葡萄糖脱氢酶融合表达载体的构建

羰基还原酶的纯化与基因表达简述摘要：羰基还原酶具有高度的化学、区域和立体选择性，是一种极具潜力的催化不对称还原反应的生物催化剂。

能以NAD(P)H为辅酶，催化羰基化合物还原成羟基化合物，是手性化合物拆分过程中重要的酶类。

随着对手性化合物光学纯度要求的提高，羰基还原酶的催化效果、纯酶的获得和工程菌的构建越来越受到关注。

羰基还原酶的可以通过筛选天然菌株、天然羰基还原酶的纯化和工程菌的构建等方式获得。

在构建工程菌方面，最常用的宿主菌有大肠杆菌和毕赤酵母等，各具优缺点。

随着分子生物学技术的高速发展和成熟，越来越多的研究者选择用重组表达的方法来获得羰基还原酶。

Abstract：Carbonyl reductases are as a group of promising biocatalysts with high chemo-, regio-, and stereo-selectivity. They are NAD(P)H-dependent enzymes and can catalyze the reduction of carbonyl compounds. So carbonyl reductases as a group of oxidoreductase are very important during the biocatalysis. As for the optical purity of chiral requirements increase, the catalytic effect of carbonyl reductase, the obtainment of pure enzyme and construction of engineering bacteria are draw more and more attention. In building engineering bacteria , the most common host strains are E. coli and Pichia pastoris , etc., and each of them with advantages and disadvantages.With the rapid development of molecular biology techniques and mature, more and more researchers choose to use the method to obtain recombinant carbonyl reductase.关键词：羰基还原酶；纯化；基因表达Key Word: carbonyl reductase; purification; gene cloning1概述羰基还原酶（Carbonyl reductase, EC 1.1.1.184）属于醛酮还原酶家族，能以NADH 或NADPH 为辅因子，催化还原羰基化合物生成光学纯的羟基化合物。

实验题06 实验设计思路及预期结果类考点01 细胞代谢1．（2023·全国甲卷·29T）某同学将从菠菜叶中分离到的叶绿体悬浮于缓冲液中，给该叶绿体悬浮液照光后糖产生。

回答下列问题。

(1)叶片是分离制备叶绿体的常用材料，若要将叶肉细胞中的叶绿体与线粒体等其他细胞器分离，可以采用的方法是_____（答出1种即可）。

叶绿体中光合色素分布_____上，其中类胡萝卜素主要吸收_____（填“蓝紫光”“红光”或“绿光”）。

(2)将叶绿体的内膜和外膜破坏后，加入缓冲液形成悬浮液，发现黑暗条件下悬浮液中不能产生糖，原因是_____。

(3)叶片进行光合作用时，叶绿体中会产生淀粉。

请设计实验证明叶绿体中有淀粉存在，简要写出实验思路和预期结果。

_____考点02 植物生命调节2．（2023·海南卷·16T）海南是我国火龙果的主要种植区之一、由于火龙果是长日照植物，冬季日照时间不足导致其不能正常开花，在生产实践中需要夜间补光，使火龙果提前开花，提早上市。

某团队研究了同一光照强度下，不同补光光源和补光时间对火龙果成花的影响，结果如图。

回答下列问题。

(1)光合作用时，火龙果植株能同时吸收红光和蓝光的光合色素是_____；用纸层析法分离叶绿体色素获得的4条色素带中，以滤液细线为基准，按照自下而上的次序，该光合色素的色素带位于第_____条。

(2)本次实验结果表明，三种补光光源中最佳的是_____，该光源的最佳补光时间是_____小时/天，判断该光源是最佳补光光源的依据是_____。

(3)现有可促进火龙果增产的三种不同光照强度的白色光源，设计实验方案探究成花诱导完成后提高火龙果产量的最适光照强度（简要写出实验思路）。

_____考点03 发酵工程3.（2023·北京卷·16T）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。

有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。

ＰＡＰ的内化，提高其抗病毒效果。

由于编码ＰＴＤ的１０个氨基酸的核苷酸序列仅为３０ｂｐ，本实验采用在引物中直接引入该编码序列的方法实现ＰＴＤ与ＰＡＰ的基因重组。

同时引入在两个引物（Ｐ１和ＩＣ。

２）中分别构建原核大肠杆菌表达中所需的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ酶切位点。

具体步骤详见图１。

ＰＴＤ－ｐｒｉｍｅ吖ＣＧ曼昼盘里￡９＿岫ＨＤＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＴｅＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧ）ＰＴｎＰＡＰ图１．ＰＴＤ－ＰＡＰ的合成模式图通过ＰＣＲ扩增，用ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加Ａ后电泳得到了约８００ｂｐ的扩增片段。

回收后的片段与ｐＰＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ连接。

转入大肠杆菌ＤＨ５Ｑ中，经蓝白筛选，选取白色菌落行ＰＣＲ鉴定见可扩增出约８００ｂｐ的片段；提取ＰＣＲ阳性菌株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约８００ｂｐ和３Ｋｂ处两条条带（见图２）。

株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约１Ｋｂ和３Ｋｂ处两条条带（图４）。

图４ｐＰＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ／ＴＡＴ－ＰＡＰ重组体酶切图示：１．分子量标准为ＢＬ２０００：２．酶切片段。

