玉米贮藏蛋白质的提取及亚基电泳分析

利用醇溶蛋白电泳图谱分析不同玉米品种的遗传多样性

康美玲;田忠景;张倩倩

【摘 要】采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（ SDS-PAGE）对10个玉米品种进行醇溶蛋白遗传多样性分析。10个玉米品种共分离出12条谱带，每种玉米品种分离出了5～8条谱带，平均6．9条，其中具多态性的谱带共有7条，多态性比率达58．33％。按照迁移率由大到小可分为α、β、γ、ω4个区，其中α区存在1条谱带，β区存在1条谱带，γ区存在3条谱带，ω区存在7条谱带。10个玉米品种间的遗传距离变化范围为0．000～0．538，平均为0．195。对供试品种进行系统聚类，有10种玉米品种在8．96水平上全部聚为一类，其中有7份材料在8．10水平上聚为一类，3份材料在4．20水平上聚为一类。由此可见，供试材料之间具有一定的醇溶蛋白遗传多样性，但遗传多样性不高。

【期刊名称】《江苏农业科学》

【年(卷),期】2013(000)010

【总页数】3页(P70-72)

【关键词】玉米;醇溶蛋白;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术;遗传多样性;聚类分析

【作 者】康美玲;田忠景;张倩倩

【作者单位】枣庄学院生命科学学院，山东枣庄 277160;枣庄学院生命科学学院，山东枣庄 277160;枣庄学院生命科学学院，山东枣庄 277160

【正文语种】中 文

【中图分类】S513.01 玉米既是我国重要的粮食作物，也是保健佳品。我国玉米种植面积很大，玉米杂交种由于具有杂种优势被广泛采用［1］。玉米醇溶蛋白具有很强的疏水性、韧性、抗菌性等特点，是玉米籽粒的主要贮藏蛋白之一［2］。玉米醇溶蛋白为单亚基结构，其谱带组成具有很强的异质性和复杂性，不同玉米品种之间差异明显。玉米醇溶蛋白变异由遗传因素决定，几乎不受环境影响，能稳定地反映不同品种编码位点的差异［3］。目前，醇溶蛋白 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)图谱分析已被广泛应用于品种鉴定、种子纯度检验、亲缘关系比较、遗传多样性等研究［4-7］。然而，关于玉米醇溶蛋白遗传多样性研究还比较少。本试验以不同玉米品种种子为材料，对其醇溶蛋白进行遗传多样性分析，以期为有效利用玉米种质资源提供依据。

