光合细菌的分离及培养条件研究范文

光合细菌M-01的分离及培养条件研究

[摘要]从湛江市霞山区海滩表层污泥中富集分离出红假单胞菌属光合细菌M-01,对其培养条件进行了初 步探讨,结果表明:菌株生长温度为30e时,最适培养光照度为3 000 lx。培养基正交试验结果表明其最优 培养基配方为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾0.2 g,乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,氯化钠1 g,酵母膏0.15 g,硫酸镁 0.2 g,T.M储液少量,蒸馏水1 000 mL;其中乙酸钠为最大影响因子。

[关键词]光合细菌(PSB);分离;培养;正交试验 光合细菌(Photosynthetic bacteria)是一类光合自养型古老细菌,具有较强的分解有机物特性,光合 细菌作为水质净化剂广泛应用于水产动物如一些经济鱼类、虾蟹、贝类的养殖和育苗中[1~4]。在生产上有 意义的红螺菌科包括红螺菌属、红假单胞菌属和红微菌属[4]。现已有学者对红假单胞菌的分离、鉴定、培 养特性及保藏做了研究[5~7],但还没有关于其营养条件优化的报道。笔者从海洋环境中分离到了光合细 菌M-01,采用正交试验方法进行了培养条件优化的研究。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料 (1)待分离材料 取广东省湛江市霞山区海滩表层污泥。 (2)培养基 使用红螺菌科富集培养基作为富集分离基础培养基[8]。 1.2 方法 (1)菌株的分离筛选方法 取污泥10 g,装入500 mL细口无色玻璃瓶中,加入富集培养液至满,盖上 瓶盖,隔绝空气,于30e, 3 000 lx光照下进行富集培养3~4 d,培养液呈绛红色后,取富集培养菌液1 mL,转接入培养液中,重复以上操作2次,然后采用改良的Hungate厌氧培养技术)))柱滚管法[9]进行 分离纯化,用分离培养基的琼脂柱穿刺培养后保存。 (2)细胞色素光谱吸收峰值测定方法 培养物离心后洗涤,将细胞悬浮于60%的蔗糖溶液中,采用 722S分光光度计扫描,波长范围为340~1 000 nm。 (3)生长量的测定 为比较不同培养条件下(光照、接种量、营养条件)培养物生长量的差别,采用 722S分光光度计检测培养物D660 nm值。 (4)光照度对菌株生长影响的测定 将已接种的光合细菌培养液于温度30e,光照度分别为2 000、 3 000、4 000、5 000、6 000 lx下培养3 d,每组3管,用722S分光光度计测定培养物菌液光密度D660 nm(用 培养初刚接种的培养液为空白对照)。 (5)酵母膏添加量对菌株生长影响的测定 在培养液中分别加入酵母膏,令其质量分数分别为0100、 0105、0110、0115、0120、0125、0130 g/L。 (6)培养基正交试验 根据预备试验,设计5因子4水平的正交试验(表1),在温度30e,3 000 lx光 照条件下进行培养基的正交试验。 #72# 长江大学学报(自科版)2005年8月第2卷第8期/农学卷第25卷第3期 Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit)Aug. 2005 Vol12 No18 /Agri Sci V, Vol125 No13表1 培养基正交试验因素水平 Table1 Factor levels of orthogonal experiment of the culture mediag/L 水平A 氯化铵 B 磷酸氢二钾 C 乙酸钠 D 碳酸氢钠 E 酵母膏 1 015 011 210 015 0105 2 110 012 310 110 0110 3 115 013 410 115 0115 4 210 014 510 210 0120 2 结果与分析 2.1 菌株形态特征及培养特征 共分离纯化菌株5株,记为M-01、M-02、M- 03、M-04、M-05,均为棕红色菌落,培养特征类 似,M-01株生长速度较快,以其做以下试验。 