. com591《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESSSer/Thr 蛋白磷酸酶PPP 家族结构研究新进展王柏婧①②, 魏群①*① 北京师范大学生物化学及分子生物学系, 北京市重点实验室, 北京 100875; ② 长春师范学院生命科学学院, 长春 130032 * 联系人, E-mail: weiq@收稿日期: 2007-09-26; 接受日期: 2008-02-05国家重点基础研究计划(批准号: 2004CB719906)和国家自然科学基金(批准号: 30470393)资助项目摘要 PP1, PP2A 以及PP2B 同属于丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的PPP 家族, 在体内参与调节多种重要的生理功能, 包括细胞周期、细胞生长及分化等过程. 它们之间的同源性相对较高, 空间结构更为保守. PP1和PP2B 的结构解析研究进展较快, 但是由于PP2A 结构的复杂性以及调节亚基的多样性而相对进展较慢. 最近发现PP2A 是由结构亚基、催化亚基先组成二聚体的核心酶结构然后再与调节亚基组成三聚体全酶. 主要对丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的亚基组成和结构异同等方面进行综述.关键词丝/苏氨酸蛋白磷酸酶 亚基组成 晶体结构可逆的蛋白质磷酸化是细胞生命活动的调控中心, 它几乎调节着生命活动的所有过程包括细胞的增殖、发育与分化、肌肉收缩、新陈代谢、基因调控等, 该过程受蛋白磷酸激酶(磷酸化)及蛋白磷酸酶(脱磷酸化)的严格控制.蛋白磷酸酶按照不同的分类依据有不同的分类方式. 根据底物的特异性不同可以分为三类: 包括磷酸化的Ser/Thr 蛋白磷酸酶(PSPase)、磷酸化的Tyr 蛋白磷酸酶(PTPase)、磷酸化的双特异性蛋白磷酸酶.根据氨基酸序列的同源性、结构特征和催化机制 的不同可以将其分为: PPP 基因家族、PPM 基因家族、 PTPs 基因家族. 其中PPP 和PPM 基因家族又属于Ser/Thr 蛋白磷酸酶; 而PTPs 基因家族大部分属于Tyr 蛋白磷酸酶, 其中有一个亚家族所编码的蛋白磷酸酶则又具有双特异性蛋白磷酸酶功能.Ser/Thr 蛋白磷酸酶依据抑制因子的影响和催化底物特异性的不同, 又可以具体分为PP1和PP2两类, PP1能被热稳定的蛋白抑制剂I-1和I-2所抑制, 特异地催化磷酸化酶激酶的β亚基脱磷酸化, 而PP2不被I-1和I-2抑制, 特异地催化磷酸化酶激酶的α亚基脱磷酸化. PP2又依据其对二价金属离子依赖性的不同进一步分为PP2A, PP2B 和PP2C. 另外PP1, PP2A 和PP2C 的底物作用范围较宽, 而PP2B 则相对较窄.PP1, PP2A, PP2B 都属于蛋白磷酸酶PPP 家族, 以后又陆续发现了PP4, PP5, PP6和PP7, 它们都是体内重要的Ser/Thr 蛋白磷酸酶组成成分, 它们在体内调控多种生命过程, 包括肌肉收缩、细胞周期、细胞生长等过程[1~3]. 虽然在对二价金属离子的依赖性,抑制剂的敏感程度和底物特异性方面存在差异, 但同属于PPP 家族的PP1, PP2A, PP2B 之间存在着同源的氨基酸序列和进化相关性. 本文主要对PPP 家族磷酸酶的亚基组成、结构解析等方面的研究进展作简要综述.1 蛋白磷酸酶PP1, PP2A 和PP2B 的亚基组成1.1 PP1的亚基组成从亚基组成上看, PP1是由一个固定不变的催化王柏婧等: Ser/Thr 蛋白磷酸酶PPP 家族结构研究新进展592亚基和几十种不同的调节亚基之一组成的异二聚体全酶. 这些不同的调节亚基将催化亚基定位到细胞的不同部位, 从而催化不同的细胞生物过程[4]. PP1的底物特异性和广泛性主要是由调节亚基决定; PP1的催化亚基在真核生物体内共有五种异构体, 分别为: α1, α2, α, γ1 和γ2. 这些异构体在一级结构氨基酸序列上有高达90%的同源性[5].1.2 PP2A 的亚基组成PP2A 的全酶由一个二聚体的核心酶和一个可变化的调节亚基B 组成. 核心酶又包括催化亚基C 和结构亚基A /PR56[6]. PP2A 核心酶与一个可变的调节亚基B 形成全酶结构. 可变的调节亚基B 有四个亚家族: B(PR55), B ′(B56或PR61), B ″(PR72) 和B ′″(PR93/ PR110). 这四个亚家族序列同源性较低, 表达水平依细胞类型及组织不同而不同. 调节亚基B 决定了PP2A 的底物特异性及功能[7].1.3 PP2B 的亚基组成PP2B 又被称为钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin, CN), 它是至今发现的唯一一种活性受Ca 2+/钙调素(Calmodulin, CaM)调控的Ser/Thr 蛋白磷酸酶. PP2B 也是一种异二聚体蛋白, 由A, B 两个亚基组成, A 亚基是催化亚基, B 亚基是调节亚基.PP2B 的催化亚基A 按照结构域可以分成五个部分, 分别是: (i) N-端区域; (ii) 催化结构域; (iii) B 亚基结合结构域(B-binding helix, BBH); (iv)钙调素结合结构域(calmodulin binding domain, CBD); (v)自抑制区(auto-inhibitory domain, AI). 调节亚基B 是Ca 2+ 结合蛋白“EF-hand ”家族成员之一, 和钙调素一样B 亚基分子上也有4个Ca 2+ 结合位点. 在B 亚基中除了Ca 2+ 结合位点外, 最重要的活性区域就是与催化亚基上的BBH 结合的疏水凹槽, 凭借这个区域, B 亚基与A 亚基紧密地结合形成二聚体[8].2 蛋白磷酸酶PP1, PP2A 和PP2B 的结构在蛋白质的一级结构即氨基酸序列上, PPP 家族与PPM 家族没有相似性; PPP 家族内PP1/PP2A/PP2B 亚家族与PP5/rdgC 等亚家族亲缘性也相差较大, 唯有PP1, PP2A 和PP2B 的同源性较高, 它们的催化结构域中约有280个氨基酸高度同源(PP1与PP2A 具有49% 的同源性, PP1与PP2B 具有40%的同源性), 三者的主要差别在于它们的非催化性的N-, C-末端不同, 以及它们结合的调节亚基不同以形成不同的全酶(图1).一直以来, 有关PP2B 以及PP1的空间结构研究开展的比较早, 而PP2A 由于全酶结构相对复杂, 一直呈滞后状态. PPP 家族磷酸酶的催化亚基除了具有较高的序列同源性, 金属离子结合位点和底物识别位点完全相同, 并且它们在二级结构与三级结构上也非常相似(图2). 它们催化亚基的二级结构都包含10个α螺旋和14个β折叠. 三维结构都各由两个β片层(sheet1和sheet2)形成为类似“β-三明治”样的λ形结构, 这两个β片层构成了催化核心, 其中的“βαβαβ”构成双金属离子结合的位点及底物结合位点. β12与β13折叠链之间各连接一个由12个氨基酸组成的环状结构, 称为β12~β13环(PP2B 也称为loop7).PP1, PP2A 和PP2B 同为金属蛋白磷酸酶, 即催图1 PPP 家族的同源序列比较图中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第7期593图2 PP1, PP2A 和PP2B 催化亚基的三级结构对比图(PP1为黑色; PP2B 为深灰色; PP2A 为浅灰色)[9]化活性中心各结合两个金属离子, PP1的活性中心据推测结合的是Fe 2+和Mn 2+, PP2A 结合的是两个Mn 2+, PP2B 则是Fe 2+和Zn 2+. 此外, 催化核心中参与金属离子配位以及参与催化作用的氨基酸残基也是保守的. 这些金属离子与氨基酸侧链之间都是以配位键(或络合键)形式相结合, 这些活性中心的金属配合物都是六配位的, 在空间结构上是八面体型.虽然PPP 家族的蛋白磷酸酶空间结构相似, 但是不同的蛋白磷酸酶催化亚基还各自有着自己结构上的特点[9].2.1 PP1的结构1995年, Egloff 等人[10]和Goldberg 等人[11]分别报道了PP1的晶体结构, 以后其他研究小组陆续解出PP1与冈田酸(OA)等其他抑制剂的空间结构[12], 但是由于N, C 末端呈无序状态, 所以这些结构只展示了7~299位氨基酸残基的空间构象. 直到2004年, Terrak 等人[4]通过把PP1与肌球蛋白磷酸酶目标亚基(MYPT1)共结晶得到了二者的复合物结构, 进而又解出了C 端10个氨基酸的结构(图3(a)). 但是目前为止N, C 末端仍有部分氨基酸空间结构未知.PP1分子结构的最明显特点是从催化活性中心向三个方向发出三条凹槽, 分别为: 酸性凹槽(acidic groove)、疏水凹槽(hydrophobic groove)和C 端凹槽(C-terminal groove) (图3(b)). 这三个凹槽从上面看呈Y 字型结构, 在Y 字型的上面两个臂之间夹着一个非常重要的结构区段为β12~β13 loop 环, 该环是同族Ser/Thr 蛋白磷酸酶共有的结构, 但是序列上保守性较差[13], 本实验室通过实验证明了该结构在活力及抑制剂的结合方面均有重要作用[14].许多天然毒素都是PP1和PP2A 的强有效抑制剂, 包括冈田酸(OA), 花萼素A (Calyculin A)、互变霉素(Tautomycin)以及微囊藻毒素(MCLR). 最近, 又解析出了PP1与另外一种毒素Motuporin 和Dihydromicro- cystin-LA 复合物的晶体结构[15]. 从结构上看, 这类毒素都有着相似的化学结构, 通常包括三个结构特征: 带有羧基基团、长的疏水尾部、大的环状结构. 它们以相似的方式与PP1结合, 通常环状结构占据了活性中心的大部分区域, 疏水尾部则占据了疏水凹槽,图3 PP1与MYPT1复合物的缎带模型及分子表面结构示意图(a) 缎带模型, 深灰色为PP1, 浅灰色为MYPT1[4]; (b) 分子表面模型(三个凹槽及β12~β13 loop 环的位置被注明)[12]王柏婧等: Ser/Thr 蛋白磷酸酶PPP 家族结构研究新进展594羧基基团则间接通过水分子与酶的活性中心的金属离子相结合, 它们之间的不同之处在于与酶分子结合的作用力有所差异.2.2 PP2A 的结构PP2A 由于结构复杂、调节亚基多样, 所以关于它的晶体结构的解析研究进展缓慢. 只是在1999年Groves 等人[17]提出PP2A 结构亚基A/PR65的晶体结构, 该结构是由15个重复的HEAT 模体(motif)组成. 这15个HEAT 完全相同, 每个HEAT 由一对反平行α螺旋组成, 最后形成为字母“C ”型结构[16]. 