超氧化物歧化酶的活性测定

人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。

用纯化的人超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）活性浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：720U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定连苯三酚自氧化法(邓碧玉，袁勤生，李文杰．改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J]．生物化学与生物物理进展．1991，18(2)：163) 一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-H++HO 222+O反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、 100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子(三)试剂(1) A ：Tris(三羟甲基氨基甲烷)0.2mol/L (121.14)：取24.228g 定溶至1000mL (2) B ：HCl (分析纯36-38％) 12当量：即12mol/L 取8.3mol/L 定溶至1000mL (3) 250mL A +200mL B 定溶至1000ml PH=8.3三、试验步骤 (一)酶液的制备(1)称取植物材料0.2g ，加50mmo·L -1的Tris-HCl 缓冲液(pH=8.3)1mL(分三次加) (2)2~4℃下研磨，12000r/m 离心15min ，制备粗酶液(每个样品设三个重复) (3)在25℃保温20min 的8mL50mmol/L(PH=8.3)Tris-Hcl 缓冲液中加入25℃预热的10µL 50mmol/L 的连苯三酚(对照管用10mmol/L 的Hcl 代替)先加酶液再加连苯三酚(二)酶活力的测定酶活性单位的定义：在1mL 反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50﹪的酶量定义为一个活性单位。

取两个石英比色杯(带盖)，按下表加入反应物试剂对照管样品管Tris-Hcl缓冲(pH=8.3) 8mL 8mL粗酶液－15μL连苯三酚溶液－10μLHCl 10μL －总量8mL 8mL从加入连苯三酚开始计时，迅速摇匀，使酶与底物充分反应,倒入比色杯，在752型分光光度计上每隔30s读取反应液的325nm处OD值，连续读6min。

实验14 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。

本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。

（三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml 避光保存。

三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

取 1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.05, 2支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应10min-~20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

SOD催化下述反应：2+2→+。

机体内的过量和不足均对机体不利，SOD 对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。

机体内的形成可分为生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些。

例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。

过量的如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生，生成有颜色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

超氧化物歧化酶（SOD）-NBT法（酶标仪48T）（1）检测原理：超氧化物歧化酶（SOD）（EC 1.15.1.1）在动植物、微生物和培养细胞体内广泛存在，其具有抗衰老、提高机体对多种疾病的抵抗力，能增强机体对外界环境的适应力。

本实验是NBT法测定SOD活性，NBT可以和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化产生的超氧化物阴离子(O2.-)反应产生有颜色物质，后者在560nm处有吸收；SOD 可清除O2.-，从而抑制有色物质形成；反应液颜色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

1①组织样本：取约0.1g组织（水分充足的样本可取0.25g），加入1mL提取液，在4ºC或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。

4ºC×12000rpm离心10min，取上清作为待测液。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测①可见分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。

②测定前将试剂一、三和四25℃水浴5min以上。

③试剂四每次加样前务必混匀，保证试剂的均一性。

④在1mL玻璃比色皿（光径1cm）中依次加入：【注】：1、若样本量较多，测定前可将试剂一、三和四按照240μL:60μL:320μL比例混成一个混合液（需依据当次检测的样本数量混合对应的试剂量），每管务必最后一步加620μL该混合液。

2、样本对照管*：提取后样本颜色较深的，一定要做此管，否则抑制率偏低，即SOD活性偏低。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。

超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。

（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。

在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。

按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。

酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。

2. 仪器荧光灯管。

离心机。

分光光度计。

pH计。

3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。

（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。

4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。

（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。

（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。

sod酶活标准
一、酶活定义
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）的酶活定义为：在一定条件下，每分钟内能转化一定量的底物，生成一定量的产物所需的酶量，称为该酶的酶活。

