烟草基因相互作用实验步骤

2015-08，36（4）中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 117 烟草重要基因篇：10. 烟草转录因子基因闫宁，张洪博（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）转录因子（transcription factor, TF），又称反式作用因子，可特异识别并结合顺式元件的核心序列，从而调控靶基因的转录效率[1-3]。

在植物中，转录因子广泛参与生物胁迫（病害、虫害等）和非生物胁迫（低温、干旱、高温等）应答以及生长发育调控。

作为植物信号传导途径的关键环节，转录因子的调控机理一直是植物学研究的重要领域[4-5]。

1 植物转录因子概述典型的植物转录因子具有DNA结合域（DNA-binding domain）、转录调控域（transcription-regulation domain）、核定位信号（nuclear location signal）和寡聚化位点（oligomerization site）等特征结构域，一些转录因子可能缺少个别结构域[6-8]。

DNA结合域是转录因子识别并结合顺式元件的区段，在同一转录因子家族成员间具有较高保守性[6,9]。

转录调控区域是转录因子调节靶基因表达的区段，依据其生物活性有转录激活域和转录抑制域之分[10]。

核定位信号作为转录因子定位于细胞核的信号肽，是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸的区段[11]。

寡聚化位点主要影响转录因子间的相互作用及聚合体形成，对转录因子的生物活性具有重要调节作用[12-13]。

植物中存在大量转录因子，根据DNA结合域的特征可将这些转录因子分为若干家族，如MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF、NAC、bHLH等[14]。

转录因子在植物的生长发育及胁迫应答过程中发挥重要调控作用，MYB转录因子参与细胞周期调节及激素和环境应答反应[15]；WRKY转录因子参与植物对冻害、干旱、盐害等非生物胁迫及病原菌和虫害等生物胁迫的应答调控[16]；bZIP转录因子参与植物生长发育、种子成熟以及环境胁迫的响应过程[17]；AP2/ERF转录因子参与植物生长发育、机械损伤、病害防御以及高温干旱等环境胁迫应答[18]；NAC转录因子在植物防御寄生真菌、腐生真菌、非亲和性病原菌等生物胁迫以及干旱高盐等非生物胁迫反应中发挥调控作用[19]；bHLH转录因子参与植物形态建成、次生代谢调控以及对盐害、冷害等非生物胁迫的应答[20]。

荧光素酶基因在转化烟草中的表达利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特点，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，构建成荧光素酶报告质粒。

然后转化烟草，测定荧光素酶活性。

通过荧光素酶活性的高低判断性刺前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

为了减少内在的变化因素对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase)的质粒作为对照质粒与报告基因质粒共转化，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

技术背景1荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。

单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。

双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。

什么是双荧光素酶？2双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。

其中荧火虫荧光素是从萤火虫中分离得到，分子量为61 kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36 kDa。

两种荧光素酶的区别是什么？3①底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。

②发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。

正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双荧光素酶报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示：实验原理4Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。

基因相互作用的研究——基因相互作用的筛选和研究方法基因相互作用是指不同基因之间在发挥生物学功能的过程中发生的相互影响。

对于基因相互作用的研究可以帮助我们更好地理解复杂的生物学系统，并有望为研究一些疾病的发生机制提供新的视角。

本文将介绍基因相互作用的筛选和研究方法。

1. 基因相互作用的筛选方法1.1 组合分析法组合分析法是一种常用的筛选基因相互作用的方法，它可以通过对大量基因的组合进行筛选，找出与某种生物学特征相关的基因相互作用。

组合分析法包括两种方式：一种是简单的线性组合方法，另一种是基于机器学习的非线性组合方法。

1.2 网络和系统生物学方法网络和系统生物学方法可以使用基因调控网络和蛋白质相互作用网络来进行基因相互作用的筛选。

与使用组合分析法不同，这种方法可以考虑到基因表达和调控网络的整体特征。

2. 基因相互作用的研究方法2.1 双杂交法双杂交法是一种常用的研究基因相互作用的方法，它可以通过检测两个蛋白质是否能够与另一个中介蛋白质形成复合物来筛选出具有基因相互作用的蛋白质。

该方法应用广泛，但是需要注意的是其结果需要进一步验证和分析。

2.2 共表达分析共表达分析也是一种常用的研究基因相互作用的方法。

该方法可以通过分析不同基因在不同组织或不同条件下的表达模式，来推断基因之间的相互作用。

其优点在于可以从多个维度搜索基因相互作用，但需要注意数据质量和解释的复杂性。

2.3 CRISPR-Cas9基因编辑技术CRISPR-Cas9基因编辑技术开辟了一种新的研究基因相互作用的方法。

通过该技术，可以精确地修改基因序列，模拟或者干预基因相互作用的过程。

尽管该技术在分析基因相互作用方面有重要应用前景，但同样需要注意其对生物体整体性的影响。

3. 结语基因相互作用的研究是一个复杂而有意义的领域，它可以加深我们对生物学系统的理解，也有望为研究某些疾病的发生机制提供新的思路。

本文介绍了基因相互作用的筛选和研究方法，希望对读者有所帮助。

《利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究》篇一利用CRISPR-Cas9系统对本氏烟草基因编辑的基础研究一、引言基因编辑技术作为现代生物学领域的一项重要突破，为研究生物体的基因组成和功能提供了全新的工具。

