冰片对HaCaT细胞膜流动性及膜电位的影响

・６２・　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ＪｏｕｒｎａＩ　ｏｆ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｎ　ＴＯＭ　Ａｏｒ．２０１５　ＶｏＩ．２２　Ｎｏ．４　冰片对ＨａＣａＴ细胞膜流动性及膜电位的影响　傅大莉’，雍小兰１，刘德芳’，肖爽　１．解放军成都军区总医院，四川成都６１００８３；２．四川省人民医院，四川成都６１００７２　摘要：目的研究冰片对皮肤活性表皮作用方式，探究冰片作为经皮促透剂的促透作用机制。方法选择　常用经典化学经皮促透剂氮酮作为阳性对照促透荆，采用ＣＣＫ一８试剂盒测定并计算冰片对ＨａＣａＴ细胞的半数抑　制率（ＩＣ　。），利用荧光漂白恢复技术测定不同浓度冰片对ＨａＣａＴ细胞膜流动性的影响，采用流式细胞仪测定冰片　对ＨａＣａＴ细胞膜电位及细胞膜内Ｃａ　浓度的影响。结果冰片和氮酮的药物ＩＣ　。分别为２．８２６、０．１７２　ｍｍｏｌ／Ｌ：　冰片可增加ＨａＣａＴ细胞膜流动性，且随着药物浓度的增大而增加，呈剂量依赖性关系；冰片可降低ＨａＣａＴ细胞膜　电位和ＨａＣａＴ细胞内Ｃａ　浓度，表现出类似氮酮作用特点。结论冰片的经皮促透作用机制可能与其影响角质　细胞内Ｃａ　浓度进而改变活性表皮角质形成细胞膜电位和膜流动性有关。　关键词：冰片：促透剂：细胞膜流动性：ＨａＣａＴ细胞：细胞膜电位　ＤＯｔ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００５—５３０４．２０１５．０１８　中图分类号：Ｒ２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１００５—５３０４（２０１５）０４—００６２—０５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｂｏｒｎｅｏｌ　ｏｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｌｕｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　Ｃｅｌｌ　ＦＵ　Ｄａ－ｌｉ　．　ＹＯＮＧ　Ｘｉａｏ—ｌａｎ　，ＬＩＵ　Ｄｅ—ｆａｎｇ　，ＸＩＡＯ　Ｓｈｕａｎｇ　．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＣｈｅｎｇｄｕ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００８３，　Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００７２．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ　ｏｆ　ｂｏｒｎｅｏｌ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｓｋｉｎ；Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｍｏｄｅ　ｏｆ　ｂｏｒｎｅｏｌ　ａｓ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｗｅｌｌ—ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｎｄ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ａｚｏｎｅ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ａｓ　ａ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｂｏｒｎｅｏｌ　ａｎｄ　Ａｚｏｎｅ　ｏｎ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ一８　ａｓｓａｙ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｈａｌｆ　５０％ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ《ＩＣ５ｏ）ｗｅｒｅ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ａｆｔｅｒ　ｐｈｏｔｏ　ｂｌｅａｃｈｉｎｇ　ｗａｓ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｂｏｒｎｅｏｌ　ａｎｄ　Ａｚｏｎｅ　ｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｌｕｉｄｉｔｙ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｏｎｉｔｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅｓｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ＩＣ５０ｖａｌｕｅｓ　ｏｆｂｏｒｎｅｏｌ　ａｎｄ　Ａｚｏｎｅ　ｗｅｒｅ　２．８２６，　０．１　７２　ｍｍｏｌ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｂｏｒｎｅｏｌ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｌｕｉｄｉｔｙ　ｉｎ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ，ａｎｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌｌ，　ｗｈｉｃｈ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　Ａｚｏｎｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｂｏｒｎｅｏｌ　ｗａｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃ８２　ｉｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｔｈｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｌｕｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ＨａＣａＴ　ｃｅｌ１．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｏｒｎｅｏｌ；ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｒ：ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｌｕｉｄｉｔｙ；ＨａＣａＴ　ｃｅｌ１．ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　

