小麦赤霉病菌对多菌灵和不同杀菌剂敏感性的相关分析-农
学论文
小麦赤霉病菌对多菌灵和不同杀菌剂敏感性的相关分析
陈宏州1，肖婷1，许媛1，狄华涛1，马圣洲1，范婷2，杨敬辉1 （1江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容212400；2江苏农林职业技术学院，江苏句容212400）
摘要：为探明江苏省小麦赤霉病菌[Gibberella zeae (Schwein.) Petch]对多菌灵的抗药性和该药剂与其他杀菌剂的交互抗性，采用区分剂量法检测了采自江苏省26 个县（市）的520 株小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性，并采用菌丝生长速率法分别检测了对多菌灵不同敏感性的10 个菌株对嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟环唑、己唑醇、灭菌唑和咯菌腈等杀菌剂的敏感性。
结果表明：江苏省各县（市）菌株对多菌灵的抗性频率差异较大，总抗性频率为50.58%；通过EC50值相关性分析，小麦赤霉病菌对多菌灵和上述杀菌剂之间不存在交互抗性。
江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性频率较高，迫切需要筛选新的杀菌剂防治小麦赤霉病。
关键词：小麦赤霉病菌；多菌灵；抗药性；交互抗性
中图分类号：S435.121 文献标志码：A 论文编号：cjas
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金项目“稻麦两熟制高产平衡技术方案”[CX(15)1002]；镇江市农业科技支撑项目“小麦赤霉病抗性检测与防控技术研究”(NY2013003)；“市域主要农作物病原菌抗药性检测与监测”(NY2015019)。
第一作者简介：陈宏州，男，1984 年出生，广西宜州人，助理研究员，
硕士，主要从事农作物病害抗药性检测与治理研究。
通信地址：212400 江苏省句容市弘景路1 号江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：9，E-mail：[emailprotected]。
通讯作者：杨敬辉，男，1973 年出生，云南丽江人，研究员，博士，主要从事植物保护研究。
通信地址：212400 江苏省句容市弘景路1 号江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，Tel：9，E-mail：[emailprotected]。
收稿日期：2016-04-29，修回日期：2016-07-03。
0 引言
小麦赤霉病菌[Gibberella zeae (Schwein.) Petch]（无性型为Fusarium graminearum Schwabe），是危害较为严重的植物病原真菌之一，在世界范围内引起小麦和其他谷物的赤霉病[1-2]。
小麦赤霉病不仅会导致严重的经济损失，还因产生真菌毒素而严重威胁食品安全[3-4]。
由于缺乏有效的抗性品种，小麦赤霉病的防治主要依靠杀菌剂。
在中国，苯并咪唑类杀菌剂，尤其是多菌灵，一直是防治小麦赤霉病的主导药剂，用于防治小麦赤霉病已超过30年。
中国自1992 年首次发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性菌株以来，在江苏省、上海市和安徽省均检测到了抗性种群[5-6]。
由于出现了抗性种群，1998年以后在江苏和浙江省，多菌灵对小麦赤霉病的防效急剧下降[6]。
随着抗性种群的发展与蔓延，一旦小麦扬花期遇多雨年份可引起抗药性病害流行，再喷施多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂可能会导致药剂防效丧失。
近年来，小麦赤霉病导致中国每年有超过500万hm（2 大约20%）的小麦种植区域发生显著的减产，从2008至2012年在长江中下游地区发生了1次严重和2次中等的病害流行[7]，并且逐步蔓延到中国北方的淮河和黄河流域[8]。
为治理小麦
赤霉病菌的抗药性，中国许多研究人员筛选或研发新的杀菌剂如咪酰胺[6]、戊唑醇[9]、福美双[10]、氰烯菌酯[11]、申嗪霉素[12]和氟啶胺[13]等用于防治小麦赤霉病。
目前，中国登记用于防治小麦赤霉病的杀菌剂产品有将近300 个，但超过半数产品有效成分为多菌灵或甲基硫菌灵，其他产品有效成分主要为咪酰胺、福美双、戊唑醇和氰烯菌酯等几种药剂，抗性治理的形势仍然十分严峻。
为探明江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性现状，以及对其他甲氧基丙烯酸酯类（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类（咯菌腈）等3 类8 种杀菌剂的交互抗性，笔者从江苏省的26 个县（市）采集了520 株小麦赤霉病菌，然后检测了小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性以及对上述8 种杀菌剂的敏感性，以期为小麦赤霉病的防治和抗药性的治理提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试培养基
马铃薯培养基(PDA)[14]，用于小麦赤霉病菌的单孢分离、保存以及室内药剂试验。
1.2 供试菌株
2015 年5 月27—29 日，分别从江苏省句容市等26个县（市）采集小麦病穗样品，每田块采1~2 个病样，每个病样分别存放于纸质样品袋内，防止交叉污染。