其中，CRISPR/Cas9系统因其高效、精确的基因编辑能力，在植物学、医学和农业等多个领域得到了广泛应用。

本氏烟草作为一种常见的植物模型，其基因编辑研究对于理解植物基因功能、改良作物品质和抗性具有重要意义。

本文旨在探讨利用CRISPR/Cas9系统对本氏烟草进行基因编辑的基础研究。

二、CRISPR/Cas9系统概述CRISPR/Cas9系统是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术，通过将特定的RNA引导的Cas9蛋白切割DNA，实现精确的基因编辑。

该系统具有操作简便、效率高、成本低等优点，为植物基因编辑研究提供了强大的工具。

三、本氏烟草基因编辑的实验设计本实验以本氏烟草为研究对象，针对特定基因进行编辑。

首先，通过生物信息学分析，确定目标基因的序列和功能。

然后，设计并合成针对目标基因的CRISPR/Cas9系统组件，包括sgRNA和Cas9蛋白。

将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，实现精确的基因切割和编辑。

四、实验过程与结果1. 实验材料与方法：本实验所使用的本氏烟草为常见品种，实验室自行培育。

CRISPR/Cas9系统组件通过体外合成和转基因技术导入本氏烟草细胞中。

2. 实验步骤：首先对目标基因进行生物信息学分析，确定其序列和功能。

然后设计并合成sgRNA和Cas9蛋白。

将sgRNA和Cas9蛋白共同导入本氏烟草细胞中，通过显微镜观察细胞内基因编辑过程。

最后，通过PCR、测序等分子生物学技术验证基因编辑效果。

3. 实验结果：成功将CRISPR/Cas9系统导入本氏烟草细胞中，实现了目标基因的精确切割和编辑。

通过PCR、测序等分子生物学技术验证，发现编辑后的基因序列与预期相符，证明了CRISPR/Cas9系统在本氏烟草基因编辑中的有效性。

利用农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达的方法[精华提要]通常，我们可以利用烟草的瞬时表达系统来观察感兴趣蛋白的亚细胞定位（通过与绿色荧光蛋白构成融合蛋白）。

同时，还可以检测蛋白的表达量。

这一个过程是通过农杆菌作为一个工具将目的基因整合到到烟草的细胞内的。

材料与试剂1. 携带表达载体的农杆菌菌株（通常表达载体由35S启动子驱动）2. 2-4周的烟草植株3. LB培养基4. 乙酰丁香酮5. 2-(N-吗啉代) 乙磺酸6. 抗生素7. 注射器工具1. 50ml离心管2. 光谱仪3. 紫外灯4. 荧光显微镜步骤：1. 挑取单克隆于5mlLB液体培养中，28-30°C震荡培养。

通常，LB中加入100ug/ml 庆大霉素（农杆菌株GV3101携带抗性），50ug/ml大观霉素（载体携带）。

2. 将1ml过夜培养的农杆菌转接到25mlLB液体培养基中（加有与1相同的抗生素，另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮）。

3. 检测过夜培养的菌液OD600的值。

4. 5000g，15分钟集菌，用重悬液重悬菌体，最终OD600为0.4。

5. 室温放置2-3h后注射烟草。

6. 将侵染液装入5ml注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内（勿使用子叶）。

注射后，烟草叶片会出现湿润的现象。

7. 注射后2-5天，在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号（只适用于荧光很强的叶片）。

8. 通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。

同时，可以提取蛋白，检测蛋白的含量。

配方1. 加有相应抗生素的LB液体培养基（一种抗生素是菌株携带，一种为载体携带）。

2. 乙酰丁香酮（100mM 溶于乙醇，-20°C储存）。

3. 1M MgCl24. 重悬液(10mM MgCl2,10mM 2-(N-吗啉代) 乙磺酸(pH5.6)高温高压灭菌15分钟，100uM 乙酰丁香酮，高温高压灭菌)。

5. 乙酰丁香酮（来自Aldrich）：又名3’,5’-二甲基-4’-羟基苯乙酮，或4’-羟基-3’,5’-二甲基苯乙酮。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况，验证转基因植株的遗传稳定性，为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。

二、实验材料1. 转基因烟草植株：含有目标基因的烟草再生植株。

2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。

3. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。

三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块，使用DNA提取试剂盒提取总DNA。

2. PCR扩增- 设计特异性引物，针对目标基因进行PCR扩增。

- 将提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。

3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。

4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序，验证其序列与目标基因的一致性。

5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。

- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA，进行反转录PCR，扩增目标基因mRNA。

- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带，而野生型烟草DNA没有扩增产物。

2. 测序验证- 测序结果显示，扩增产物序列与目标基因序列一致。

3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草DNA没有杂交信号。

4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草RNA没有杂交信号。

本氏烟草KANADI基因克隆及表达载体的构建本氏烟草KANADI基因克隆及表达载体的构建摘要：本实验的目的是通过基因克隆技术，构建本氏烟草KANADI基因的表达载体，为后续研究提供基因功能的解析平台。