通常以U/mL或U/g表示。

二、酶活单位
在SOD的测定中，常用的酶活单位是U/mL或U/g。

U/mL表示每毫升样品中含有的SOD酶活单位，而U/g表示每克样品中含有的SOD酶活单位。

三、酶活测定
SOD酶活的测定方法通常采用化学比色法。

该方法基于SOD对O2-的歧化反应，通过观察反应过程中O2-的变化来计算SOD的酶活。

具体步骤包括：
1.制备待测样品；
2.设立空白对照组；
3.在一定条件下，将待测样品与O2-反应；
4.观察反应过程中O2-的变化，记录数据；
5.计算SOD酶活。

四、影响因素
SOD酶活的测定结果受多种因素影响，包括：
1.温度：高温会加速反应，但过高的温度可能导致SOD失活。

2.pH值：pH值的变化会影响SOD的活性。

3.底物浓度：底物浓度过高或过低都会影响SOD酶活。

4.样品保存：样品的保存条件和时间也会影响SOD酶活。

五、酶活力保持
为了保持SOD酶活的稳定性，需要注意以下几点：
1.低温保存：将SOD样品保存在低温条件下，如0-4℃。

2.避免反复冻融：避免SOD样品反复冻融，以免影响酶活。

3.及时测定：尽量在提取后及时测定SOD酶活，以免因长时间保存而影响酶
活。

抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。

2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。

3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。

该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。

二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。

常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。

2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。

3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。

三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。

目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。

2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。

植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。

下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。

一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。

2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。

3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。

4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。

二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。

2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。

3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。

4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。

三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。

2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。

3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。

4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。

Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0170规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体15 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体160 μL×1支2-8℃保存试剂三液体11 mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体0.5mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：使用前先离心再吹打混匀。

根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释10倍后使用，当天用完。

2、试剂四：根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释5倍后使用，当天用完。

产品说明：SOD（EC 1.15.1.1）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是重要的氧自由基清除剂，能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2。

SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-)，O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

WST8法测定SOD原理超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一种重要的抗氧化酶，它能够催化超氧阴离子（O2·-）的还原，将其转化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2），从而保护细胞免受氧化应激的损伤。

WST-8法是一种常用的测定SOD活性的方法，其基本原理如下：1.原理介绍： WST-8是一种水溶性的四磺基偶氮盐化合物，它可以通过酶促反应被还原为可溶性的有色产物。

WST-8法测定SOD活性的原理是，利用超氧阴离子的还原能力将WST-8还原为有色产物，通过测量产物的吸光度来间接测定SOD的活性。

该方法的优点是简便、灵敏、重复性好，适用于多种生物体系。

2.SOD活性测定步骤：（1）制备反应液：将WST-8溶液与辣根过氧化物酶（HRP）溶液按一定比例混合，得到WST-8/HRP工作液。

（2）制备样品：将待测的SOD样品进行适当的稀释，使其浓度在测定范围内。

（3）反应体系组装：将适量的WST-8/HRP工作液、稀释后的SOD样品和超氧化物发生剂（例如黄嘌呤核苷酸）按一定比例混合，得到反应混合液。

（4）反应过程：将反应混合液孵育在适宜的温度下，一定时间后终止反应。

（5）测定吸光度：使用分光光度计测定反应液的吸光度，一般在450 nm波长处测量。

吸光度的变化与SOD活性成正比。

3.原理解析： WST-8法测定SOD活性的关键在于超氧化物发生剂的选择和反应液中WST-8的还原反应。

超氧化物发生剂能够产生超氧阴离子，它们与SOD样品中的SOD发生反应，将超氧阴离子转化为氧气。

反应液中的WST-8分子能够被超氧阴离子还原为有色产物，产物的吸光度与WST-8的还原程度成正比，从而间接测定SOD的活性。

4.反应机理：超氧化物发生剂黄嘌呤核苷酸（Xanthine），在存在黄嘌呤氧化酶（XOD）的催化下，被氧气氧化生成尿酸和超氧阴离子。

超氧阴离子与WST-8反应，将WST-8还原为可溶性的有色产物。

sod实验报告
SOD实验报告
实验目的：通过测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性，探究不同条件对SOD活性的影响。

