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基因克隆是指在体外将外源基因插入载体，并引入细胞进行扩增，即进行基因的无性繁殖过程。
基因克隆是基因工程的目标之一。
其中基因的体外重组是基因克隆的中心环节。
这节课我们主要学习如何进行基因的体外重组。
基因克隆的第一步是获得目的基因，即获得insert, 外源插入DNA片段。
获得目的基因有四种途径，分别是从基因组获得目的基因、从基因文库或cDNA文库获得目的基因、通过PCR获得目的基因以及通过人工合成获得目的基因。
获得的目的基因片段根据它们的来源，（图1）有的是黏性末端，有的是平齐末端，它们与载体的连接可采用不同的策略，如直接与载体连接，或采取其他不同的连接方式。
图 1 克隆策略概述若获得的目的基因片段具有黏性末端，可选用与其具有同样黏性末端的载体，通过DNA连接酶直接相连。
（图2 A）例如外源DNA插入片段具有EcoRI酶切位点，可选用多克隆位点上具有Eco RI酶切位点的载体如pUC18。
插入片段和载体用Eco RI酶切后，可直接将外源DNA插入到载体的lac z基因内。
（图2 B）对于左右两侧引物各含酶切位点的PCR产物的体外重组，可选用与之相同酶切位点的载体分子直接相连。
（图2 C）在构建基因组文库时，通常对基因组DNA采用Sau3AI作部分消化，选用具有常见的Bam HI切点的载体，由于Sau3AI和Bam HI为同尾酶，即酶的来源不同，识别位点不同，但可产生同样的黏性末端。
二者消化DNA后可直接相连。
图 2 A.使用pUC18载体直接克隆；B.PCR产物直接克隆；C.将Sau3A片段导入BamHⅠ位点对于平齐末端的DNA插入片段，（图3）可给其两端加上linker, 即衔接物。
衔接物一般为10bp长，通过DNA合成仪直接合成。
中间6bp为一酶切位点，两端2bp为保护性碱基。
衔接物通过DNA连接酶与插入片段连接后，再用相应的酶切，形成黏性末端。
图 3 Linker的使用（图4）也可直接给平齐末端的DNA插入片段连上adaptor, 即接头分子，使其直接具备某一限制性内切酶的黏性末端。