图中可见酶切下略大于１Ｋｂ片段，相当于Ｔａｔ加上ＰＡＰ序列的大小，支持二者重组成功。

将酶切鉴定阳性菌株质粒测序示ｒＩ钒序列和ＰＡＰ序列正确连入ｐＰＧＥＭ．ＴＶｅｃｔｏｒ中。

１．３．２Ｔａｔ与ＰＡＰ的基因重组体中Ｔａｔ显性负突变体的构建前期的工作共获得的ＨＩＶ的Ｔａｔ显性负突变体共六个：ｐＭｌ：Ｃｙｓ２２＋Ｇｌｙ；ｐＭ２：Ｈｉｓ３３／Ｃｙｓ３４一Ａｌａ／Ｓｅｒ；ｐＭ３：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１一Ａｌ矶～ｌａ；ｐＭ４：Ｌｙｓ５０一ＳＴＯＰ；ｐＭ５：Ａｒ９５２一Ｌｅｕ；ｐＭ６：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１／Ｃｙｓ５０一Ａｌａ／Ａｌａ／ＳＴＯＰ。

之后验证了突变Ｔａｔ对ＨＩＶ－１Ｔａｔ活性的影响：结果说明不同Ｔａｔ突变蛋白都对正常Ｔａｔ有一定程度的抑制作用，其中以ｐＭ５最大，达８５％，另外ｐＭ３可达４０％。

麻疯树JcFAD7基因启动子克隆及植物表达载体构建曾玲;吴平治;魏倩;姜华武;吴国江;李美茹【摘要】利用TAIL-PCR技术成功克隆了麻疯树JcFAD7基因起始密码子的上游1 926 bp序列.利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析表明,该序列含有4个TATA-box和6个CAAT-box.还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫响应元件,说明JcFAD7的表达可能受多种因素的调控.将启动子连接到pB1101.1载体,成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体.为阐明麻疯树不饱和脂肪酸的合成代谢过程和植物生长发育的调控机理奠定了基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2010(037)009【总页数】4页(P177-180)【关键词】麻疯树;ω-3脂肪酸脱氢酶;三烯脂肪酸;启动子【作者】曾玲;吴平治;魏倩;姜华武;吴国江;李美茹【作者单位】中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650【正文语种】中文【中图分类】Q785高等植物的叶绿体膜具有含量非常高的三烯脂肪酸（tienoic fatty acids，TAs），如亚麻酸（C18:3）和十六碳三烯脂肪酸（C16:3）。

这些三烯脂肪酸和双烯脂肪酸占据了植物叶片和根部脂类总脂肪酸的70%以上。

藏躲市安详阳光实验学校生物人教版选修3专题1 基因工程单元检测（时间：60分钟，满分：100分）一、选择题（每小题2分，共50分）1．下列除哪一项外，其余均为基因工程载体必须具备的条件？（）A．具有标记基因，便于筛选B．具一至多个酶切位点，以便与目的基因连接C．能在宿主细胞中复制并稳定保存D．是环状DNA分子2．下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是（）。

A．CTTAAG，切点在C和T之间B．CTTAAG，切点在G和A之间C．GAATTC，切点在G和A之间D．CTTAAC，切点在C和T之间3．在基因表达载体的构建中，下列说法错误的是（）。

①一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子②有启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在相应地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的A．②③B．①④C．①②D．③④4．多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历30多次下述循环：90～95 ℃下使模板DNA变性、解链→55～60 ℃下复性（引物与DNA模板链结合）→70～75 ℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。

下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是（）。

A．变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高5．下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法？（）A．基因枪法B．显微注射法C．农杆菌转化法D．花粉管通道法6．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。

下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是（）。

A．检测受体细胞是否含有目的基因B．检测受体细胞是否含有致病基因C．检测目的基因是否转录出mRNAD．检测目的基因是否翻译出蛋白质7．下列有关基因工程叙述错误的是（）。

2023届高考生物各省模拟试题精编卷（福建专版）一、选择题：本题共16小题，共40分。

第1~12小题，每小题2分；第13~16小题，每小题4分。

在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。

1.（2023·福建漳州·统考三模）蓝细菌（如长孢藻）和绿藻等过度增殖可致湖泊水华。

下列有关长孢藻和绿藻细胞的叙述，正确的是（）A.DNA彻底水解均形成4种产物B.均存在RNA和蛋白质形成的复合体C.都具有叶绿体进行光合作用D.和肉食性鱼细胞一样均具有包含核膜的生物膜系统2.（2023·福建厦门·统考二模）下列关于DNA相关实验的叙述，错误的是（）A.可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNAB.用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色C.PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合D.PCR产物一般可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定3.（2023·福建莆田·统考二模）下列关于细胞中化合物的作用，叙述错误的是（）A.细胞中的蛋白质具有催化、物质运输和信息传递等功能B.葡萄糖、淀粉和脂肪都可通过水解为生命活动提供能量C.某些无机盐离子对于维持细胞的酸碱平衡具有重要作用D.几丁质是广泛存在于甲壳类动物和昆虫外骨骼中的多糖4.（2023·福建莆田·统考二模）细胞膜上参与Ca2+运输的载体蛋白是一种能催化ATP水解的酶，当膜内侧的Ca2+与其结合时，其活性被激活，促使Ca2+释放到膜外。

下列叙述正确的是（）A.Ca2+通过上述载体蛋白运输到细胞外属于协助扩散B.Ca2+载体蛋白是一种具有专一性的高能磷酸化合物C.Ca2+载体蛋白磷酸化后不利于将Ca2+释放到膜外D.一定范围内，Ca2+浓度增大会提高Ca2+的运输速率5.（2023·福建龙岩·统考模拟预测）图甲为某核苷酸的化学结构图，图乙为中心法则中某过程的示意图。