实验材料：
1. 超氧化物歧化酶（SOD）提取液
2. 超氧化物歧化酶（SOD）标准品
3. 丙酮
4. 磷酸盐缓冲液
5. 磷酸盐缓冲液-EDTA
6. 碳酸氢钠
7. 氯化铝
8. 硝酸银
9. 氢氧化钠
10. 乙酸钠
11. 乙醇
12. 硫酸
13. 硫酸铵
14. 硫酸钾
15. 氮气
实验步骤：
1. 提取SOD：将植物组织磨碎后加入磷酸盐缓冲液，离心后取上清液，再将上
清液加入磷酸盐缓冲液-EDTA中，再次离心后取上清液即为SOD提取液。

2. 测定SOD活性：将SOD提取液与标准品、丙酮、碳酸氢钠等混合后，通过测定吸光度来测定SOD的活性。

3. 影响因素的实验：分别在不同温度、pH值、金属离子浓度等条件下进行SOD活性的测定。

实验结果：
通过实验发现，SOD的活性受到温度、pH值、金属离子浓度等因素的影响。

在适宜的条件下，SOD的活性较高，而在不适宜的条件下，SOD的活性会受到抑制。

实验结论：
SOD在生物体内起着重要的抗氧化作用，其活性受到环境条件的影响。

通过对SOD活性的测定，可以更好地了解其在生物体内的作用机制，为进一步研究提供重要的参考依据。

结语：
本实验通过测定SOD的活性，探究了不同条件对SOD活性的影响，为进一步研究SOD的作用机制提供了重要的实验数据。

希望本实验能够为相关领域的研究工作提供有益的参考。

SOD测定方法SOD（超氧化物歧化酶）是一种抗氧化酶，主要作用是通过催化超氧自由基（O2-）的歧化反应，将其转化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2），从而保护细胞免受氧化损伤。

由于SOD在生理病理过程中起着重要作用，因此测定SOD活性对于研究氧化应激反应及疾病机制具有重要意义。

下面将介绍几种常见的SOD测定方法。

1.氧化还原法氧化还原法是目前应用较广泛的SOD测定方法之一、该方法基于SOD活性的表现为它能阻止自由基与还原型化合物（如亚硝酸钠）之间的反应。

通过测定反应体系中亚硝酸钠的降解速率可计算出SOD的活性。

这种方法简单易行，但可能受到其他抗氧化酶和化合物的干扰。

2.锰硞合成法锰硞合成法是一种经典的SOD测定方法，它利用SOD对超氧自由基的清除作用而催化锰硞的合成。

反应结束后，通过测定合成的锰硞的吸光度变化来计算SOD的活性。

这种方法比较准确，但操作较繁琐，不适合大规模高通量实验。

3.硝苯蓝法硝苯蓝法基于硝苯蓝的还原能力受SOD活性影响的原理。

在碱性条件下，硝苯蓝与NADH反应生成可溶性复合物，其吸光度与SOD的活性成负相关关系。

通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD的活性。

该方法操作简便，但对于抗氧化剂和金属离子敏感，可能会引起误差。

4.含乙酰亚胺百日咳法该方法利用含乙酰亚胺的百日咳试剂来测定SOD活性。

该试剂在碱性条件下能与过氧化氢反应，生成已知稳定的有色化合物。

SOD活性越高，生成的有色化合物越少，通过测定反应体系的吸光度变化可以计算出SOD 的活性。

该方法操作简单，结果可重复性好，但对于有机溶剂和金属离子敏感。

5.X-射线发射荧光法X-射线发射荧光法是一种新型的SOD测定方法。

该方法通过测定SOD 催化超氧自由基与荧光染料之间的作用，计算出SOD的活性。

这种方法灵敏度高，精度好，同时能够快速高效地测定多个样品，适用于大规模高通量实验。

综上所述，SOD的测定方法有很多种，选择适合自己研究的方法需要综合考虑测定条件、样本的特点以及所需的准确度和灵敏度等因素。