2006年,有三篇文章先后报道了PP2A 的核心酶及全酶的晶体结构, 从而使Ser/Thr 家族中结构最复杂的一个成员的结构得以清晰呈现[9,17,18]. PP2A 全酶为三聚体结构, 由结构亚基A(scaffolding subunit)、催化亚基 C (catalytic subunit)和一个多样性的调节亚基B(regulatory subunit)所组成, 其中A 亚基与C 亚基之间首先形成了一个稳定的二聚体核心酶结构, 之后再与B 亚基共同作用形成有催化功能的三聚体全酶(图4).图4 PP2A 的全酶结构示意图 [17]PP2A 的结构亚基A 为包含15个纵列排布的重复结构, 每一个结构均由保守的39个氨基酸残基组成, 称为HEAT 序列, 每一个HEAT 序列由一对反平行的α螺旋组成. 这15个HEAT 重复结构组成一个可伸展的马蹄形的分子, 该结构与以前报道的结果相一致. 通过对比单独的以及全酶中A 亚基的构象发现, A 亚基的构象从扭曲的状态向一种相对封闭的状态转变, 这种构象柔性对于其与调节亚基结合进而发挥PP2A 的催化功能是至关重要的.PP2A 的催化亚基C 在不同物种之间高度保守, 为典型PPP 磷酸酶家族的α/β折叠结构, 与PP1, PP2B 等相关的蛋白磷酸酶空间结构比较相似, 特别是与PP1相似性更高, 从活性中心向外也有3条凹槽, 分别为: 酸性凹槽、疏水凹槽和C 端凹槽, 并且这3个凹槽也呈Y 字型结构, Y 型的两个臂之间夹着一个β12~β13 loop 环状结构, 活性中心包含两个Mn 2+. 虽然PP2A 催化亚基与其他蛋白磷酸酶结构相似, 但仍然存在着局部差异, 主要是和溶剂相接触的分子表面loop 结构, 这些局部结构差异决定了PP2A 以及其他相关的磷酸酶的功能多样性.PP2A 的催化亚基与结构亚基之间存在着较强的特异性作用. 尽管PP2A 催化亚基与其他相关的几种磷酸酶之间存在着较高的序列同源性, 但PP2A 的结构亚基只识别自身的催化亚基. 分析发现这种特异性识别是由HEAT11~15重复子与催化亚基之间所形成15个分子间氢键以及范德华力提供的, 从而使二者形成比较稳定的二聚体核心酶结构. OA 与MCLR 毒素同样也是PP2A 的有效抑制剂, 尽管 OA 与MCLR 有着不同的化学结构, 二者却结合在PP2A 催化亚基相同的表面口袋中[9]. 虽然PP1与PP2A 有大约50%序列同源性, 但是OA 却更倾向于与PP2A 结合, 主要是由于PP2A 存在着一个疏水口袋可以把OA 完全包裹在内, 而PP1的疏水口袋则不能把OA 的疏水尾部容纳进去, 因而使得PP2A 对OA 的敏感度更高.PP2A 的调节亚基B 决定了酶与底物的特异性,虽然B 亚基家族的序列同源性较低, 但是该家族中所有亚基在与结构亚基结合区的序列却有着高度的同源性. 由于调节亚基的多样性特点, 不同的调节亚基结构并不相同, 以B56/B ’为例介绍调节亚基与结构亚基A 与催化亚基C 的结合特点. B56γ1包括8个双螺旋组成的螺线管结构, 空间结构与A 亚基中的HEAT 重复子的序列比较相似, 但二者的序列同源性中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第7期595并不高. 调节亚基以其凸起的表面结构与结构亚基A 的2-7位的HEAT 重复子结构相互作用, 但二者相作用的表面相对比较疏松, 所以二者之间不能形成稳定的结构, 直到甲基化的催化亚基的加入, 三者之间才形成稳定的三聚体结构, 从而行使PP2A 的催化 功能.PP2A 在体内受多种蛋白质的调节, 其中包括受一种独特的Leu 羧甲基转移酶(PMT)作用, 该酶的作用就是在PP2A 催化亚基C 末端的Leu309羧基基团上发生甲基化反应, 研究发现通过C 末端的甲基化作用使催化亚基C 末端的羧基基团与调节亚基的酸性序列之间的斥力减弱, 有利于形成稳定的结构, 从而也促进B 亚基与AC 二聚体核心酶之间的稳定结合(图5).2.3 PP2B 的结构自1995年以来, 先后不断有文章报道有关PP2B (CN)的晶体结构, 1995年分别发表在Cell 和Nature 上的两篇论文, 都报道了关于CNA-FKBP- FK506复合物的结构[19,20]; 此外, PNAS 和BBRC 上也发表了关于CNA-CNB-CyPA-CsA 和CNA-CNB-FKBP12- FK506四元复合物的晶体结构的文章, 并对两种晶体结构进行了比较[21~23]; 2007年Structure 杂志发表关于PP2B 结构的报道 [24]. 从几种复合物的晶体结构对比中可以看出, PP2B 本身的晶体结构, 特别是催化结构域的空间结构基本是一致的, 并且免疫抑制剂FK506和CsA 在PP2B 分子上的结合部位也基本一致. 但是在所有关于CN 晶体结构的解析报道中, 大约有100多个氨基酸片段(包括CaM 结合区CBD 及其两端连接的部分)均未能解析出来(图6).PP2B 的催化亚基除了具有与PP1和PP2A 相似的催化结构域外, 还有一段位于C-末端约185个氨基酸的调节片段(或叫自调节区域), 这一段多肽 链上又包含了三个结构域: B 亚基结合结构域(BBH)、CaM 结合结构域(CBD)和自抑制区(AI). BBH 是含有5圈螺旋的双亲结构, 上半部分非极性的疏水凹槽恰好与B 亚基结构互补, 两者结合的表面被认为是底物识别以及抑制剂的结合部位[23]. 另外, 结构分析也证明催化亚基上除了BBH 区域还包括N 末端区域使B 亚基与催化亚基结合, 我们实验室进一步验证了催化亚基上的Glu35与CNB 中的Lys134之间的盐桥在二聚体结构的稳定中也起到非常重要的作用[25]. CBD 也有一个双亲性的α-螺旋, 负责与CaM 分子上的疏水部位结合; 但由于CBD 及其两端的连接肽段没有在晶体结构中检测到, 因此这一段的结构与功能还有待于进一步研究. 另外, 根据已有的晶体结构, AI 中也有一段α-螺旋, 并且其位置非常接近催化活性中心和loop7结构(β12与β13之间), 据报道, AI 结构域介导了CaM 和B 亚基对PP2B 的激活作用.图5 催化亚基C 末端的甲基化对三聚体A-B56-C 复合物形成的调节模式图(C 亚基末端Leu309的羧基端未被甲基化时, 由于同种电荷的相斥作用, 调节亚基B56不能与AC 核心酶紧密结合不能形成稳定结构; 当C 亚基C 末端的羧基被PMT 甲基化之后, 同种电荷的斥力消失, 调节亚基B56可以与AC 核心酶形成稳定的构象)[9]王柏婧等: Ser/Thr 蛋白磷酸酶PPP 家族结构研究新进展596图6 无配体结合的PP2B(CN)晶体的缎带模型(黑色的为A 亚基; 灰色的为B 亚基; 自抑制区被标注)[20]晶体结构和体外实验表明, 在没有B 亚基和CaM 存在时, 这个调节片段就象个帽子一样覆盖在活性中心, 尤其是AI 结构域, 靠近催化活性中心, 从而抑制了PP2B 的酶活性; 当有B 亚基或者CaM 两者都存在的情况下, 由于CNB 与BBH 的结合或/和CaM 与CBD 的结合使得调节片段尤其是AI 结构域离开了反应活性部位, 使得底物容易进入活性中心, 从而提高了酶的活性[26].本实验室利用钙调素融合表达的方法对CBD 肽段进行了融合表达, 并解析出了钙调素结合的CBD 全酶结构. 该结构展示为一个二聚体全酶, 两个单体结构完全相同. 八个钙离子结合到四对EF-hand 上. 两个钙调素头尾相接, 成延展构象, 形成X 形的二聚体, 两个V 形部分各形成一个CBD 结合位点. 每个结合位点均由一个钙调素的氨基端结构域和另一个钙调素的羧基端结构域构成(图7). 这是一种新的CaM 与靶肽的结合方式, 尽管我们还无法说明这种结合方式是否与CaM 对PP2B 的调节有关, 但是这是目前得到的唯一的关于CNA 的CBD 结构信息. 从图8可以具体看出CBD 折叠成一个双亲的α螺旋, 埋入钙调素组成的疏水沟槽中[27]. 其中Ile396, Ile400, Ile403和V al409形成了疏水锚定氨基酸指向了二聚体疏水沟槽的一侧, 此外Met406, Ala407和Phe410也与疏水沟槽的表面距离很近, 同样也参与了与钙调素的作用.图7 CaM 与CBD 二聚体结构图(深灰色和浅灰色为两个伸展的CaM 分子; 黑色为CBD 分子) [27]图8 CBD 与CaM 的相互作用(中间注明的为CBD 分子, CaM 为透明的缎带模型, CBD 上的疏水氨基酸用深灰色球棍模型显示; CaM 的甲硫氨酸用黑色而球棍模型显示, 其余的疏水残基为深灰色)[27]3 展望蛋白磷酸酶作为体内一系列重要生理活动的调节者越来越引起大家的关注, 由于PPP 家族蛋白磷酸酶的空间催化结构域相似, 它们在糖原代谢、细胞周中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第7期597期、细胞凋亡以及基因转录等方面都有着相似的功能; 但是由于其调节亚基的多样, 使其在细胞中的定位有所差异, 同时也有着许多特有的功能, 即使催化相同的反应, 脱磷酸的位点也会有所不同. 研究也发现, 除了可以单独的调节细胞的活性之外, 蛋白磷酸酶之间还可以相互调节从而间接的调节蛋白质的活性, 如PP2B 还能够通过调节PP1的磷酸酶活性来间接地调节一系列蛋白质的性质[28]. 在沟回神经元中, PP2B 可以通过使抑制剂DARPP-32和I-1脱磷酸化来激活PP1[29,30]. 因为磷酸化状态的DARPP-32和I-1能与PP1结合并抑制PP1的磷酸化酶活性, 当它们被PP2B 脱磷酸化后, 就与PP1分离, 从而使PP1的磷酸化酶活性表现出来[31].然而由于研究方法的局限, 同时也由于调节亚基的多样化及复杂性, 蛋白磷酸酶结构的解析受到了一定限制, 也影响了对其功能的深入研究, 随着研究手段的进一步深入, 相信不久的将来蛋白磷酸酶将会以更清晰的面貌呈现在大家面前.参考文献1 Toole B J, Cohen P T. 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生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第5期2023年10月V ol.18,No.5Oct.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(42177414)㊀㊀第一作者:傅欣玥(1999 ),女,硕士研究生,研究方向为环境微生物耐药产生与控制,E -mail:********************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**********************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230107002傅欣玥,杨晓波,邱志刚.非抗生素类新污染物影响质粒携带的抗生素抗性基因(ARGs)水平转移研究进展[J].