基金项目：四川省卫生厅科研课题（１２０５７３）　

的影响［Ｊ］放射免疫学杂志，２０１０，２３（３）：２８２—２８３　［５］赵海梅，刘端勇，汤菲，等．四神丸对小鼠溃疡性结肠炎结肠黏膜修复　的保护机制研究［Ｊ］．中成药，２００９．３１（１２）：１９３５　１９３７．　［６］李仪奎．中药药理实验方法学［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，２００６：　１０８８．　［７］甘华田，欧阳钦，贾道全，等．溃疡性结肠炎患者核因子一Ｋ　Ｂ活化与细　胞因子基因表达［＿『］．中华内科杂志，２００２，４Ｉ（４）：２５２—２５５．　［８］张志军，王磊，蒋晓云，等．ＴＬＲ４ｍＡｂ对急性期溃疡性结肠炎小鼠结肠黏　

膜中促炎因子ＴＮＦ—ｄ、ＩＦＮ～Ｙ、ＩＬ一１　Ｂ的影响［Ｊ］．复旦学报，２００８　３５（２）：１７６—１７９．　［９］Ａｈｒｅｕ　ＭＴ，Ａｒｎｏｌｄ　ＥＴ，Ｔｈｏｍａｓ　ＬＳ．ＴＬＲ４　ａｎｄ　ＭＤ一２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，　２７７（２３）：２０４３１—２０４３７．　（收稿日期：２０１４－０８－１７）　（修回日期：２０１４—０８—２６；编辑：华强）　２０１　５年４月第２２卷第４期　国　医　堡！　盘查　・６３・　冰片属开窍药，具有辛香走窜之性，能引药由肌　表直达腠理，在中药外用制剂中应用广泛，从而促进　中药外用制剂中有效成分透皮吸收，表现出类似现代　经皮制剂中的促透剂作用ｎ吨　。皮肤表皮作为药物经皮　