采用平板稀释画线分离法对病样进行小麦赤霉病菌的单孢分离[15]，经单孢分离后将菌株保存备用，菌株的采集地点见表1。
1.3 供试药剂
97.09%多菌灵(Carbendazim)，上海升联化工有限公司；96.6%嘧菌酯
(Azoxystrobin)，江苏耘农化工有限公司；95%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)，德国巴斯夫股份有限公司；97%肟菌酯(Trifloxystrobin)，江苏耕耘化学有限公司；97%唑胺菌酯(pyrametostrobin)，沈阳化工研究院有限公司；97%氟环唑(Epoxiconazole)，北京绿色农华植保科技有限公司；95.9% 己唑醇(Hexaconazole)，江苏耘农化工有限公司；96%灭菌唑(Triticonazole)，陕西美邦农药有限公司；98%咯菌腈(Fludioxonil)，上海开荣化工科技有限公司。
将97.09%多菌灵用适量0.1 mol/L 的盐酸溶液溶解，其他药剂分别用适量丙酮溶解，然后用无菌水定容至所需体积，并加入5%的吐温-80 作为乳化剂，8 种供试杀菌剂均配制成10000 μg/mL的母液置于冰箱中冷藏备用。
99%水杨肟酸（Salicylhydroxamic acid，简写为SHAM），美国Acros Organics 公司，用适量甲醇溶解，配制成50000 μg/mL的母液置于冰箱中冷藏备用。
1.4 小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性检测
采用区分剂量法，以10 μg/mL 多菌灵为区分剂量，以不加药剂为对照。
将保存的供试菌株移植到PDA平皿中，在25℃下活化3 天，然后在菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并分别移植到上述含药剂和对照平皿中，25℃下培养2 天，每个处理重复3次。
供试菌株能在含10 μg/mL 多菌灵的平皿上生长，则鉴定为抗性菌株(R)，不能生长的为敏感菌株(S)[6]。
1.5 不同杀菌剂对小麦赤霉病菌的毒力检测
在预试验基础上，采用菌丝生长速率法[17]，分别将甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类杀菌剂（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类杀菌剂（咯菌腈）的母液，依次稀释至一定浓度，再将
1 mL 药液与9 mL PDA 培养基在培养皿内混匀，制成含系列梯度浓度药剂的PDA 培养基。
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类杀菌剂（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类杀菌剂（咯菌腈）的系列梯度浓度分别设计为50~0.78125 μg/mL、10~0.15625 μg/mL和5~0.078125 μg/mL，均为
2 倍递减稀释的7 个不同浓度梯度的含药PDA培养基，采用无菌水作对照，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的处理与对照中均加入100 μg/mL的旁路氧化酶抑制剂SHAM，各处理重复4 次。
将采自江苏省洪泽县高良涧镇，对多菌灵敏感菌株1-5(S)和抗性菌株1-1(R)分别移植到PDA平皿中，在25℃下活化
3 天，然后在菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并分别移植到上述2 倍递减稀释配制的含药和对照的平皿中，25℃下培养3 天后采用十字交叉法量取菌落直径。
计算菌落直径平均值，并按照公式(1)计算菌丝生长平均抑制率。
采用DPSv7.05 版数据处理系统，分别计算嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟环唑、己唑醇、灭菌唑和咯菌腈等8 种杀菌剂对供试小麦赤霉病菌菌丝生长抑制的毒力回归方程、EC50及其95%置信限。
1.6 多菌灵与不同作用机制杀菌剂的交互抗性检测在预试验基础上，采用菌丝生长速率法，分别检测10 株对多菌灵不同敏感程度的菌株（5 株敏感，5 株抗性）对苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类杀菌剂（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类杀菌剂（咯菌腈）等4 类9 种杀菌剂的敏感性。
方法同1.5，其中多菌灵的系列梯度浓度设计与三唑类杀菌剂相同。
采用Excel 软件进行多菌灵和上
述杀菌剂之间对不同菌株EC50值的相关性分析并制图。
2 结果与分析
2.1 小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性
抗药性检测结果得出，2015 年5 月采自江苏省句容市等26 个县（市）的小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性频率最低为15.00%，最高达89.29%，不同地区菌株抗性频率差异较大，总抗性频率达50.58%（表1）。
这表明，江苏省小麦赤霉病抗药性病原群体在多菌灵选择压下发展迅速，抗性频率已上升到较高水平，一旦遇到病害流行并继续用多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂防治，就可能会对小麦赤霉病失去控制。
2.2 不同杀菌剂对小麦赤霉病菌的敏感性
分别以对多菌灵敏感菌株1-5(S)和抗性菌株1-1(R)为靶标，比较不同杀菌剂对小麦赤霉病菌的毒力。
