青蛙和雏鸡透明骨骼标本的制作
透明骨骼标本因其清晰美观，立体感非常强，骨骼的原位观察效果非常好，可显现一般解剖方法难以观察清楚的结构，可广泛用于生物教学中。本实验采用茜素红对小型脊椎动物青蛙、雏鸡硬骨染色［1］，在经甘油透明，使青蛙和雏鸡全部骨骼在不受任何损伤的情况下清楚的展示出来，并通过对透明骨骼标本制作工艺的改进，使制作时间缩短，标本质量得到改善。现将有关情况报告如下：
1. 材料和方法
1.1 实验材料
透明骨骼标本材料要求为活体或刚死不久的动物［2］，体型要完整而小，这样其体壁就相对薄，染色透明效果就好。另外，动物的体色要较纯白的，减少体色对透明的影响［3］。为达到
这些要求本实验选用青蛙以及刚孵化不久的雏鸡为实验材料。
1.2 制作方法
1.2.1 材料前处理
1.2.1.1 剥皮：雏鸡去毛和皮，青蛙去皮。目的就是提高药物对材料的透性效果。注意不要伤及骨骼和肌肉，以免影响观察效果。
1.2.1.2 去内脏：在雏鸡和青蛙的肛门口向上开一小口，用镊子取出内脏，要取干净，增强透明度［4］。同时要注意体形
的完整，最后分别放用清水慢慢冲洗干净。
1.2.2 固定
用95%的乙醇固定，使材料硬化以及起到脱脂的作用。具体过程如下：把处理好的标本绑在厚约0.5 cm 的玻璃板上，整理好姿势浸在95%乙醇中。时间要根据动物的体形大小，一般4〜6 天，其中可更换1〜2次新液。固定后的材料用清水缓慢冲洗一天或浸在水中一天，去除残留的乙醇。
1.2.3 透明
用1%K0透明，此步骤的目的是使动物肌肉呈半透明状，另外KOH还起到脱脂的作用，从而可隐约看到里面的骨骼。具体过程是：将固定好的标本浸入1%K0溶液中，在透明过程中要注意观察，浸制的时间不要太长，否则会因为肌肉腐蚀过度导致骨骼离散，所以只要隐约看见软组织下的骨骼就停止。一般透明时间是2〜4 天，但要注意随时观察。特别是在夏天，温度高，透明时间要特别注意。
1.2.4 茜素乙醇染色液染色把标本再放入茜素红乙醇染色液中进行骨骼染色。茜素红乙醇染色液配方是：先将茜素红染料溶于95% 的乙醇中制成饱和溶液，然后用一份配好的此饱和溶液和九份70%的乙醇混合配制
成适于骨骼染色的染色剂。标本浸制在染色液中的时间是12〜36 小时，但还得按实验效果为标准即骨骼染上橙黄色为止。
1.2.5 褪色
用梯度脱色液进行褪色，梯度酒精为（25%，50%，100%），
约24h 换液1 次，至肌肉变成白色透明的。
1.2.6 进一步透明
把标本放入氢氧化氨甘油中（75 mL水中加入20 mL甘油和5 mL 氢氧化氨）进行漂白透明。再将标本放入25%甘油中浸16天左右，使标本更加透明，再放入50%甘油中浸2~4 天，脱水，直到标本肌肉完全透明为止。其目的是使软组织所染上的色素逐渐脱色，直到清晰地看到骨化点和组织呈现紫红色为止。
1.2.7 保存
把再次透明的标本调整好姿态，使其趋于美观，放入大小适宜的标本瓶中，用100%甘油浸泡，即最后使用的100%甘油浸泡时间越长其透明度越好。加入少许麝香酚防霉，加入少量的5% 的福尔马林防腐液。瓶口用防水不干胶密封。
2. 实验结果
3. 分析讨论
3.1 此次实验我们是在不断改进中进行的，就是说实验中因个别环节的失误导致实验效果不佳甚至失败重做。如一开始我们用小鲤鱼作为材料制作透明骨骼标本时，到染色阶段，在染色剂的制备过程中，用水制成茜素红饱和溶液，没有用95%乙醇制成茜素红饱和溶液，导致染色液太浓，最后经染色的标本在褪色过程中，其肌肉的颜色很难褪去。
3.2 在制作鱼透明骨骼标本时，一开始买的是冻制品，并不十分新鲜，其中的一些鱼骨已经移位，而且皮肤肌肉已经萎缩，在透明阶段发现体表出现黄斑。
4. 体会
4.1 在做实验过程中，透明过程有时在组织内出现气泡，在标本开
始放入甘油时，也常有大小不一的气泡，影响观察效果，可用注射器插入吸取或用细针刺破气泡来消除。
4.2 在一开始进行活体前处理时，如剥皮、去内脏。在此过程中不
要伤其骨骼，特别是软骨组织。另外要去尽内脏，尽量不要残留色素，如鱼体腔内的黑膜，这样可增加标本的透明度。
4.3 在保存过程中应尽量避免阳光直射，否则影响保存液的清晰，
进而影响标本透明度。