生态毒理学报,2023,18(5):1-12Fu X Y ,Yang X B,Qiu Z G.Nonantibiotic emerging contaminants affecting horizontal transfer of antibiotic resistance genes (ARGs)mediated by plas -mids [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(5):1-12(in Chinese)非抗生素类新污染物影响质粒携带的抗生素抗性基因(ARGs )水平转移研究进展傅欣玥1,2,杨晓波2,邱志刚2,1,*1.上海海洋大学海洋生态与环境学院,上海2013062.军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所,天津300050收稿日期:2023-01-07㊀㊀录用日期:2023-04-10摘要:人们通常认为抗生素的选择压力是造成抗生素抗性基因快速扩散的原因,但是越来越多的研究表明环境中非抗生素类新污染物也能够造成抗生素抗性基因快速扩散㊂本文对非抗生素类新污染物影响质粒携带抗性基因水平转移规律和机制研究进展进行了归纳总结㊂目前的研究大多集中在内分泌干扰物㊁药品及个人护理产品以及纳米材料影响R 质粒携带抗生素抗性基因水平转移,相关机制主要关注非抗生素类新污染物对活性氧㊁应激反应以及细胞膜通透性的影响㊂持久性有机污染物影响质粒携带抗性基因水平转移规律以及非抗生素类新污染物对其他质粒携带的抗生素抗性基因水平转移规律和其他类型的机制可以作为未来的研究方向㊂关键词:抗生素抗性基因;水平转移;质粒;新污染物文章编号:1673-5897(2023)5-001-12㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ANonantibiotic Emerging Contaminants Affecting Horizontal Transfer of Antibiotic Resistance Genes (ARGs )Mediated by PlasmidsFu Xinyue 1,2,Yang Xiaobo 2,Qiu Zhigang 2,1,*1.College of Marine Ecology and Environment,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China2.Institute of Environmental and Operational Medicine,Academy of Military Medicine Science,Academy of Military Sciences,Tianjin 300050,ChinaReceived 7January 2023㊀㊀accepted 10April 2023Abstract :It is generally believed that the pressure of antibiotic selection is the cause of rapid spread of antibiotic resistance genes (ARGs),but more and more evidences have shown that non -antibiotic emerging contaminants in the environment are also the cause of rapid spread of ARGs.In this paper,the research progress on the rule and mechanism of non -antibiotic emerging contaminants affecting the horizontal transfer of antibiotic resistance genes mediated by plasmids was summarized.At present,most of the researches focus on the laws and mechanisms of endocrine disruptors,drugs and personal care products and nanomaterials affecting the horizontal transfer of ARGs mediated by R plasmid.The mechanisms mainly include the effects of emerging nonantibiotic contaminants on re -2㊀生态毒理学报第18卷active oxygen species,SOS and cell membrane permeability.The horizontal gene transfer law induced by persistent organic pollutants requires attention.And more types of plasmids and transfer mechanisms should be taken as fu-ture research directions.Keywords:antibiotic resistance genes;horizontal transfer;plasmid;emerging contaminants㊀㊀抗生素由于可以抑制微生物生长或生存,自20世纪被发现以来就广泛应用于医药㊁畜牧以及养殖等行业[1-2]㊂由于过度和不当使用以及不完全代谢,抗生素通过污水处理厂以及垃圾渗滤液等方式进入环境中,导致环境中出现耐抗生素细菌(antibiotic re-sistance bacteria,ARBs)和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)[3-4]㊂到目前为止,人们已经从地表水以及地下水㊁自来水㊁瓶装水㊁水井㊁海湾以及河流湖泊中检测到ARBs和ARGs[4-9]㊂ARGs的快速扩散对人类社会的经济甚至生命安全带来极大的挑战[10-11]㊂经过几十年的研究发现,ARBs以及ARGs的产生主要通过自然选择产生基因突变或者通过水平转移㊂基因突变的概率较低且不稳定,ARBs以及ARGs的产生主要是通过水平转移[12]㊂水平转移是指基因跨越细菌之间的种属障碍,在同种属或不同种属的不同个体之间转移的现象[13]㊂水平转移的发生需借助可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)(包括质粒㊁噬菌体㊁转座子㊁整合子等),方式主要为转导㊁转化和接合[14]㊂转导是基因借助噬菌体进行转移㊂由于噬菌体有严格的宿主特异性,即噬菌体吸附位点和受体菌表面受体的分子结构要具有互补性,转导只发生在同种细菌之间[15]㊂转化是细菌直接吸收环境中游离的DNA㊂转化的发生需要细菌处于感受态,且还需要环境中存在大量游离的DNA片段,这在自然环境下是较难形成㊂接合则是借助质粒㊁转座子以及整合子,在细菌间通过接触形成 接合桥 后进行基因转移[16]㊂接合转移是目前环境中最常见的水平转移方式㊂抗生素在水以及土壤等环境中广泛存在,浓度由ng㊃L-1到mg㊃L-1不等,但与环境中较高的ARGs 水平不匹配[4,17-18]㊂由于ARGs可复制且具有环境持久性,其扩散可能是多种环境因素协同作用结果[19]㊂例如,已有研究人员发现如CO2㊁PM2.5等环境物质可以促进大肠杆菌属内质粒的转移[20-21],污水处理厂的氯化消毒过程可以影响ARGs的转移[22],用于细菌灭活的等离子体也可以抑制接合转移[23]㊂最近几十年,全球水环境中出现的大量以化学品为主的新污染物(emerging contaminants,ECs)引起了全社会学者的关注㊂ECs可分为内分泌干扰物(endocrine disrupting compounds,EDCs)㊁药品与个人护理产品(pharmaceutical and personal care products, PPCPs)㊁全氟化合物(perfluorinated compound,PF-Cs)㊁溴代阻燃剂(brominated flame retardant,BFRs)㊁消毒副产物(disinfection by-product,DBPs)㊁ARGs以及其他污染物㊂EDCs也被称为环境激素,是外源性有机污染物,可以与体内激素受体接合,影响激素的合成㊁运输和代谢从而干扰内分泌[24]㊂PPCPs的概念在1999年第一次提出,包含所有人用与兽用的医药品(包括处方类和非处方类药物以及生物制剂)㊁化妆品以及其他在PPCPs生产制造中添加的组分(如防腐剂等)[25]㊂PPCPs被人们广泛应用于生活中,随着多种途径进入水环境[26]㊂PFCs是一类碳原子连接的氢原子全部被氟原子取代的化合物,具有很高的稳定性,能够经受很强的热㊁光照㊁化学作用㊁微生物作用和高等脊椎动物的代谢作用而难以降解,导致其具有很强的环境持久性,会随食物链的传递在生物机体内富集和放大至相当高的浓度[27]㊂BFRs主要包括四溴双酚A㊁六溴环十二烷以及多溴联苯醚三大类,有毒且遇热后容易挥发到周围空气中并随着食物链富集和放大[28]㊂DBPs,特别是氯化消毒副产物,大多具有致癌或致突变性[29]㊂其他污染物主要包括纳米材料㊁微塑料㊁汽油添加剂㊁自由基等物质㊂事实上,在水环境中,ARGs与其他非抗生素类ECs大量共存[30-31],非抗生素类ECs可能导致了ARGs的快速扩散㊂近几年的相关研究性文章涌现,但相关的综述性文章较少,尤其是关于影响机制方面的综述㊂因此,我们试图系统地了解非抗生素类ECs怎样且如何影响ARGs的快速扩散㊂基于以上背景,本综述旨在总结:(1)影响了质粒携带的ARGs水平转移的非抗生素类ECs;(2)非抗生素类ECs影响质粒携带的ARGs水平转移的机制㊂为从源头上控制ARGs快速扩散提供解决思路,并在ECs环境问题方面给予学者更多的警示㊂第5期傅欣玥等:非抗生素类新污染物影响质粒携带的抗生素抗性基因(ARGs)水平转移研究进展3㊀1㊀非抗生素类ECs对质粒携带ARGs接合转移的影响(Effect of non-antibiotic ECs on plasmid me-diating ARGs conjugation and transfer)1.1㊀EDCs对质粒携带ARGs接合转移的影响人们对EDCs健康效应的关注在其对人体内分泌系统的影响㊂近年来随着细菌耐药问题的发展,人们开始关注EDCs对ARGs水平转移影响的研究㊂人工甜味剂作为蔗糖的替代物,广泛应用于食品的各个下属领域㊂Yu等[32]发现糖精㊁三氯蔗糖㊁阿斯巴甜和乙酰磺胺酸钾(即安赛蜜)可以促进不同种属细菌间pMS6198A质粒携带的ARGs的接合转移㊂Li等[33]的研究也证实了安赛蜜可以促进RP4质粒携带的ARGs在细菌种属内的接合转移㊂在体系相同但质粒与供受体菌不同的情况下,2位研究者对安赛蜜促进接合转移的最佳浓度有不同的研究结果㊂前者的最佳浓度为300mg㊃L-1而后者的最佳浓度为2.01mg㊃L-1㊂这种差异的形成可能是因为前者使用的是大肠杆菌K12,而后者使用的是DH5α,对安赛蜜的摄入更快㊂Li等[34]发现环境污染水平的除草剂(草甘膦㊁草铵膦和麦草畏)可以促进RP4质粒携带ARGs水平转移㊂有趣的是,Li等[34]研究发现3种除草剂改变了供体细菌细胞膜渗透性但不影响活性氧的产生㊂作为除草剂最常见的活性成分,草甘膦也曾被Zhang等[35]的研究证明可以增强质粒携带氨苄青霉素㊁卡那霉素和四环素抗性基因的水平转移频率㊂与Li等[34]的研究结果不同的是,Zhang等[35]发现草甘磷处理后活性氧水平有所上调,这可能是因为处理时间相对Li等[34]的研究结果更长㊂除了除草剂,杀菌剂也是常用的农药之一㊂早在1999年,Pearce 