15 指导原则解读系列专题 合成多肽药物结构确证和质量研究_王鹏

生物样品定量分析方法验证指导原则（草案）11. 范围2准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和3制剂研发非常重要。

这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动4学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。

因此，必须完整地验证和5记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。

6本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实7际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。

8生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。

9应该在相应的生物样品分析中遵守GLP原则或GCP原则。

102.生物分析方法验证112.1 分析方法的完整验证12分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析13物浓度的可靠性。

此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。

一般应对每14个物种和每种基质进行完整验证。

当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质15替代，但要说明理由。

16一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范17围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液18中储存和处理全过程中的稳定性。

19有时可能需要测定多个分析物。

这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一20个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。

在这些情况下，验证和21分析的原则适用于所有涉及的分析物。

22对照标准物质23在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质24中。

此外，色谱方法通常使用适当的内标。

25应该从可追溯的来源获得对照标准物质。

应该科学论证对照标准物质的适用26性。

分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。

27对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质28不产生干扰。

29当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内30标。

合成多肽药物中三氟乙酸检测方法研发表时间：2018-11-23T11:56:21.727Z 来源：《药物与人》2018年8月作者：张莲莲杜开峰[导读] 三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）。

摘要：三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC）与高效液相色谱法（HPLC）。

本文分别对 IC 及 HPLC 法进行研究：结果表明 IC 法 TFA 定量限为 2.4ng，推算检出限为 0.8ng，且在 0.12088μg/mL～6.044μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9999）；HPLC 法定量限为 6ng，检出限为 1.5ng，且在 0.3023μg/mL～15.115μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9998），加标回收率为 99.3%～101.7%，精密度（n=6）为 0.192%～0.200%，RSD5=1.4%。

结论：IC 法与 HPLC 法相比，在灵敏度，线性及重复性等方面差异不大，均能满足准确检测相关多肽样品中 TFA 含量要求，但 HPLC 法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。

关键词：离子色谱法，高效液相色谱法，多肽，三氟乙酸，含量检测中图分类号：文献标识码：A Abstract：Trifluoroacetic acid (TFA) is an important control item of polypeptide drugs. Ion chromatography (IC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are commonly used in the detection of TFA. In this paper, IC and HPLC methods are studied respectively.The results showed that the quantitative limit of TFA by IC method was 2.4 ng, the detection limit was 0.8 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.12088 ug/mL to 6.044 ug/mL (r=0.9999);the quantitative limit of HPLC was 6 ng, the detection limit was 1.5 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.3023 ug/mL to 15.115 ug/mL (r = 0.9998). The recovery was 99.3% ~ 101.7%, the precision (n = 6) was 0.192% ~ 0.200%, RSD5 = 1.4%.CONCLUSION: Compared with HPLC, IC method has little difference in sensitivity, linearity and repeatability, and can meet the requirement of accurate determination of TFA content in related polypeptide samples. However, HPLC method has a wider application range and can simultaneously detect the contents of HAC and TFA in polypeptide drugs.The HPLC method is simple, accurate, sensitive, low cost and efficient. Key words：Ion chromatography ;HPLC; Peptide ;Trifluoroacetic acid; Content determination 1 前言三氟乙酸（TFA）普遍用于合成多肽的工艺中作为切割剂及脱保护剂，临床使用存在毒性。

单晶X-衍射（XRSD）：药物中以结晶形式存在的 结晶水或溶剂的信息，包括结晶水或溶剂的种类、 数量、存在方式等信息。
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其他具有特殊结构药物的结构确证
对于结构中含有金属离子以及P、F等元素的药物， 进行相应金属原子吸收测定以及F、P等元素的测定 结果，对其结构确证有重要意义。
1.固态药物：压片法、糊状法、薄膜法。液态 药物液膜法测试，气态药物采用气体池测定。
2. 多晶型药物在研磨和压片过程中，其晶型也 可能发生变化，此时可改用糊法测定。盐酸盐药物 在采用KBr压片时可能会发生离子交换现象。
2020/12/10
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一般药物的结构确证
核磁共振（NMR）：某些元素在分子中的类型、数 目、相互连接方式、周围化学环境、甚至空间排列 等信息，进而推测出化合物相应官能团的连接状况 及其初步的结构。常用的有氢核磁共振谱（1HNMR）和碳核磁共振谱（13C-NMR）等。 溶剂峰或部分溶剂中的溶剂化水峰可能会对药物 部分信号有干扰作用，因此选择适宜的溶剂或采用 适宜的方法，以使药物所有信号得到充分显示，对 药物结构解析有重要意义。
2020/12/10
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药物结晶水或结晶溶剂的分析
干燥失重：药物在规定的条件下干燥至恒重，计算 减失的重量以获得结晶水或溶剂、吸附水或溶剂在 测试药物中的比例，有时可采用不同的干燥条件获 得以吸附形式或结晶形式存在的水或溶剂在样品中 量的信息。
水分测定：样品中所有水（以吸附或结晶形式存在） 量的信息，但不能得到非水溶剂量的信息。
热重分析：药物在程序升温条件下物质质量 （或重量）随温度变化即可获得药物的吸附 水／溶剂、结晶水/溶剂及初步的分解温度等 信息，结合差热分析的信息，还可判断测试 药物在熔融时是否分解。

一种多肽固相合成方法与纯化策略研究如下：
多肽与小分子化学药物相比，具有生物活性高，特异性强，不容易产生耐药性等特点，是目前新型药物研发的重点领域。

多肽的合成直接影响到多肽药物的作用机制以及药物效果，因此需要建立一种更加便捷，高效的多肽合成方法。

方法：采用Fmoc固相合成法合成多肽HF01，通过比较氨基酸连接的反应体系以及氨基酸脱保护的反应条件，确定最佳的合成条件。

采用液相色谱串联质谱对合成的多肽进行纯度及序列分析，确定多肽的纯度和分子量。