1．2.2目的基因的导入、检测与鉴定
[学习目标] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。
方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。在完成将目的基因导入受体细胞这一步骤后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。
一、将目的基因导入受体细胞
1．转化的含义
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．转化的方法
(1)导入植物细胞
①农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物时最常用方法。
a．土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌侵染，其Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。
b．方法步骤：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因
插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达。
②基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
目的基因包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达。
③花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加目的基因，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
(2)导入动物细胞
①方法：显微注射技术。
②常用受体细胞：受精卵。
③步骤：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物
(3)导入微生物细胞
①原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
②常用的方法：
a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
b．感受态细胞和重组表达DNA分子在缓冲液中混合，细胞吸收重组表达载体DNA分子。归纳总结
1．上述方法中，在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
2．对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。
例1农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：
(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________的目的。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞____________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________(部位)即可。
(2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制______________________酶合成的基因。
(3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是__________类化合物。
(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取____________________________(至少写出两种)。
答案(1)单子叶植物将目的基因导入植物细胞染色体的DNA T-DNA片段(内部) (2)DNA连接酶、限制(3)酚(4)基因枪法、花粉管通道法
解析(1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞的目的。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。
易错易混农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
例2下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是()
A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济和有效
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法，是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
答案A
解析不同受体细胞导入目的基因的方法不同，每种方法都有利弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济和有效；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；目的基因导入大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化。