等[36]发现较高浓度的西曲脲可以略微降低接合转移频率而低浓度的聚维酮碘则可以降低10倍㊂Guo 等[37]的研究证明,使用50μg㊃L-1的咪鲜胺可以增强RP4质粒水平转移1.82倍㊂24.4μg㊃L-1的二葡萄糖酸氯己定也可以显著增强接合转移频率[38]㊂但是Wesgate等[39]研究发现,0.002mg㊃mL-1二葡萄糖酸氯己定阻止了接合转移㊂二者都是使用大肠杆菌作为接合实验的受体菌,但Jutkina等[38]使用处理过的污水作为复杂的供体群落而Wesgate等[39]则使用大肠杆菌13P5作为供体菌㊂褪黑激素(N-acetyl-5-methoxytryptamine)作为一种神经激素已被Jia等[40]证实可以显著抑制RP4-7质粒的接合转移频率以及抑制携带黏菌素抗性基因mcr-1的不同类型质粒的水平转移㊂Jia等[40]的研究为接合抑制剂的开发提供了一个新的思路㊂儿茶酚胺,尤其是其中的去甲肾上腺素仅用生理浓度即可增强体外接合质粒的转移效率[41]㊂Feng等[42]研究发现双酚类物质在环境相关浓度下可以增强质粒接合转移频率2倍~5倍㊂在研究过程中,Feng等[42]发现在双酚物质促进接合相关基因的表达时,细胞膜通透性及其相关基因却没有显著的变化,这与其他污染物是不同的㊂另外,杨雨桐等[43]在用新的接合模型,也即粪肠球菌作为供受体菌,pCF10作为接合质粒时,也发现双酚A可以促进接合转移㊂并且Yang等[44]研究发现,双酚A的促接合机制是通过信息素而非活性氧㊂总的来说,上述提到的人工甜味剂㊁食品防腐剂㊁除草剂㊁儿茶酚胺以及双酚类物质可以促进接合转移,褪黑激素可以抑制接合转移㊂对于杀菌剂中的EDCs,西曲脲和聚维酮碘可以降低接合转移频率,咪鲜胺可以促进质粒携带的ARGs的接合转移㊂但对于二葡萄糖酸氯己定对质粒携带的ARGs的接合转移的影响还存在争议㊂1.2㊀PPCPs对质粒携带ARGs接合转移的影响作为世界上最常见的解热镇痛药之一,对乙酰氨基酚在低浓度时可以显著促进RP4-7质粒以及携带mcr-1或tet(X4)的临床质粒的水平转移,且50μg ㊃mL-1的对乙酰氨基酚对RP4-7质粒接合转移频率的促进效果最为显著[14]㊂有趣的是,对乙酰氨基酚只通过影响供体细菌活性氧水平来促进接合转移㊂常用的抗癫痫药卡马西平分别加速了RP4质粒在种属间以及种属内的接合转移频率12倍以及9倍[45]㊂氯二甲酚是一种含有苯酚的芳香族有机化合物,广泛用于洗手液㊁液体肥皂和化妆品等PPCPs 中,在环境浓度下可以增强RP4质粒接合转移频率8.45倍~9.51倍[46]㊂在治疗癌症方面颇有前景的紫杉醇及其衍生物也被证实可以促进RP4-7质粒接合转移频率2倍以及1.3倍[47]㊂用于牙膏㊁护肤霜㊁除臭剂㊁肥皂和塑料等常用消费品的三氯生也被Lu 等[48]发现可以显著提升种属内以及种属间的接合转移频率㊂常用于抛光剂㊁洗涤剂㊁洗发水和清洁剂的三氯卡班可以加速接合频率2.17倍~4.31倍[49]㊂作为人们生活中常用到的PPCPs,上述提到的物质都能通过诱导应激反应来促进质粒携带ARGs的接合转移频率㊂也就是说,虽然这些PPCPs都是非抗生素类,但也能产生类似抗生素的对细菌的对抗作4㊀生态毒理学报第18卷用来促进接合转移㊂总的来说,对PPCPs 的相关研究还较少,未来还需多多关注此方面㊂最近有一项研究发现,非抗生素药物可以对肠道菌群产生类似抗生素的作用[50]㊂故而非抗生素类药物是否能通过转化影响ARGs 的水平转移引起了学者的注意㊂Wang 等[51]的研究发现非甾体抗炎药布洛芬㊁萘普生㊁吉非罗齐㊁双氯芬酸和普萘洛尔,尤其是吉非罗齐和普萘洛尔在临床浓度就可以促进转化1.9倍~2.4倍㊂虽然非抗生素类PPCPs 对转化有较好的促进效果,但转化频率只在10-6左右㊂1.3㊀纳米材料对质粒携带的接合转移的影响纳米材料由于其独特的物理及化学性质,被广泛应用于生活中[52]㊂但由于过度使用,环境中已经积累了相当高浓度的纳米材料,导致细菌生长受到抑制甚至威胁到人与动物的健康[53]㊂2012年Qiu 等[54]首次发现Al 2O 3纳米颗粒影响RP4㊁RK2和pCF10质粒ARGs 的转移㊂其中,对于RP4质粒而言,大肠杆菌到沙门氏菌的接合转移频率被提高了200倍,革兰氏阴性菌到革兰氏阳性菌的接合转移频率提高了50倍,大肠杆菌属内转移也提高了100倍㊂这一研究成果是细菌耐药性研究领域的新发现㊂2015年,Qiu 等[55]还发现纳米二氧化钛抑制细菌生长的同时还促进RP4质粒在大肠杆菌中的接合频率2个数量级㊂在2021年,Ding 等[56]发现纳米Al 2O 3㊁TiO 2㊁Fe 2O 3以及SiO 2都能促进携带ARGs 的纳米颗粒转化进大肠杆菌K12中,其中纳米Al 2O 3的效果最好㊂这一发现说明纳米Al 2O 3除了通过接合转移还能通过类似转导的转化来促进ARGs 的水平转移㊂Wang 等[57]发现亚致死浓度的ZnO 纳米颗粒可以显著增强RP4质粒的接合转移频率㊂其中,在大肠杆菌菌落中提高了24.3倍,在水生微生物混合群落中增强了8.3倍㊂同年,Parra 等[58]发现在亚抑制浓度下,铜纳米颗粒可以抑制pJP4和pADP1这2种质粒的接合转移频率㊂一些研究发现金属离子与其相应的纳米金属氧化物在促接合效应上具有差异㊂这种差异与金属的抗菌能力以及毒理效应有关㊂例如,Zhang 等[59]的研究证明氧化铜纳米颗粒可以促进RP4质粒携带ARGs 的转移,并且与铜离子的促进效果相比,相同浓度的CuO 纳米颗粒的促进效果更加强㊂而对于单独的纳米银,Lu 等[60]发现,银纳米颗粒和银离子在环境相关浓度和亚致死浓度下都可以促进大肠杆菌的属间转移㊂在0.1μg㊃L -1Ag 纳米颗粒暴露下,RP4质粒的接合转移频率增加了1.8倍,同时1μg ㊃L -1的Ag +则使接合转移频率增加了2.4倍㊂此外,Guo 和Tian [61]研究了由Ag ㊁TiO 2和氧化石墨烯合成的新型纳米复合材料对ARGs 转移的影响,发现即使是在高浓度下,它对大肠杆菌属内接合转移的促进效果也可达到1倍~2倍㊂Yu 等[62]研究发现了氧化铈纳米颗粒在1~50mg ㊃L -1的浓度范围内可以影响RP4质粒在大肠杆菌的属内转移㊂其中,在相对高的浓度下可以增强接合频率118%~123%,但在低浓度下却抑制22%~26%㊂对于低浓度出现相反的结果,Yu 等[62]主要归因于是活性氧水平下降㊁胞外聚合物多糖合成以及ATP 供应不足造成的㊂Guo 等[37]发现与氧化铜纳米颗粒和咪鲜胺合用使RP4质粒在大肠杆菌中接合转移频率从1.82倍增加到3.61倍㊂Liu 等[63]证实30nm 的Al 2O 3纳米颗粒可以在不使用热激法的情况下显著促进大肠杆菌到以孢子繁殖的链霉菌的接合转移频率60倍㊂Liu 等[64]发现硫化纳米级零价铁可以抑制ARGs 的传播,影响效果与硫和铁的物质的量的比例有关㊂并且,Liu 等[65]还将硫化钠米零价铁与高级氧化技术相结合来验证硫化钠米零价铁可以抑制质粒传播ARGs ㊂Pu 等[66-67]在确定了镉可以增强RP4质粒ARGs 的传播后,研究了同时暴露Cd 2+和纳米Fe 2O 3对质粒RP4接合转移的影响㊂Pu 等[66-67]发现,虽然随着纳米Fe 2O 3浓度的升高镉离子浓度会因被去除而降低,但高浓度的纳米Fe 2O 3颗粒和镉离子的共同作用可以显著提高RP4质粒的接合转移频率㊂而这种促接合效应可以通过对材料进行更复杂的处理而改变㊂Wang 等[68-70]研究发现Fe 2O 3@MoS 2㊁Fe 3O 4@MoS 2以及SDS 包覆Fe 3O 4@MoS 2的复合纳米材料能够抑制了RP4-7质粒的接合转移,其中SDS 包覆Fe 3O 4@MoS 2复合纳米材料的效果最好㊂Li 等[71]发现天然闪锌矿纳米颗粒以及它的有效成分硫化锌都可以有效促进大肠杆菌属内接合转移频率㊂Zhang 等[72]调查了97号汽油㊁93号汽油㊁轻柴油和船用重柴油中具有纳米级结构的废气颗粒物对ARGs 传播的影响,研究结果显示4种汽油和柴油废气颗粒分别促进了2.2倍~5.3倍㊁1.4倍~2.0倍㊁2.0倍~5.1倍和1.2倍~2.4倍㊂周宏瑞等[73]的研究发现纳米二硫化钼可以促进以pCF10第5期傅欣玥等:非抗生素类新污染物影响质粒携带的抗生素抗性基因(ARGs)水平转移研究进展5㊀为接合质粒的新接合模型的接合转移5倍~8倍㊂1.4㊀其他ECs对质粒携带的接合转移的影响由于在垃圾渗滤液中含有大量的微塑料和ARGs,Shi等[74]发现50~100nm的微塑料和200~ 500nm的纳米塑料可以促进接合转移㊂Loo等[75]也发现,微塑料生物膜可以促进弧菌中质粒的转移㊂Zha等[76]也发现了微/纳米塑料的直径变化可以影响接合转移的增强效果㊂Yuan等[77]还发现经紫外线老化的聚苯乙烯微塑料可以增强质粒pET29的转移效率5.2倍㊂微塑料对ARGs转移的促进效果的一个可能的原因是它可以吸附聚集,相对其他环境而言提供了一个更有利于接触的机会㊂He等[78]发现典型的DBPs,三氯甲烷和二氯乙腈在低浓度就分别可以促进RP4质粒转移5.5倍和6倍㊂由于消毒极易导致细菌感受态的形成,Man-tilla-Calderon等[79]发现消毒副产物溴乙酸可以促进贝氏不动杆菌的转化频率2倍㊂尽管接合和转化是2种独立的水平转移机制,但在探索到消毒副产物影响水平转移的机制时,都是活性氧水平方面的变化所调控的㊂Li等[80]证实了环境自由基可以在10 min以内,将RP4质粒在大肠杆菌中的属内接合转移频率从4.08ˑ10-5降低到1.2ˑ10-8㊂2㊀非抗生素类ECs对接合转移影响的机制(Mech-anism of the influence of non-antibiotic ECs on conjugation and metastasis)2.1㊀活性氧㊁SOS以及细胞膜通透性如图1所示,存在环境压力如紫外高温等情况下,对细胞生存有重要作用的活性氧(reactive oxy-gen species,ROS)水平会升高㊂为了抵御活性氧的攻击,细菌会通过抗氧化酶等抗氧化系统保护细菌㊂ROS水平过量至超过细菌的抗氧化能力,便会通过与各种如脂质和蛋白质等大分子反应破坏细胞膜,从而减弱细胞膜的 屏障 并诱导应激(SOS)反应以影响抗性基因转移㊂一般来说,产生的ROS越多,基因转移效率越高,除非ROS的产生高到对细菌造成过度伤害㊂由此,对于ECs对接合转移的影响,学者们基本都围绕这一方向㊂例如,Shi等[74]就发现有吸附作用的微/纳米塑料可以诱导细胞产生ROS并增加了细胞膜的通透性㊂并且影响程度与诱导时间和表面积大小相关㊂Jia等[14]也证实对乙酰氨基酚可以诱导ROS㊁SOS以及细胞膜通透性的改变㊂这个改变依赖浓度范围,当对乙酰氨基酚浓度超过250μg ㊃mL-1时,影响效果便会消失㊂Lu等[60]发现银离子和银纳米离子可以影响如过氧化氢酶㊁烷基过氧化氢还原酶等抗氧化酶活性来促进接合转移㊂与Shi 等[74]的研究较为一致的是,纳米结构的物理化学性质同样可以促进接合转移的发生㊂值得注意的是,这种通过ROS促进接合转移的现象可以通过添加活性氧清除剂如硫脲和N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-a-cetyl-L-cysteine,NAC)减弱[14,77]㊂2.2㊀能量以及代谢在各种活性细胞中存在一种高能磷酸化合物 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),它在水解时会释放大量能量以供细胞使用㊂在革兰氏阴性菌参与的接合转移中,菌毛运动㊁酶促反应㊁DNA合成以及转运质粒等过程都需要ATP供能㊂质子动力是膜内外质子浓度(通常以pH的形式表现)差或者电位差所产生的一种驱动力,它可以影响ATP的合成[81]㊂从这一方面入手,Li等[34]测试发现在磷酸缓冲溶液体系中,胞内pH有显著降低,这证实了除草剂可以通过质子动力来影响质粒转移㊂同年,Jia等[40]使用荧光染料证明褪黑激素可以通过影响氢离子和钾离子的通量来破坏膜电位㊂除了质子动力以外,学者们发现非抗生素类ECs也可以通过影响ATP合成蛋白来影响ATP的合成㊂Buberg等[82]发现锌和铜可以影响为装配T4SS提供能量的ATP蛋白酶的活性来影响接合转移㊂Lu等[60]发现银离子和银纳米离子可以影响ATP合成蛋白的表达来加速质粒转移㊂作为ATP的辅助因子,镁离子是细胞内最丰富的离子之一,它可以影响包括DNA合成与松弛酶活性的600多种酶促反应[83]㊂Li等[33]发现,镁离子浓度变化与不同安赛蜜浓度对接合转移的影响趋势一致,并且通过转录组学分析发现转运镁离子的P 型ATP酶表达有上调㊂ATP除了直接作用于接合转移以外,还影响胞外多糖的合成㊂细菌分泌的胞外聚合物(extracellu-lar polymeric substances,EPS)主要由多糖㊁蛋白质和细胞外DNA组成[84]㊂EPS提取物中蛋白质和多糖的总浓度被认为是EPS的含量,因为这两者是EPS 中的主要成分㊂EPS组成的变化,尤其是多糖,在细胞间黏附中起着重要作用㊂据报道,EPS多糖与细胞间黏附有关[85]㊂促进胞外多糖的分泌可以增加细胞间的接触㊂细胞间接触是ARGs接合转移的前提条件㊂Yu等[62]发现CeO2可以通过抑制细胞外聚6㊀生态毒理学报第18卷合物物质中多糖的合成而减弱的细胞间接触从而抑制接合转移㊂Li 等[80]发现在环境自由基暴露下,EPS 分泌减少可能导致细胞屏障的破坏㊂Li 等[34]发现草甘膦和麦草畏可以显著增加EPS 的分泌进而促进接合转移㊂2.3㊀基因调控表1展示了非抗生素类ECs 通过上述机制对基因调控的影响㊂除了上述机制作用过程中对基因调控产生影响,非抗生素类ECs 对接合转移相关基因调控产生的影响也是不可忽略的㊂如图1所示,对于革兰氏阴性菌,参与接合转移所必需的 接合桥 的构建因子主要由菌毛编码基因㊁全局调节因子㊁配对形成系统以及DNA 转移复制基因组成㊂现有研究发现全局调节因子主要由korA ㊁korB 和trbA 构成,它们负责在接合期间调节质粒的转移㊁复制和稳定㊂全局调节基因的下调可以激活配对形成系统,该系统在接合的早期阶段参与形成细胞表面蛋白之间的接合桥㊂trbBp 是该系统的启动子,所以非抗生素类ECs 对该基因表达的影响是较为重要的㊂除此以外,位于质粒上的tra 操纵子是编码质粒从供体细胞转运到受体细胞的重要基因[82]㊂现有研究证明korA 和korB 基因的抑制表达可以激活trfAp 基因,有助于激活复制起点的单链和DNA 结合蛋白trfA [54]㊂trfAp 和trbBp 基因的上调有助于接合转移的发生㊂在配对形成系统中,参与菌毛生成的fim 家族以及调节菌毛运动的traG 都是不可忽略的㊂DNA 转移复制基因包括3个操纵子和转移起点(oriT),即前导和松弛酶操纵子之间的基因间区域,并且DNA 转移复制基因功能参与复杂的转移复制过程的启动㊂traJ 基因的产物,与oriT 结合并参与形成松弛体,该松弛体触发环状质粒中的链特异性缺口,由此开始DNA 的转移㊂3㊀结论与展望(Conclusion and prospect )ARGs 在环境中的扩散不但引起环境生态安全问题,最终还将影响人类健康㊂因此㊂ARGs 已被定义为典型的新污染物㊂阐明ARGs 在环境中传播过程和机制是控制ARGs 快速扩散的前提㊂越来越多的研究证明了非抗生素类ECs 可以影响ARGs 的传播㊂目前的研究发现PPCPs ㊁微塑料以及消毒副产物都能通过类抗生素作用或者吸附作用诱导应激反应促进质粒携带的ARGs 水平转移㊂另外,纳米材料以及EDCs 也能影响接合转移㊂影响的机制包括ROS ㊁SOS ㊁细胞膜通透性㊁能量㊁代谢以及相关基因的调控㊂本篇综述系统的总结了这些研究,为ARGs 的控制提供思路,也为接合抑制剂的研究提供方向㊂同时,也需要引起人们对ECs 的治理以及去除工作的重视㊂图1㊀非抗生素类新污染物(ECs )促进接合转移的主要机制Fig.1㊀The main mechanism of nonantibiotic emerging contaminants (ECs)promoting conjugation transfer。

畜牧兽医学报 2023,54(9):3595-3604A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.09.001开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):畜禽泛基因组研究进展李 珂,王宇龙,李 栋,史新娥,杨公社,于太永*(西北农林科技大学动物科技学院,杨凌712100)摘 要:泛基因组是近些年来基因组研究领域出现的一个新名词,相较于单个线性参考基因组具有明显优势,能够有效解决参考基因组涵盖遗传信息有限的问题㊂随着测序技术的发展和对基因组的深入研究,泛基因组学相关研究也得到快速发展㊂本文综述了泛基因组学的发展历程㊁构建策略及其在畜禽上的研究现状,并对未来的应用趋势进行了展望,以期为畜禽泛基因组的深入研究提供参考㊂关键词:畜禽;泛基因组;核心基因;可变基因;结构变异中图分类号:S 813.3 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)09-3595-10收稿日期:2023-02-06基金项目:国家重点研发计划(2021Y F D 1301200)作者简介:李 珂(2000-),女,河南商丘人,主要从事动物遗传育种研究,E -m a i l :l i k e _1018@163.c o m ;王宇龙(2000-),男,陕西渭南人,主要从事动物遗传育种研究,E -m a l i :w a n g y u l o n g@n w a f u .e d u .c n ㊂李珂和王宇龙为同等贡献作者*通信作者:于太永,主要从事猪基因组与遗传改良研究,E -m a i l :y u t a i y o n g310@n w s u a f .e d u .c n A d v a n c e s i n P a n -g e n o m e S t u d y o f L i v e s t o c k a n d P o u l t r yL I K e ,WA N G Y u l o n g ,L I D o n g ,S H I X i n e ,Y A N G G o n g s h e ,Y U T a i y o n g *(C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g 712100,C h i n a )A b s t r a c t :A s a s t u d y h o t s p o t ,p a n -g e n o m e h a s f r e q u e n t l y a p pe a r e d i n t h e g e n o m ef i e l d i n r e c e n t y e a r s .P a n -g e n o m eh a d si g n i f i c a n t a d v a n t a g e s c o m p a r e d t o t h e s i n gl e l i n e a r r e f e r e n c e g e n o m e ,a n d c o u l d e f f e c t i v e l y s o l v e t h e p r o b l e m o f r e f e r e n c e g e n o m e c o v e r i n gl i m i t e d g e n e t i c i n f o r m a t i o n .T h a n k s t o t h e f a s t p a c e a t w h i c h s e q u e n c i n g t e c h n o l o g i e s p r o g r e s s ,p a n -ge n o m e h a v e b e e n d e v e l -o p e d r a p i d l y i n r e c e n t y e a r s .H e r e ,t h e d e v e l o p m e n t h i s t o r y a n d c o n s t r u c t i o n s t r a t e g i e s of p a n -g e n o m e w e r e r e v i e w e d ,a s w e l l a s th e s t u d y o f li v e s t o c k a n d p o u l t r y.F u r t h e r m o r e ,t h e f u t u r e a p p l i c a t i o n t r e n d w a s p r o p e c t e d ,i n o r d e r t o p r o v i d e r e f e r e n c e f o r f u r t h e r s t u d y o f p a n -ge n o m e i n l i v e s t o c k a n d p o u l t r y.K e y wo r d s :l i v e s t o c k a n d p o u l t r y ;p a n -g e n o m e ;c o r e g e n e s ;v a r i a b l e g e n e s ;s t r u c t u r a l v a