吸收的重要屏障，主要由角质层和活性表皮组成，关　于冰片促透作用机制，有研究考察冰片对表皮角质层　的影响。。　，但尚未阐明其对皮肤活性表皮的作用，目　前也缺乏经皮促透剂对皮肤活性表皮的促透作用机　制研究。因此，本研究采用ＨａＣａＴ细胞模型，测定冰片　对ＨａＣａＴ细胞膜流动性和膜电位的影响，研究其对皮　肤活性表皮的影响，为进一步阐明冰片促进药物透皮　吸收的作用机制提供依据。　１材料与方法　１．１　药物与主要试剂　冰片，北京本草方源药业有限公司，批号　２０１４０４２２；胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品（北　京）有限公司，批号ＮＸＦ０６５０；青链霉素混合液，北京索　莱宝科技有限公司，批号２０１３０３１８；．ⅥＥＭ／ＥＢＳＳ，赛默飞　世尔生物化学制品（北京）有限公司，批号ＮＹＣ０８３１；胰　蛋白酶一ＥＤＴＡ消化液，北京索莱宝科技有限公司，批号　２０１３０３１３；氮酮，国药集团化学试剂有限公司，批号　Ｆ２０１　１０８３１；磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），北京索菜宝科技有　限公司，批号２０１３０５３１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，　批号１３１３４９８；细胞增殖～毒性检测试剂盒（ＣＣＫ一８），　Ｄｏｊｉｎｄｏ，批号ＥＪ７４４；Ｆｌｕｏ３一ＡＭ，Ｄｏｊｉｎｄｏ，批号ＥＸ７６７；　ＤｉＢＡＣ４（３）荧光探针。　１．２仪器　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＧＯ全波长酶标仪（芬兰Ｔｈｅｒｍｏ公　司），ＦＶＩＯ００激光共聚焦扫描显微镜（日本奥林巴斯公　司），肋ＦＡＣＳＣａｎｔｏ　ＩＩ流式细胞仪（美国ＤＢ公司）。　１．３细胞株与细胞培养　ＨａＣａＴ细胞购自中国医学科学院基础医学研究所　基础医学细胞中心。将ＨａＣａＴ细胞接种于含１０％胎牛　血清、ｉ００　Ｕ／ｍＬ青链霉素混合液的ＭＥＭ／ＥＢＳＳ培养基　中，３７℃、５％Ｃ０ｚ饱和湿度条件培养。　１．４　ＣＣＫ－８法测定冰片ＨａＣａＴ细胞毒性　收集对数期ＨａＣａＴ细胞，以每孔７．０×ｌＯ。的细胞　密度接种于９６孔板，并设置空白组（ＰＢＳ）、对照组（含　０．５％ＤＭＳＯ培养基）及系列药物组，在３７℃、５％Ｃ０。条　件下培养２４　ｈ后，加入系列不同浓度冰片及阳性对照　药氮酮。药物作用２４　ｈ后移去培养基，加入１　ｍＬ含　ｌ０　ＣＣＫ－８试液培养基，置于３７℃培养箱中反应２　ｈ。　于酶标仪４５０　ｎｍ处检测各孔的吸光度（Ａ），并计算细　胞存活率［（Ａ药物组一Ａ空白组）÷（Ａ对照组一Ａ空白组）×１００％］。根　据系列不同浓度药物细胞存活率及文献方法，计算药　物半数抑制率（ＩＣ　。）　。　１．５细胞膜流动性的测定　利用激光共聚焦显微镜的荧光漂白恢复技术　（ＦＲＡＰ）观察并测定药物作用ＨａＣａＴ细胞后对细胞膜流　动性的影响。以每孔１５×ｉ０　的细胞密度接种于激光　共聚焦培养小皿，并设置空白组（正常培养基）、对照　组（含０．５％ＤＭＳＯ培养基）及高、中、低浓度冰片和氮　酮药物组。置于培养箱内培养２４　ｈ后，移去培养基，　并用ＰＢＳ小心清洗３遍，每孔加入０．５　ｍＬ　２￣Ｌ／ｍＬ　ＮＢＤ－ＣＢ－ＨＰＣ荧光探针溶液培养０．５　ｈ，然后再用ＰＢＳ　小心清洗３遍，置于激光共聚焦显微镜进行测定。仪　器参数为：激发波长４８８　ｎｌｎ，接收波长５３０　ｎｍ，荧光　漂白的激光功率１００％，漂白时间９００　ｍｓ，扫描频率　１．６５　Ｓ，总扫描时间为１２０　Ｓ。记录荧光漂白位置荧光　漂白动画，细胞膜流动性以荧光恢复率进行表征。荧　光恢复率（％）：（Ｆ２－－Ｆ１）÷（Ｆ１－－ＦＯ）×１００％。式中，Ｆ２　为荧光漂白后的荧光值，Ｆｌ为荧光漂白前的荧光值。　ＦＯ为漂白后即刻荧光值荧光恢复率越大，细胞膜流动　性越大。　１．６细胞膜电位的测定　采用流式细胞仪测定冰片及阳性药氮酮对ＨａＣａＴ　细胞膜电位的影响。将ＨａＣａＴ细胞接种于２５　ｍＬ培养　瓶内，设置空白组（正常培养基）、对照组（含０．５％　ＤＭＳＯ培养基）及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，　待细胞贴壁后１２　ｈ分别加入对应药物，置ｃ０　培养箱　孵育２４　ｈ。用胰蛋白酶消化、离心，去除上清液后加　入５００　ｇＬ　ＤｉＢＡＣ４（３）荧光探针溶液（５　ｇｇ／ｍＬ），３７℃　孵育０．５　ｈ，离心后弃上清液，用０．５　ｍＬ　ＰＢＳ分散后利　用流式细胞仪进行细胞膜电位测定。仪器参数设置：　激发波长４８８　ｎｍ，接收波长５３０　ｎｍ，用未经荧光物质　孵育ＨａＣａＴ细胞调零。　１．７　ＨａＣａＴ细胞内Ｃａ　浓度的测定　将ＨａＣａＴ细胞接种于２５　ｍＬ培养瓶内，并设置空　白组（正常培养基）、对照组（含０．５％ＤＭＳＯ培养基）、　及高、中、低浓度冰片和氮酮药物组，待细胞贴壁后　分别加入对应的药物培养２４　ｈ。然后用胰蛋白酶消　化，Ｄ－Ｈａｎｋｓ溶液稀释并调整细胞密度为７０×ｉ０　／孔，　离心去上清液，加入０．５　ｍＬ　Ｆｌｕｏ　３一ＡＭ（５￣ｕｎｏ１），置　培养箱孵育０．５　ｈ后，采用流式细胞仪进行测定ＨａＣａＴ　细胞荧光强度。仪器参数设置：激发波长４８８　ｎｍ，接　收波长５２０　ｎｍ。　１．８统计学方法　采用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行分析。实验数据以