以敏感菌株1-5(S)为靶标时，8 种杀菌剂的毒力由弱到强依次为嘧菌酯、唑胺菌酯、肟菌酯、吡唑醚菌酯、己唑醇、氟环唑、灭菌唑和咯菌腈；以抗性菌株1-1(R)为靶标时，8 种杀菌剂的毒力由弱到强依次为嘧菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、吡唑醚菌酯、己唑醇、氟环唑、灭菌唑和咯菌腈（表2）。
这表明，供试的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制活性整体相对较低，其中吡唑醚菌酯的抑制活性最强；三唑类杀菌剂对病菌菌丝生长的抑制活性居中，其中灭菌唑的抑制活性最强；吡咯类杀菌剂（咯菌腈）对病菌菌丝生长的抑制活性最强。
2.3 多菌灵与不同作用机制杀菌剂的交互抗性
以10 株对多菌灵不同敏感程度的菌株（5 株敏感，5 株抗性）为靶标，分别检测对苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯、
吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类杀菌剂（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类杀菌剂（咯菌腈）的敏感性。
通过EC50值线性回归分析得出，多菌灵与嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟环唑、己唑醇、灭菌唑和咯菌腈的决定系数分别为0.1051、0.0061、0.0818、0.0092、0.0261、0.0832、0.1065 和0.0468，在P=0.05 水平上均不显著（图1）。
这表明，多菌灵与上述8 种杀菌剂之间不存在交互抗性。
3 讨论
相关的研究表明，江苏、浙江和上海等地小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性已普遍发生，不同年份和地区的抗性菌株频率差异较大，在药剂选择压力下，抗性菌株频率呈上升趋势[6,16-17]。
本研究采用区分剂量法检测了2015 年江苏省26 个县（市）的520 株小麦赤霉病对多菌灵的抗药性，结果表明不同地区间菌株抗性频率差异较大，最高达89.29%，全省菌株抗性频率为50.58%。
由于在江苏省各地区取样的样本偏少，可能没有完全反映江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性现状。
根据笔者的研究结果并结合各地区小麦赤霉病的防治现况，江苏省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性已整体发展到了更高水平，在部分地区喷施多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂防治小麦赤霉病意义不大。
当前，筛选防治小麦赤霉病的替代杀菌剂，对保障小麦高产和稳产具有重要意义。
本研究发现，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯和唑胺菌酯）、三唑类杀菌剂（氟环唑、己唑醇和灭菌唑）和吡咯类杀菌剂（咯菌腈）等3 类8 种杀菌剂对小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制活性均较强，其中灭菌唑和咯菌腈的抑菌活性尤为突出。
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是继三唑类杀菌剂之后极具发展潜力和市场活力的新型杀菌剂。
该类杀菌剂，通过阻止细胞色素
bcl 复合物中Qo位点的电子传递，阻止ATP 合成，从而干扰呼吸抑制真菌生长；同时还能提高产量，延缓植物衰老，这是其他类杀菌剂所不及的[18-19]。
本研究中，该类杀菌剂对小麦赤霉病菌菌丝生长的抑制活性与相关的报道有较大的差异[20]，这可能是由于本研究进行敏感性检测时加入了旁路氧化酶抑制剂SHAM，能更好的反应出该类药剂在田间对病原菌的抑制活性[21]。
唑胺菌酯，是该类杀菌剂中由沈阳化工研究院自主研发的杀菌剂，内吸传导性优异，兼具保护和治疗效果[22]，对小麦赤霉病菌抑制活性也较强。
近年来，三唑类杀菌剂戊唑醇在治理小麦赤霉病抗药性中发挥了较大的作用，本研究发现氟环唑等其他三唑类杀菌剂也具备较好的应用潜力。
咯菌腈为吡咯类杀菌剂，作用机理独特，杀菌谱广，毒性低[23]，在供试的8 种杀菌剂中对小麦赤霉病菌的毒力最强。
通过EC50值相关性分析，小麦赤霉病菌对多菌灵与嘧菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、唑胺菌酯、氟环唑、己唑醇、灭菌唑以及咯菌腈的敏感性均没有显著相关性，这表明小麦赤霉病菌对多菌灵与供试的8 种杀菌剂之间均不存在交互抗性。
可见，供试的3类8种杀菌剂在防治小麦赤霉病中均具有一定的应用前景。
本研究仅在离体条件下进行了杀菌剂试验，相关杀菌剂的田间药效还有待进一步验证，同时在田间应用中要科学合理用药，以延缓小麦赤霉病菌抗药性的产生与蔓延。
参考文献
[1] Maier F J, Malz S, Losch A P, et al. Development of a highlyefficient gene targeting system for Fusarium graminearum using thedisruption of a polyketide synthase gene as a visible marker[J].FEMS Yeast Res.,2005,5:653-662.