r i a t i o n *C o r r e s p o n d i n g au t h o r :Y U T a i y o n g ,E -m a i l :y u t a i y o n g 310@n w s u a f .e d u .c n 自1990年 人类基因组计划 (H u m a n G e n o m eP r o je c t )[1]提出以来,基因组学得到了迅速发展,为生命科学的多个领域提供了重要的研究基础㊂随着越来越多物种的基因组被测序和组装,研究人员发现,同一物种的不同个体间基因组信息具有较大差异,单一参考基因组并不能完整涵盖其所有的遗传信息,这可能会阻碍物种基因组变异的精准鉴定㊂2005年,T e t t e l i n 等[2]首次提出了泛基因组的概念,开启了泛基因组学研究的新时代㊂随后,泛基因组学逐渐应用于细菌㊁真菌及动植物等研究领域㊂本文对泛基因组学的发展历程㊁构建策略及其在畜禽上的研究现状进行综述,以期为畜禽泛基因组的深畜 牧 兽 医 学 报54卷入研究提供参考㊂1 泛基因组的概念和发展1.1 泛基因组的概念2005年,T e t t e l i n 等[2]在研究无乳链球菌菌株的基因组时,首次提出了微生物泛基因组(或超基因组s u p r a ge n o m e s )的概念[3-4]㊂在这项研究中,他们发现不同菌株之间的基因组存在明显差异,平均每检测1个新的菌株会出现33个新基因,这表明单一菌株的遗传信息并不能完全代表该菌种的所有遗传信息㊂泛基因组是指一个生物进化支(如物种)的全部个体基因序列的集合,它不但能够更为全面的涵盖物种的遗传信息,同时为物种多样性和进化适应性的研究提供了新的视野[5]㊂泛基因组在不同类型的物种中定义有所不同㊂在原核生物的研究中,由于细菌等原核生物的D N A 序列大多具有功能,且基因序列中几乎不含内含子,因此,在原核生物的研究领域,泛基因组通常代表着该物种的基因序列而非全部的基因组(g e n o m e )序列㊂真核生物的基因组是由编码蛋白的序列(外显子)㊁基因间区和内含子等非编码序列组成㊂因此,真核生物的泛基因组定义的一般是物种所有的D N A 序列总集合[6-7]㊂泛基因组由核心基因组和可变基因组组成(图1)㊂核心基因组是同一物种的所有个体中都存在的基因集合或序列,对生命活动和表型性状至关重要;可变基因组则只存在于一个或多个个体中,这些基因序列并不在所有个体中出现[8-10],一般与通讯㊁毒性和防御反应有关[11-14]㊂可变基因组又可细分为单一个体的特有基因和两个或两个以上个体中的附属基因[8-9]㊂在另一种分类方法中,可变基因组又可分为壳基因组(s h e l l ,占全部个体基因组的5%~95%)和云基因组(c l o u d,仅存在约少于5%的个体基因组中)[15]㊂在动植物的研究领域,可变基因与物种在特定环境的适应性或特有的生物学特征有关,如抗寒性[16]和抗病性[17]等㊂泛序列(pa n -s e -qu e n c e )也被用来描述存在于其他个体基因组但不存在于参考基因组中的序列㊂概括地说,核心基因组可以反映物种的遗传稳定性及本质,而可变基因组与个体适应环境的特征相关[18-19]㊂图1 泛基因组的概念F i g .1 T h e c o n c e p t o f p a n -ge n o m e 1.2 泛基因组的发展D N A 测序技术在测序速度和准确性等方面的进步,推动了泛基因组学的迅速发展[20-22]㊂2005年,T e t t e l i n 等[2]在细菌上首次引入 泛基因组 的概念㊂研究人员发现,细菌中广泛存在基因损失和基因水平转移[23],在不同菌株之间会发现新的可变基因㊂R e a d 等[24]对遍布全球海洋的真核生物赫氏圆石藻进行基因组学研究,发现其基因组之间具有差异性,这为泛基因组在真核生物领域的发展提供了参考㊂2007年,M o r ga n t e 等[25]首次在植物上引入69539期李珂等:畜禽泛基因组研究进展泛基因组的概念,发现可变基因中的转座子具有重要的作用㊂2010年,L i等[26]和G o o d w i n等[27]利用第二代测序技术构建了人类的首个泛基因组,该研究结果补充了人类基因组序列并首次发现了主要存在于亚洲人群内特有的基因序列㊂2013年,泛基因组学研究开始较为广泛地应用于动植物研究领域[28-29]㊂2014年,研究人员成功构建了首个大豆的泛基因组,突破了大豆单一参考基因组研究的局限性,开启了植物泛基因组研究历程[30]㊂2019年, C h e n等[31]提出园艺植物基因组计划,构建了多个园艺植物的泛基因组,为未来园艺植物基因组遗传变异信息的破译提供了重要参考㊂然而,由于测序技术的局限性,使用第二代全基因组测序技术得到的短序列组装基因组仍然非常困难,这主要是由于基因组组装需要大量的计算资源,不能很好地扩展到数十到数百个连续的基因组㊂随着测序技术的成熟和测序成本的降低,光学图谱[32]㊁遗传图谱[33]和染色体构象捕获技术(H i-C)[34-35]等得到了迅速的发展,增加了从千碱基大小的c o n t i g s到全染色体的序列连续性㊂近年来,泛基因组学的研究方法引入了第三代测序技术,不但提高了泛基因组的质量,同时缩短了泛基因组构建的时间㊂2020年,S o n g等[36]利用三代测序技术构建油菜泛基因组,为系统挖掘和揭示油菜的复杂遗传变异提供了数据基础㊂随着多个物种高质量泛基因组的陆续发表,如蝙蝠[37]㊁狗尾草[38]㊁贻贝[39]㊁水稻[40]㊁草莓[41]㊁棉花[42-44]㊁马铃薯[45-46]㊁蚕[47]等,利用泛基因组学解析物种的复杂遗传变异逐渐成为了基因组研究领域的热点㊂2泛基因组的组装策略泛基因组的构建策略主要分为迭代组装泛基因组㊁从头组装泛基因组以及图形泛基因组这三种方式[48-49](图2)㊂迭代组装使用 m a p-t o-p a n 策略,用大规模的重测序数据构建泛基因组;从头组装泛基因组使用 a s s e m b l e-t o-p a n 策略,对较少数量的个体进行高深度测序构建泛基因组;图形泛基因组是在从头组装泛基因组基础上,通过构建数学和计算机中被称为图(g r a p h)的数据结构来展示一个物种所有的基因序列排列和结构,突破了传统线性基因组的存储形式,具有重要的理论意义和应用价值㊂2.1迭代组装泛基因组(i t e r a t i v e a s s e m b l y)迭代组装泛基因组(i t e r a t i v e a s s e m b l y o r m a p-t o-p a n)的方法是通过对大量个体进行全基因组重测序,在从头组装单个基因组后再映射到参考基因组,将所有未比对上的新序列集与参考基因组合并,构建泛基因组参考序列[50-52]㊂2018年,W a n g等[53]对3010份水稻测序运用 m a p-t o-p a n 策略,从重测序个体中组装出268M b的非冗余序列,补充到日本晴水稻参考基因组,为后续遗传变异检测和功能分析提供了数据支撑㊂2019年,研究人员对493份向日葵重测序数据进行分析,通过构建向日葵泛基因组,分析了基因渗入对向日葵疾病抗性的影响[54]㊂2020年,A l o n g e等[55]利用迭代组装方式构建了100个番茄的P a n S V基因组,发现s b1l o c i对于解决Q T L背后的复杂单体型至关重要,为培育具有高产㊁优质㊁抗病虫害等优良性状的番茄新品种奠定了坚实的基础㊂然而,迭代组装泛基因组也存在着一定的问题㊂由于泛序列补充到参考基因组上顺序具有不确定性,不但会导致无法真实反映新基因在泛参考基因组上的位置信息,在进行多拷贝基因的研究中也容易降低检测效率㊂同时,在一些具有高度重复性和S V s普遍存在的作物基因组中,易出现组装错误[56]㊂2.2从头组装泛基因组(d e n o v o a s s e m b l y)从头组装并注释个体基因组,通过个体基因组间的相互比较鉴定出核心与可变基因,去除冗余序列后构建泛基因组的方式被称为从头组装泛基因组,多用S O A P d e n o v o[57]软件进行组装,是运用较为广泛的方法,如人类[26]㊁玉米[58]㊁大豆[30]㊁大麦[59]和小麦[60]的泛基因组都是基于这种方法组装的㊂其中,大豆的泛基因组研究发现,组装大豆野生近缘种G l y c i n e s o j a能够覆盖94%的栽培大豆G l y c i n e m a x基因,鉴定出338个存在/缺失变异(p r e s e n c e/a b s e n c e v a r i a t i o n,P A V)㊁1978个拷贝数变异(c o p y n u m b e r v a r i a t i o n s,C N V)和一系列位于高度差异基因区域的单核苷酸多态性(s i n g l e n u-c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s,S N P)和小于50b p的片段插入或缺失片段(I N D E L s)㊂基于大豆泛基因组检测到的基因组变异信息有着重要的育种和生产价值,为大豆的研究提供了重要的数据基础㊂在动物泛基因组的研究上,长颈鹿[61]㊁果蝇[62]和熊蜂[63]等是从头组装泛基因组的经典之作,为解析物种的遗传差异和进化关系提供了重要的参考价值㊂从头组装泛基因组可以提供所有个体的基因组信息㊁基因和其他基因组的物理位置,能够高效识别重复区域7953畜 牧 兽 医 学 报54卷和拷贝数变异㊂然而,由于组装基因组需要大量的测序数据和计算资源,相对来说成本较高[64]㊂2.3 构建图形泛基因组(g r a ph -b a s e d g e n o m e /v a r i a -t i o n g r a g h ) 图形泛基因组最早用于微生物泛基因组的构建,近年来在动植物基因组中逐渐崭露头角[65]㊂图形基因组是一种较为理想的构建策略[66],基于从头组装基因组后将不同个体的基因组比对到线性参考基因组后提取变异信息㊂变异信息去冗余后与线性基因组整合通过多条路径的方式来展示各种变异㊂这种方法不但能够保留变异序列在染色体上的位置信息,还可以较为完整的展现物种基因组的多样性㊂V g [67]㊁M i n i g r a ph [68]㊁C a c t u s [69]等软件是近年来研究人员开发的用于图形基因组构建的工具,能够帮助学者更好㊁更直观地理解基因组的结构变异信息㊂2020年发表的大豆泛基因组,是构建的首个作物高质量图形泛基因组㊂研究人员使用第三代测序数据从头组装了26个大豆的基因组,平均c o n t i g N50达到了22.6M b [70]㊂此研究挖掘到了大量利用单个参考基因组不能鉴定到的基因变异,为解析大豆种皮的亮度㊁颜色变化等重要农艺性状的调控机制奠定了基础㊂2021年Q i n 等[40]首次构建了水稻图形泛基因组,促进了水稻功能基因组学的研究,为深度挖掘水稻基因组变异和培育突破性的水稻新品种提供了重要依据㊂萝卜[71]㊁白菜[72]㊁番茄[73]㊁鹰嘴豆[74]㊁棉花[43]㊁马铃薯[46]等多个物种的泛基因组图谱相继被研究人员构建,为基因组功能研究和分子育种提供了重要的数据支撑㊂图2 