菌株M-01幼龄呈短杆状,不形成丝状体,细 胞大小(016~019)Lm@(112~210)Lm。芽生 分裂,分裂时产生哑铃状的菌体。鞭毛染色,可见 极生鞭毛。 在光照厌氧液体培养中繁殖速度快,培养液 起初呈浑浊状,淡黄色,后来逐渐出现絮状物,转变为浅红色,最后呈深红色。在琼脂平板上菌落呈圆形, 边缘整齐,表面凸起,光滑湿润,棕红色。 2.2 菌株的最大吸收波长 图1为光合细菌活细胞的吸收光谱。由图1可见,活细胞的吸收峰位于380、500、535、590、805、860 nm等处,最大吸收波长为380 nm。光合细菌在380、805、860 nm处具有吸收,表明光合细菌含有细菌叶 绿素a,在500、590、535 nm处具有吸收,表明光合细菌的活细胞中还含有类胡萝卜素[10]。活细胞吸收峰 值表明M-01具有光合细菌典型吸收特征。 图1 光合细菌活细胞吸收光谱 Figure1 The optical density of M-01living cells 2.3 菌株的鉴定 根据上述试验结果,又依据红假单胞菌属Rhodopseudomonas的形态、生理生化特征[10],初步确认菌株 M-01为红假单胞菌属Rhodopseudomonas中的一种。 2.4 光照度对菌株生长的影响 图2为不同光照条件下光合细菌M-01的光密度。由图2可见,在温度30e,3 000~5 000 lx时,该 光合细菌均保持旺盛的生长势头,在实验培养中发现,4 000~5 000 lx光照条件下生长迅速,菌液迅速转 红,但是细胞老化较快,易出现破碎细胞附壁现象,因而认为3 000 lx是该光合细菌的适宜光照度。 2.5 培养基中酵母膏添加量对其生长的影响 图3为不同酵母膏添加量时光合细菌M-01培养48 h的光密度。由图3可见,添加酵母膏对菌株生 长有明显的促进作用,但是当酵母膏添加量为011 ~ 013 g/L时,光合细菌培养48 h时菌液光密度值差 别不大,由于酵母膏同时有促进其它菌类生长的作用,为减少杂菌污染的机会,结合生产中降低成本的要 求,笔者认为酵母膏添加量为0110 ~ 0115 g/L是合适的。 #73#农学卷第25卷第3期操玉涛等:光合细菌M-01的分离及培养条件研究 图2 光合细菌M-01在不同光照度下的光密度 Figure2 The optical density of the photosynthetic bacteria M-01 图3 不同酵母膏添加量时M-01培养48 h的光密度 Figure3 The optical density of48h M-01liquid with different yeast paste contents 表2 正交试验结果 Table2 The results of orthogonal experiment 编号 各因素水平 氯化铵 A 磷酸氢二钾 B 乙酸钠 C 碳酸氢钠 D 酵母膏 E D660 nm 1 1 1 1 1 1 01189 2 1 2 2 2 2 11670 3 1 3 3 3 3 11584 4 1 4 4 4 4 11868 5 2 1 2 3 4 11513 6 2 2 1 4 3 11834 7 2 3 4 1 2 11050 8 2 4 3 2 1 21093 9 3 1 3 4 2 21068 10 3 2 4 3 1 21236 11 3 3 1 2 4 11229 12 3 4 2 1 3 11802 13 4 1 4 2 3 21381 14 4 2 3 1 4 21222 15 4 3 2 4 1 11765 16 4 4 1 3 2 11179 X 11538 11108 11316 11571 X 11990 11687 11843 11492 X 11407 11992 11628 11900 X 11736 11884 11884 11708 R01559 01583 01884 01568 01408 2.6 培养基优化 从表2极差R值可以看出,5因 素影响光合细菌生长的主次顺序是: C>B>D>A>E,因素C乙酸钠对光 合细菌生长的影响十分明显,因素E 酵母膏对生长的影响最小。