[2] Proctor R H, Hohn T M, McCormick S P. Restoration of wildtypevirulence to Tri5 disruption mutants of Gibberella zeae via genereversion and mutant complementation[J].Microbiology,1997,143:2583-2591.
[3] Atanassov Z, Nakamura C, Mori N, et al. Mycotoxin productionand pathogenicity of Fusarium species and wheat resistance toFusarium head blight[J].Can J Bot.,1994,72:161-167.
[4] Chen C J, Wang J X, Luo Q Q, et al. Characterizationand fitness ofcarbendazim- resistant strains of Fusarium graminearum (wheatscab)[J].Pest Manag Sci,2007,63:1201-1207.
[5] Liu X, Yin Y N, Wu J B, et al. Identification and characterization ofcarbendazim-resistant isolates of Gibberella zeae[J].Plant Dis.,2010,94:1137-1142.
[6] 王建新,周明国,陆悦健,等.小麦赤霉病菌抗药性群体动态及其治理药剂[J].南京农业大学学报,2002,25(1):43-47.
[7] Liu Y, Chen X, Jiang J H, et al. Detection and dynamics of differentcarbendazim- resistance conferring β- tubulin variants of Gibberellazeae collected from infected wheat heads and rice stubble in China[J].Pest manag Sci.,2014,70:1228-1236.
[8] Qu B, Li H P, Zhang J B, et al. Comparison of genetic diversity andpathogenicity of Fusarium head blight pathogens from China andEurope by SSCP and seedling assays on wheat[J].Plant
Pathol,2008,57:642-651.
[9] 韩青梅,康振生,黄丽丽,等.戊唑醇对小麦赤霉菌侵染影响的细胞学研究[J].植物保护学报,2005,32(1):57-62.
[10] 毕秋艳,马志强,张小风,等.福美双和戊唑醇增效与拮抗组合对小麦赤霉病菌细胞膜透性及内含物渗漏的影响[J].中国农学通报,2009,25(20):222-227.
[11] 刁亚梅,倪珏萍,马亚芳,等.创制杀菌剂氰烯菌酯的应用研究[J].植物保护,2007,33(4):121-123.
[12] 侯昌亮,艾爽,姚安庆,等.5 种杀菌剂对小麦赤霉病菌的室内毒力测定[J].长江大学学报:自然科学版,2012,9(12):1-2.
[13] 侯昌亮,胡寒哲,艾爽,等.11 种杀菌剂对小麦赤霉病菌的抑制作用[J].湖北农业科学,2014,53(17):4066-4068.
[14] 赵斌,何绍江.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002:251.
[15] 张昊,张争,许景升,等.一种简单快速的赤霉病菌单孢分离方法—平板稀释画线分离法[J].植物保护,2008,34(6):134-136.
[16] 石志琦,史建荣,陈怀谷,等.小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性研究[J].农药学学报,2000,2(4):22-27.
[17] 王建新,周明国.小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性监测技术研究[J].植物保护学报,2002,29(1):73-77.
[18] Xiao K H, Gregory E, Sany R, et al. Effect Of famoxadone onphotoinduced electron transfer between the Iron- Sulfur center andcytochrome c1 in the cytochrome bcl complex[J].The Journal ofBiological Chemistry,2003,278:11419-11426.
[19] Lothar E, Byron Q, Li Y F, et al. Crystallographic studies of quinoloxidation site inhibitors: a modified classificadon of inhibitors forthe cytochrome bcl complex[J].Journal of Molecular Biology,2004,341:281-302.
[20] 翟平平,刘友超,姚安庆.小麦赤霉病杀菌剂室内筛选试验[J].长江大学学报:自然科学版,2012,9(3):1-2,14.
[21] 金丽华,陈长军,王建新,等.嘧菌酯及SHAM对4 种植物病原真菌的活性和作用方式研究[J].中国农业科学,2007,40(10):2206-2213.
[22] 杨瑞秀,司乃国.唑胺菌酯(SYP-4155)作用特性研究.//周明国,陈长军.中国植物病害化学防治研究(第6 卷)[M].北京:中国农业科学技术出版社,2008:25-28.
[23] 刘颖超,张金林,庞民好,等.咯菌腈对草莓灰霉病Botrytis cinerea的毒力及防效研究初报[J].农药学学报,2002,4(3):94-96.。