泛基因组的组装策略F i g .2 S c h e m a t i c o f t h e p a n -g e n o m e a s s e m b l y a p pr o a c h e s 3 畜禽泛基因组学研究泛基因组近年来已广泛应用于微生物㊁植物及动物研究中,在探究物种起源驯化以及改良遗传育种体系等方面展现出巨大潜力㊂以下总结了泛基因组在畜禽领域中的最新研究成果㊂3.1 泛基因组在猪上的研究猪是农业上重要的家畜,也是生物研究和应用的重要医学模型㊂随着基因组测序组装技术的不断革新,猪的基因组被不断完善㊂目前,猪的参考基因组是2017年公布的基于第三代测序技术组装的杜洛克猪基因组(S s c r o f a 11.1),c o n t i g N50达到了48.23M b,与人和其他模式动物基因组组装质量不相上下㊂然而,由于猪的起源驯化及其群体间表型和基因型的巨大差异[75-76],使用杜洛克猪参考基因组对世界范围内不同猪种进行遗传变异的研究具有很大的局限性㊂2017年,四川农业大学L i 等[77]使用10只来自欧亚大陆的猪的基因组构建了猪的泛基因组,挖掘到了大量新的猪基因组变异信息㊂研究发现了猪参考基因组中不存在的137.02M b 的缺失片段,弥补了单一参考基因组涵盖遗传信息有限的问题,为后续猪的基因组研究提供了新的分析思路及宝贵的遗传资源㊂2020年,西北农林科技大学T i a n 等[78]基于猪参考基因组(S s c r o f a 11.1)和11个世界范围内具有地理和表型代表性的猪种构建了猪泛基因组,研究发现了72.5M b 的非冗余泛序列,其中约9M b 的泛序列在亚洲猪基因组中的频率显著高于欧洲猪㊂89539期李珂等:畜禽泛基因组研究进展转录组分析发现,亚洲猪中特有的T I G3基因可能是亚洲猪脂质代谢过程中的关键基因㊂同时,研究人员通过构建猪泛基因组数据库,将泛基因组和转录组等数据整合,为后续研究提供重要的数据资源㊂2023年,中国农业大学J i a n g等[79]整合了11个猪品种构建了中西方猪的图形泛基因组㊂该研究利用长读长测序在藏猪上鉴定了7568个特异性S V s,通过结合22头藏猪和98头低海拔猪的重测序数据,并与先前的研究结果比较分析得到了12个与高海拔适应性有关的候选基因㊂通过后续试验鉴定出S O D1㊁S E MA5A㊁R E V1㊁S G C D是与高海拔低氧适应性有关的候选基因,为猪遗传育种提供了丰富的基因组变异信息㊂3.2泛基因组在牛上的研究牛作为重要的经济动物在许多国家都有广泛的用途,可以为人类提供牛奶㊁肉类㊁皮革和肥料等㊂来自全世界的研究人员在牛泛基因组的研究领域上做出了杰出贡献,如苏黎世联邦理工学院H u b e r t P a u s c h实验室聚焦牛基因组学研究㊁美国农业部建立了牛泛基因组联盟㊁中国研究人员结合本土黄牛构建牛泛基因组等㊂2020年,苏黎世联邦理工学院C r y s n a n t o和P a u s c h[80]利用v g构建了首个牛的图形泛基因组,显著提高了序列比对和基因分型的准确性㊂随后,该团队结合P a c B i o C L R和P a c B i o H i-F i测序技术,利用m i n i g r a p h将6个高质量牛基因组整合到一个图结构泛基因组框架中,鉴定出70M b的非参考序列并构建了包含新序列及变异位点的牛的图形泛基因组,为后续多物种泛基因组的研究提供了思路和图结构框架[81]㊂西北农林科技大学G o n g等[82]利用12个牛属个体从头组装泛基因组,发现了36.3M b非参考序列,为研究牛的优良遗传性状提供了理论基础;爱丁堡大学T a l e n t i 等[83]利用组装的两头非洲牛染色体水平基因组,并结合294头不同牛品种的重测序数据构建了一个包含全球牛多样性的基因组图并鉴定出116.1M b的非参考序列㊂上述研究完善了现有牛的参考基因组(A R S-U C D1.2)并为进一步挖掘牛的遗传多样性提供了新的变异位点㊂随着第三代长读长测序的迅速发展,越来越多的研究人员聚焦于研究结构变异(s t r u c t u r a l v a r i a-t i o n,S V)对复杂性状的影响㊂2022年,来自瑞士㊁美国的牛泛基因组联盟(B o v i n e P a n g e n o m e C o n-s o r t i u m,B P C)实验室共同构建了基于结构变异的牛泛基因组,并使用不同的测序平台㊁覆盖深度和组装算法对泛基因组构建的潜在影响进行了探究,研究表明,20X覆盖度的P a c B i o H i F i数据可以完成牛单倍型基因组组装,且具有较好的连续性与准确性[84]㊂华中农业大学Z h o u等[85]构建的含57个品种898头牛的泛基因组是目前规模最大的牛泛基因组研究,通过研究S V对基因组功能元件和Q T L的影响,为牛基因组演化提供了深刻理解㊂3.3泛基因组在羊上的研究目前,泛基因组学研究在山羊和绵羊上均有报道㊂2019年,L i等[86]从9个山羊d e n o v o基因组中鉴定出38.3M b山羊参考基因组(A R S1)中缺失的泛序列(占基因组的1.4%),并构建了山羊泛基因组,显著提高了山羊重测序数据的变异检测效率㊂2022年,西北农林科技大学以及新疆农垦科学院研究团队组装了13只绵羊的单倍型基因组,构建了首个图形化的绵羊泛基因组图谱[87]㊂研究人员基于图形化泛基因组的群体结构变异信息与绵羊尾部表型性状进行S V-GWA S关联分析,结果显示, H O X B13基因与绵羊尾长性状高度相关㊂结合P B S选择信号分析,发现S V s和S N P s在基因B MP2㊁HA O1和P D G F D上都受到强烈的选择信号,这为探究绵羊重要经济性状的内在调控机制提供了宝贵资源㊂3.4泛基因组在鸡上的研究鸡是目前世界上数量最多的家养动物,在畜牧业中占有重要地位㊂已有多项研究表明,鸟类的基因数量和进化速度远低于哺乳动物,且对其的驯化和育种会影响鸡的基因组结构[88-89]㊂然而,鸟类基因数量少且进化速率低背后的机制尚未有定论,因而构建泛基因组解析鸡基因组遗传信息是研究鸡重要经济性状的有力手段㊂2021年,河南农业大学和西澳大学构建了首个鸡的泛基因组,发现了鸡参考基因组(G R C g6a)中未被组装的约66.5M b序列[90]㊂通过P A V-GWA S分析鉴定出许多与鸡生长㊁胴体成分㊁肉质或生理特征相关的候选突变㊂研究人员发现,I G F2B P1的33个启动子区域的缺失影响了鸡的体型大小,这有助于未来设计具有特定性状的鸡品种㊂2022年,西北农林科技大学和中国农业大学通过20只鸡的全基因组测序数据构建了鸡的泛基因组,并对新鉴定到的159M b泛序列进行了分析[91]㊂研究发现,泛序列中的新基因大多位于染色体亚端9953畜牧兽医学报54卷粒区和小染色体,具有较多的串联重复序列;非经典的D N A二级结构导致了这些缺失序列难以被捕获,这阻碍了鸡基因组的深入研究㊂同时,研究人员发现新基因的替代率比已知基因高3倍,这项研究结果打破了已有的研究结论,对鸟类比较基因组学和功能基因组学的研究具有重要意义㊂4总结与展望泛基因组学经过多年发展已逐渐成熟,是基因组学研究领域的热点㊂第三代测序技术的落地极大地推动了泛基因组学的快速发展㊂利用泛基因组挖掘关键的遗传变异信息,结合重要表型性状和多组学数据等,是研究生物重要性状的有力工具㊂未来,随着测序技术的进一步发展和算法水平的不断提高,实现结合端粒到端粒的基因组组装(t e l o m e r e-t o-t e l o m e r e,T2T)和精确检测基因组结构变异信息等,对于泛基因组学的发展和应用具有重要意义㊂海量测序数据的不断产生为构建泛基因组数据库提供了数据基础㊂通过整合多个代表性个体的基因组信息,结合多组学数据和群体变异信息为进一步挖掘调控重要性状的基因提供基础,也为功能基因组学的研究提供了便利㊂目前,泛基因组研究由于计算资源等的制约大多集中在 种 水平,但未来 属 水平的超级泛基因组(s u p e r-p a n g 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e,2020,588(7837):277-283.[61] A G A B A M,I S H E N G OMA E,M I L L E R W C,e t a l.G i r a f f e g e n o m e s e q u e n c e r e v e a l s c l u e s t o i t s u n i q u em o r p h o l o g y a n d p h y s i o l o g y[J].N a t C o mm u n,2016,7(1):11519.[62]J I A O W B,S C HN E E B E R G E R K.C h r o m o s o m e-l e v e la s s e mb l i e s o f m u l t i p l e A r a b i d o p s i s g e n o m e s r e v e a lh o t s p o t s o f r e a r r a n g e m e n t s w i t h a l t e r e d e v o l u t i o n a r yd y n a m i c s[J].N a t C o mm u n,2020,11(1):989.[63] S U N C,HU A N G J X,WA N G Y,e t a l.G e n u s-w i d ec h a r a c t e r i z a t i o n o f b u m b l e b e e g e n o m e s p r o v ide si n s i g h t s i n t o t h e i r e v o l u t i o n a n d v a r i a t i o n i n e c o l o g i c a la n db e h a v i o r a l t r a i t s[J].M o l B i o l E v o l,2021,38(2):486-501.[64] D A N I L E V I C Z M F,T A Y F E R N A N D E Z C G,MA R S H J I,e t a l.P l a n t p a n g e n o m i c s:a p p r o a c h e s,20639期李珂等:畜禽泛基因组研究进展a p p l i c a t i o n s a n d a d v a n c e m e n t s[J].C u r r O p i n P l a n tB i o l,2020,54:18-25.[65] T A O Y F,J O R D A N D R,MA C E E S.A g r a p h-b a s e dp a n-g e n o m e g u i d e s b i o l o g i c a l d i s c o v e r y[J].M o lP l a n t,2020,13(9):1247-1249.