首先，从本氏烟草中提取总RNA，通过RT-PCR技术扩增目标基因的编码区域。

然后，将目标基因克隆至表达载体pCAMBIA1300上，并通过PCR验证克隆的正确性。

最后，定向限制性酶切验证克隆插入方向，并利用大肠杆菌DH5α进行转化。

本文详细介绍了基因克隆实验的步骤和结果，为后续的基因功能研究奠定了基础。

关键词：本氏烟草；KANADI基因；基因克隆；表达载体；RT-PCR引言烟草（Nicotiana tabacum）是重要的经济作物之一，也是遗传工程研究的常用模式植物。

在烟草领域的研究中，基因克隆技术被广泛应用于揭示基因功能和调控机制。

本氏烟草是常见的品种之一，研究其基因功能对于揭示烟草生长发育和耐逆性机制具有重要意义。

方法1. 烟草样品的处理：从本氏烟草中取一整片叶片，细化后转移到液氮中保存。

待使用时，将叶片放入离心管中，加入适量的TENK缓冲液和RNase酶，通过离心将液体剔除。

2. RNA提取：将上一步处理过的样品加入TRIzol试剂，反复混合后静置片刻，然后加入氯仿，并通过离心将上清液收集到新的离心管中。

3. 反转录：根据试剂盒说明，将提取的RNA反转录为cDNA。

通过热循环反应，在合适的温度条件下制备出目标基因的cDNA。

4. 扩增目标基因：利用PCR技术，以cDNA为模板，使用目标基因的外显子上下游引物进行扩增。

调整PCR反应体系和条件，获得良好的扩增结果。

5. 载体构建：将扩增的目标基因片段与表达载体pCAMBIA1300连接。

利用限制性酶切酶将目标基因和载体剪切开，并进行连接和接头处理。

6. PCR验证：以获得的克隆为模板，使用目标基因的引物进行PCR反应。

通过PCR产物的大小验证克隆的正确性。

烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA 1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA 1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA 1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。

通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。

三、材料的准备1、烟草植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA 1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5M MES 200ul 0.976g1M MgCl2100ul 2.03g100mM乙酰丁香酮10ul 0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml （若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/OD600 VP19= n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml 注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。

第1篇实验题目：利用基因工程方法构建抗虫转基因烟草一、实验目的1. 了解转基因技术的原理和方法。

2. 掌握基因工程操作的基本技能。

3. 通过构建抗虫转基因烟草，验证转基因技术在农业抗虫育种中的应用。

二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入到宿主生物的基因组中，使其在宿主生物中表达，从而达到改良生物性状的目的。

本实验以抗虫基因（如Bt基因）为研究对象，将其导入烟草基因组中，使其在烟草中表达产生抗虫效果。

三、实验材料1. 抗虫基因（如Bt基因）克隆载体2. 烟草细胞系3. DNA连接酶4. 转化试剂5. 抗虫基因检测引物6. PCR仪7. DNA电泳仪8. 显微镜四、实验方法1. 抗虫基因克隆：从基因库中获取抗虫基因（如Bt基因）序列，将其克隆到载体上。

2. 转化烟草细胞：将构建好的重组质粒通过转化试剂导入烟草细胞中。

3. 重组质粒筛选：通过PCR和DNA电泳检测转化烟草细胞中的重组质粒。

4. 抗虫烟草植株再生：将筛选出的阳性转化细胞培养成愈伤组织，再分化成植株。

5. 抗虫烟草植株检测：通过PCR和DNA电泳检测抗虫基因在植株中的表达。

6. 抗虫效果检测：将抗虫烟草植株与普通烟草植株进行虫害对比实验，观察抗虫效果。

五、实验结果1. 抗虫基因克隆成功，获得重组质粒。

2. 转化烟草细胞成功，筛选出阳性转化细胞。

3. 重组质粒在烟草植株中成功表达，抗虫基因在植株中稳定遗传。

4. 抗虫烟草植株与普通烟草植株进行虫害对比实验，结果显示抗虫烟草植株抗虫效果明显。

六、实验讨论1. 本实验成功构建了抗虫转基因烟草，验证了转基因技术在农业抗虫育种中的应用。

2. 实验过程中，转化烟草细胞和植株再生是关键步骤，需要严格控制实验条件。

3. 抗虫基因在植株中的表达稳定性是评价转基因效果的重要指标，本实验中抗虫基因在植株中稳定遗传。

4. 抗虫烟草植株的抗虫效果明显，为农业抗虫育种提供了新的思路。

七、实验结论1. 本实验成功构建了抗虫转基因烟草，为农业抗虫育种提供了新的技术手段。