分子生物学试验讲义

分子生物学实验讲义 Experimental Direction of Molecular Biology

昆明医学院基础学院 生物化学教研室 Department of Biochemistry Faculty of Basic Medical Sciences, Kunming Medical College

2007年3月 实验一 质粒DNA的提取与限制酶切鉴定 Isolation of Plasmid DNA and Identification by Restriction Digestion

一、 目的(Objectives) 掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。 二、 原理(Principles)) 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。其分子量大小在1－200kb之间。是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。

所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate, SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。

共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）质粒以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。

限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。如：EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是：

EcoRⅠ：G↓AATTC HindⅢ：A↓AGCTT 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。

三、 主要设备、实验材料和试剂（Equipments, Materials and Agents） 1．主要设备(Equipments) （1）塑料离心管1.5mL×30 （2）塑料离心管架×1 （3）微量加样器10μL、100μL、1 000μL各一支 （4）常用玻璃仪器及滴管等 （5）台式高速离心机（16 000r/min） （6）电泳仪 （7）电泳槽 （8）样品槽模板 2．材料(Materials)：质粒转化大肠杆菌 3．试剂(Agents) （1）溶液Ⅰ：pH8.0 G.E.T 缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl）；用前加溶菌酶4mg/mL。

（2）溶液Ⅱ:1mol/L NaOH 40μl , 5%SDS 40μl ,蒸馏水120μl，临用时配制。 （3）溶液Ⅲ：pH 4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰乙酸，28.5mL H2O） （4）苯酚/氯仿（1∶1，V/V）：苯酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇（24∶1，V/V）。

（5）pH 8.0 TE缓冲液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶（RNase）20μg/mL。

（6）TAE电泳缓冲液： （7）DNA 染色试剂Sybr Green 或EB染色液： （8）10X上样缓冲液 （9）DNA分子量标准物（DNA Marker） 四、操作步骤(Methods) 1．培养细菌(cultivation of bacteria) 将带有质粒的大肠杆菌于培养液中过夜培养 2．细菌中质粒DNA的快速提起（Rapid Isolation of Plasmid DNA From Bacteria） （1）取液体培养菌液1.5 mL置小离心管中，10 000r/min离心1min去掉上清液。加入150μL 的溶液Ⅰ，充分混悬细菌，在室温下放置10min。

（2）加入200μL新配置的溶液Ⅱ。加盖，颠倒5次使之混匀。冰上放置5 min。 （3）加150μL冷却的溶液Ⅲ，加盖后颠倒5混匀，冰上放置15 min。10 000r/min离心5 min，上清液倒入另一离心管中。

（4）向上清液中加入等体积苯酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min离心2 min，将上清液转移至新的离心管中。

（5）向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

（6）加1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，晾干，加入20μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解，待用。

3． 质粒DNA的限制酶切(Restriction Digestion of Plasmid DNA) 取洁净消毒1.5ml离心管1支，分别加入下列成分： 自提样品质粒：10μL 10×酶切缓冲液：2μL 限制性内切酶：2～4 u 加双蒸水至总体积20μL，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解1h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。

4．DNA琼脂糖凝胶电泳( Agarose Gel Electrophoresis of DNA) （1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.4g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TAE缓冲液，置微波炉加热全部融化后，取出摇匀，此为0.8%的琼脂糖凝胶。

（2）琼脂糖凝胶板的制备：将胶模两端用胶带封闭，水平放置，插入上样梳。待琼脂糖凝胶液将冷却至65℃左右时，小心倒入胶模中，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置20 min，待凝固完全后，轻轻拔出上样梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。

（3）取3支1.5ml离心管，分别加入DNA marker 10μL、全部酶切DNA、未酶切的质粒DNA5μL，再向各管中加入上样缓冲液2μL，Sybr Green 2μL，混匀。

（4）加样：用微量加样器将上述3种样品分别加入凝胶样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。

(5)电泳 加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50 mA。当指示剂色带移动至距离胶板1～2cm处，停止电泳。

(6) 将电泳后的胶板在紫外检测仪下观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。 五、结果观察(Observation of results) 在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出绿色的荧光条带。

六、思考题(Questions) 1．细菌染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？ 实验二 PCR技术及应用 PCR Technique and Its Applications

一、 目的(Objective) 掌握PCR基本原理和方法；熟悉PCR技术的应用。 二、原理(Principles) 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由模板高温变性、引物与模板退火和引物链沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为 93℃-94℃）使其变性为单链；人工合成的两个寡核苷酸引物（单链DNA）在其合适的复性温度下分别与待扩增模板DNA的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，按5’→3’方向延伸，合成与DNA模板互补的新链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在50～100μL反应体积中，对皮克（pg）级含量的目的基因扩增得到微克级（μg）的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

三、 主要设备、实验材料和试剂（Equipments, Materials and Agents） 1．主要设备(Equipments) （1）PCR仪 （2）台式高速离心机（16 000r/min） （3）微量加样器10μL、100μL、1 000μL各一支 （4）电泳仪、电泳槽 2．材料(Materials)