[66] B A Y E R P E,G O L I C Z A A,S C H E B E N A,e t a l.P l a n t p a n-g e n o m e s a r e t h e n e w r e f e r e n c e[J].N a tP l a n t s,2020,6(8):914-920.[67] G A R R I S O N E,S I RÉN J,N O V A K A M,e t a l.V a r i a t i o n g r a p h t o o l k i t i m p r o v e s r e a d m a p p i n g b yr e p r e s e n t i n g g e n e t i c v a r i a t i o n i n t h e r e f e r e n c e[J].N a tB i o t e c h n o l,2018,36(9):875-879.[68] L I H,F E N G X W,C HU C.T h e d e s i g n a n dc o n s t r u c t i o n o f r e f e r e n c e p a n g e n o m e g r a p h s w i t hm i n i g r a p h[J].G e n o m e B i o l,2020,21(1):265.[69] P A T E N B,E A R L D,N G U Y E N N,e t a l.C a c t u s:A l g o r i t h m s f o r g e n o m e m u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t[J].G e n o m e R e s,2011,21(9):1512-1528.[70] L I U Y,D U H L,L I P C,e t a l.P a n-g e n o m e o f w i l da n d c u l t i v a t e d s o yb e a n s[J].C e l l,2020,182(1):162-176.e13.[71] Z HA N G X H,L I U T J,WA N G J L,e t a l.P a n-g e n o m e o f R a p h a n u s h i g h l i g h t s g e n e t i c v a r i a t i o n a n di n t r o g r e s s i o n a m o n g d o m e s t i c a t e d,w i l d,a n d w e e d yr a d i s h e s[J].M o l P l a n t,2021,14(12):2032-2055.[72] C A I X,C HA N G L C,Z HA N G T T,e t a l.I m p a c t s o fa l l o p o l y p l o i d i z a t i o n a n d s t r u c t u r a l v a r i a t i o n o ni n t r a s p e c i f i c d i v e r s i f i c a t i o n i n B r a s s i c a r a p a[J].G e n o m e B i o l,2021,22(1):166.[73] Z HO U Y,Z HA N G Z Y,B A O Z G,e t a l.G r a p hp a n g e n o m e c a p t u r e s m i s s i n g h e r i t a b i l i t y a n de m p o w e r s t o m a t o b r e e d i n g[J].N a t u r 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s,2017,27(5):865-874. [78] T I A N X M,L I R,F U W W,e t a l.B u i l d i n g a s e q u e n c em a p o f t h e p i g p a n-g e n o m e f r o m m u l t i p l e d e n o v oa s s e mb l i e s a n d H i-C d a t a[J].Sc i C h i n a L i f e S c i,2020,63(5):750-763.[79]J I A N G Y F,WA N G S,WA N G C L,e t a l.P a n g e n o m eo b t a i n e d b y l o n g-r e a d s e q u e n c i n g o f11g e n o m e sr e v e a l h i d d e n f u n c t i o n a l s t r u c t u r a l v a r i a n t s i n p i g s[J].i S c i e n c e,2023,26(3):106119.[80] C R Y S N A N T O D,P A U S C H H.B o v i n e b r e e d-s p e c i f i ca u g m e n t e d r e f e r e n c e g r a p h s f a c i l i t a t e a c c u r a t es e q u e n c e r e a d m a p p i n g a n d u n b i a s e d v a r i a n t d i s c o v e r y[J].G e n o m e B i o l,2020,21(1):184.[81] C R Y S N A N T O D,L E O N A R D A S,F A N G Z H,e ta l.N o v e l f u n c t i o n a l s e q u e n c e s u n c o v e r e d t h r o u g h ab o v i n e m u l t i a s s e m b l y g r a p h[J].P r oc N a t l A c ad S c iU S A,2021,118(20):e2101056118.[82] G O N G M,Y A N G P,F A N G W W,e t a l.B u i l d i n g ac a t t l e p a n-g e n o m e u s i n g m o r ede n o v o a s s e m b l i e s[J].J G e n e t G e n o m i c s,2022,49(9):906-908.[83] T A L E N T I A,P OW E L L J,H E MM I N K J D,e t a l.Ac a t t l e g r a p h g e n o m e i n c o r p o r a t i n g g l o b a l b r e e dd i ve r s i t y[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):910.[84] L E O N A R D A S,C R Y S N A N T O D,F A N G Z H,e ta l.S t r u c t u r a l v a r i a n t-b a s e d p a n g e n o m ec o n s t r u c t i o nh a s l o w s e n s i t i v i t y t o v a r i a b i l i t y o f h a p l o t y p e-r e s o l v e db o v i n e a s s e m b l i e s[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):3012.[85] Z HO U Y,Y A N G L,HA N X T,e t a l.A s s e m b l y o f ap a n g e n o m e f o r g l o b a l c a t t l e r e v e a l s m i s s i n g s e q u e n c e sa n d n o v e l s t r u c t u r a l v a r i a t i o n s,p r o v i d i n g n e w i n s i g h t si n t o t h e i r d i v e r s i t y a n d e v o l u t i o n a r y h i s t o r y[J].G e n o m e R e s,2022,32(8):1585-1601.[86] L I R,F U W W,S U R,e t a l.T o w a r d s t h e c o m p l e t eg o a t p a n-g e n o m e b y r e c o v e r i n g m i s s i n g g e n o m i cs e g m e n t s f r o m t h e r e f e r e n c e g e n o m e[J].F r o n tG e n e t,2019,10:1169.[87] L I R,G O N G M,Z HA N G X M,e t a l.T h e f i r s t s h e e pg r a p h p a n-g e n o m e r e v e a l s t h e s p e c t r u m o f s t r u c t u r a lv a r i a t i o n s a n d t h e i r e f f e c t s o n d i f f e r e n t t a i lp h e n o t y p e s[J/O L].b i o R x i v,2021,d o i:10.1101/2021.12.22.472709.[88] Z HA N G G J,L I C,L I Q Y,e t a l.C o m p a r a t i v eg e n o m i c s r e v e a l s i n s i g h t s i n t o a v i a n g e n o m e e v o l u t i o na n d a d a p t a t i o n[J].S c i e n c e,2014,346(6215):1311-1320.3063。