根据表4 均值大小,最佳培养基配方组合为 A4、B2、C3、D4、E3,综合以上结果,本 试验菌株的最佳培养基配方及培养条 件为:氯化铵2 g,磷酸氢二钾012 g, 乙酸钠4 g,碳酸氢钠2 g,酵母膏011 g,硫酸镁012 g,氯化钠1 g,T1M储 液少量,蒸馏水1 000 mL,培养温度 30e,光照3 000 lx。 3 结论与讨论 光合细菌M-01在光照厌氧液体 培养中繁殖速度快,培养液起初呈浑 浊状,起初为淡黄色,以后转变为浅红 色,最后呈深红色。该光合细菌菌株 在30e连续光照条件下生长迅速,较 少发生附壁和产生细胞碎片,34e以 上时细胞附壁和产生细胞碎片明显增多,25e以下生长速度低,因此25 ~ 30e为较适宜的生长温度。 本试验分离的光合细菌M-01在3 000 lx左右的光照度下,很短时间即进入对数生长期,经过36 h, 菌液颜色棕红色,表现出了较高的生长活性。经过20亿年的进化,光合细菌已能在水圈生态系多个子生 态系中生活,表现出很强的适应能力,这与光合细菌代谢能力的多元化是分不开的,因此,不同生态环境中 的光合细菌对营养物质的利用必然存在差别. 本试验从红螺菌科光合细菌富集培养基[9]出发,得到了现有光合细菌菌株M-01的最适培养培养条 件,说明了对特定的种类而言,最适培养条件会有差异。在适宜的培养条件下,光合细菌可保持较好的生 #74# 长江大学学报(自科版) 2005年8月长活性,有利于生产及保藏。 [参考文献] [1]韩 梅,陈锡时,张 良,等.光合细菌研究概况及其应用进展[J].沈阳农业大学学报,2002,33(5):387 ~ 389. [2]朱章玉.光合细菌的研究及其应用[M].上海:上海交通大学出版社,1993.1~ 4. [3]马弈成.光合细菌在养鳗业中的作用与应用前景[J].中国水产, 1995,(11):22 ~ 23. [4]何振平,王秀云,孙学文,等.光合细菌的研究进展(综述)[J].河北职业技术学院学报,2000,14(1):69 ~ 72. [5]张新英,莫天砚,刘 斌.红假单胞菌的生理学特性研究[J].广西师范学院学报(自然科学版),2002,19(1):74 ~ 78. [6]张新英,莫天砚,刘 斌.红假单胞菌的分离及菌种保存试验研究[J].广西师范学院学报(自然科学版),2001,18(2):9 ~ 14 . [7]李 筠,许 兵,尹欣业,等.红假单胞菌的分离鉴定与生长特性[J].青岛海洋大学学报,1995,25(2):187 ~ 192 . [8]小林正泰.養魚H光合成细菌[J].養殖(日),1981,(8):56 ~ 59. [9]陈明耀.生物饵料培养[M].北京:中国农业出版社,1995.18 ~ 23. [10]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.28~29. (上接第68页) 水,保护细胞质胶体不致遇冷凝固,它的含量与植物的抗寒性之间呈正相关,同时,可溶性糖又是预防蛋白 质低温凝固的保护物质,可以提高植物的抗寒能力[7,8]。本研究结果(表2)暗示ABA和6-BA处理均能 在一定程度上增强芝麻抵抗低温逆境的能力。另一方面,高温40e下,用ABA和6-BA处理后的各品种 芝麻幼苗与常温(25e)比较可溶性糖的下降幅度较未用激素处理的对照组有明显减少,提示这两类生长 调节剂对提高芝麻抵抗高温逆境也有一定效应。 [参考文献] [1]沈镇昭.作物栽培学各论[M].北京:中国农业出版社, 1994.332~333. [2]张宪政.作物生理研究法[M].北京:农业出版社, 1992 .129~130.