分子生物学基本技术

分子生物学基本技术

包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等

第一节 DNA的体外合成

一、DNA的化学合成（无要求）－亚磷酸三酯法

DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设 计制造的

合成的原理：

核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应

(1) 脱DMT游离出5′-OH 。(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。

上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸

二、聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。

一)PCR的基本原理

双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以 增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。

(二)典型PCR的反应体系

1.耐热DNA聚合酶：

耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶 ，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃。Taq酶的最适温度是72 ℃，较高温度下的DNA合成错误率较低。因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR 走向自动化。

纯化的Taq DNA聚合酶有5′→3′外切酶活性，而无3′→5′外切酶活性，无校对活性。因此在PCR中每2╳104个核苷酸中有可能掺入1个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶。

在100μL反应体系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5单位，酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少。Taq DNA酶可在-20℃贮存至少6个月

2. PCR反应的缓冲液：

PCR的缓冲液一般制成10×，含有：500m mol/L KCl;100m mol/L

Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2;0.1% 明胶。

使用时要稀释10倍。其中Tris-HCl可维持反应体系的pH，KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性，明胶可保护酶不变性失活，Mg2+能影响Taq酶的活性，影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+。

3.引物：

PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计一般遵循以下原则：

(1)引物长度 一般为15-30b，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物 。

(2)G+C含量 G+C含量一般为40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值应该协调，按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T) 估计引物的Tm值。

(3)碱基的随机分布 引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现。引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合。两引物之间也不应有互补性，尤其是避免3′端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降。

(4)引物浓度 引物的浓度一般为0.1-0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。

4.dNTP：

dNTP常用的浓度为20-200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误参入率，适当的低浓度会提高反应的精确度。另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合，也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。

5.模板DNA

模板可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、扩增后的DNA、cDNA等，RNA的扩增需要首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解基因组DNA，以提高产量。

PCR反应中模板加入量一般为102-105拷贝的靶序列。

6.温度循环参数

变性温度一般为在90-95℃。变性所需的时间取决于DNA的复杂性，一般用94℃ 30s对模板DNA进行变性，过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。引物的退火温度通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般55-80℃ 30s。延伸温度选在70-75℃之间，此时Taq酶活性最高。延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定，一般1 kb以内延伸1 min，更长的片段需相应延长时间。PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度，一般25-30次。循环次数越多，非特异性产物也越多

(三)PCR技术的扩展

典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面 ，较常用的技术扩展有：

1. “巢式”PCR(nested PCR)

先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR。第一次扩增所用引物称外引物(outer-primer)，第二次扩增作用的引物称内引物(inter-primer)。

进行“巢式”PCR可将外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，用外引物进行时，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增。这种PCR技术被称为“中途进退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。

“巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量模板的扩增。

2.复合PCR(multiplex PCR)

在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于多点突变性分子病的诊断。

3.不对称PCR(asymmetric PCR)

两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR。不对称PCR可制备用于核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等。

4.反转录PCR(reverse transcription PCR)

由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。

5.涂片PCR(slide-PCR)

直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序列的PCR检测。

6.反向PCR(inverse PCR)

扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。

7.锚定PCR(anchored PCR)

用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3′端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

8.修饰引物PCR

为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5′末端，当PCR完成后可对产物直接进行检则。

PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。

第二节 核酸的分子杂交

核酸分子杂交技术是分子生物中最常用的基本技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。

杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。

用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

核酸分子杂交技术被广泛应用于基因克隆的筛选和酶切图谱制作、基因组中特定基因序列的定量和定性检测、基因突变分析以及疾病的诊断等方面。它的应用也大大推进了分子生物学的迅猛发展，如基因芯片就是分子杂交技术进一步扩展的产物。

核酸的原位杂交有广阔的应用前景，但现时操作较繁，较易出现假阳性，故本节只介绍膜上印迹杂交。

一、探针的种类与选择

核酸分子探针可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等种类。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析。

1.基因组DNA探针

几乎所有的基因片段都可被克隆到质粒或噬菌体载体中，获得大量高纯度的DNA探针。

但在选择此类探针时，要特别注意真核生物基因组中存在的高度重复序列(如人类基因组中的Alu序列)。要尽可能使用基因的编码顺序(外显子)作为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序。

2.cDNA探针

cDNA中由于不存在内含子及其它高度重复序列，因此是一种较为理想的核酸探针。但cDNA探针不易获得，从而限制了它的广泛应用。另外，还须注意其中的poly(dT)产生的非特异性杂交问题。