内蒙古农业科技２００６（２）：３４　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　盐溶蛋白电泳法鉴定玉米　种子纯度试验中的几个问题　向东山　（湖北省生物资源保护与利用重点试验室、湖北民族学院生物技术研究所。湖北恩施４４５０００）　摘　要：盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子纯度已经广泛应用于种子鉴定中，但仍然存在一定的技术问题。文章　仅就鉴定过程中药品的选择、溶液的配制和电泳成像方面易出现问题的技术环节进行分析。　关键词：盐溶蛋白电泳；玉米种子；纯度鉴定　中图分类号：￥５１３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—０９０７（２００６）０２—００３４一ｏｌ　采用盐溶蛋白电泳法鉴定玉米种子的纯度　主要是根据玉米种子中提取的盐溶蛋白在聚丙　烯酰胺凝胶的浓缩效应、分子筛选效应和电泳分　离的电荷效应作用下得到良好的分离。通过染色　显示蛋白质谱带类型。不同玉米品种由于遗传组　成的不同，种子内所含的蛋白质种类有所差异，　这种差异可利用电泳图谱加以鉴别。从而对于种　子的真实性、品种纯度以及保护知识产权进行鉴　定有了可供遵循的依据。由于试验条件的差异　性。在电泳实际操作过程中应注意一些技术细　节，现阐述如下。　１药品的购置　主要在于Ｎ　亚甲基丙烯酰胺的选购。Ｎ　亚　甲基丙烯酰胺如果不纯会导致胶片聚合不匀、柔　性有余而韧性不足，分离胶板易形成碎片，造成　电泳失败。通常选择进口分析纯。纯度高于　９９．５％。外观呈白色絮状物。　２溶液的配制　２．１　浓缩胶缓冲液的配制　在配制过程中，浓缩胶缓冲液ｐＨ的调配需　给予一定的注意。配制中需用乳酸调至ｐＨ５．２。　用乳酸原液调节，用量极少，不易把握。在实际操　作中可将乳酸适当稀释，降低浓度，相对加大乳　酸的加人量，这样操作起来比较容易掌握。　２．２分离胶和浓缩胶溶液中过氧化氢的用量　分离胶和浓缩胶溶液均需要加入过氧化氢　催化反应，在实际操作中，过氧化氢用量不好掌　握，过多则凝聚太快且胶性脆；过少则聚合太慢，　甚至不凝。通常也是进行稀释，来降低浓度，增加　其缓冲性来解决这一问题的。　３药品溶液和样品提取液的保存　在所有配制的药品溶液中，电极缓冲液可在　常温下保持，染色液通常是现用现配，其他溶液　则需存放在冰箱（４￣Ｃ）保存。样品提取液离心振　荡后放置在４￣Ｃ冰箱内保存。每次取样前可振荡　几分钟，然后再吸取上清液。溶液一般保存时间　在７ｄ内（过氧化氢３ｄ）为宜；提取液一般保存时　间为３ｄ，这样做出的胶带清晰，效果明显。时间　若稍长亦可，但观察谱带则有些模糊。　４缓冲液温度过高　电泳过程中会产生热量。促使缓冲液温度升　高，从而改变电泳系统的电阻，在观察谱带时会　发现谱带过宽，模糊不清，甚至严重弯曲。一般可　以采用两种方法来解决这一问题：一是通过冷凝　管用自来水将温度降低；二是把电泳槽放在冰箱　中降低缓冲液温度。　５谱带弯曲　灌分离胶时需要加入过氧化氢进行催化．若　过氧化氢在分离胶中分布不均匀，会导致胶体聚　合不匀而引起谱带弯曲。在灌分离胶时。一定要　充分搅拌，用力摇匀后再灌。　６可删除浓缩胶　浓缩胶和分离胶之间在电泳时可形成界面　层，删除浓缩胶后，蛋白质分子在迁移过程中不　能形成稳定、单一的谱带，影响结果判定。根据颜　廷进的试验，采取高、低压转化法解决这个问题，　当样品经样品槽进入分离胶时采用较低电压．蛋　白质分子移动速度相对较慢，容易形成界面层，　约１５ｍｉｎ，待界面层形成后，再升至较高电压。加　快电泳速度，完成整个电泳过程。　收稿日期：２００６—０１—２５　（下转３６页）　作者简介：向东山（１９７４一），男（土家族），湖北人，硕士，主要从事作物营养生理方面的研究。

蛋白质提取

原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液

→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。

方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。

5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节 pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS（十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油

(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇 (5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。

Western bolt原理及步骤

原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

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蛋白质的提取与检测

第一节 细胞总蛋白的提取及含量测定

【基本原理】

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、 最基本的分析方法之一。 目前 常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（ Biuret 法）、 Folin- 酚试剂法 （ Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马 斯亮蓝法（ Bradford 法）与二辛可宁酸法（ BCA

法）。值得注意的是，上述方法 并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质， 因为一种蛋白质溶液用这几种方 法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。 在选择方法时应考虑： ①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

Lowry 法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展， 从而使 暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与 磷钼钨酸 反应并产生深蓝色，在 750nm有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪 氨酸和色氨酸的含量成正比 ,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相 同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford 法：蛋白质与染料考马斯亮蓝 G-250 结合， 使得染料最大吸收峰从 465nm变为595nm,溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。 在一定的线性范围内，反应 液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定 595nm处吸光度的增加 即可进行蛋白定量。

BCA （Bicinchoninic acid ）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质 还原成一价铜离子（Biuret reaction）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。 两分子的 BCA 螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在 562nm 处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关 系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。