利用微生物电池研究微生物在矿物表面电子传递过程

利用微生物电池研究微生物在矿物

表面电子传递过程

冯雅丽1）李浩然2）连静1）周良2）

1）北京科技大学土木与环境工程学院，北京1000832）中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100080

摘要利用微生物电池对微生物在矿物表面电子传递的过程进行了实验研究.结果表明：

Geobactermetallireducens还原Fe（OH）3过程中直接接触方式起着重要作用，而微生物在矿物表面吸附形成的生物膜是一个关键因素，生物膜的形成又是一个相对较长的过程；细胞在固体表面的吸附并成膜是一种重要的代谢途径，而电子传递中间体AGDS虽然能在初期有效加快还原速率，但是当细胞吸附完成后，其作用就不再显著了，说明微生物催化矿物氧化还原反应动力学受生物膜控制.加速微生物在矿物表面成膜及保持其稳定性是影响微生物浸矿速率的重要因素.关键词矿物表面；微生物；电子传递；生物膜；电子传递中间体；微生物电池分类号TD925.5；TD98.1；TD98.2收稿日期：20050728修回日期：20060316基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.20476009，No.20576137）；国家长远发展专项资助项目（No.DY105-04-01-08）；国家“973”计划资助项目（No.2003CB716001）作者简介：冯雅丽（1967—），女，副教授微生物催化MnO2-FeS2-H2SO4体系的好氧

和厌氧浸出实验表明，厌氧浸出速率明显高于好

氧浸出［1］，同时，镜检发现厌氧条件下吸附在氧

化锰矿物表面的微生物多于好氧条件下的微生

物［2］.微生物在浸矿过程中如何将电子传递给固

体氧化物的问题，一直是国内外学者研究的热点.在进行大洋多金属矿生物还原的研究中，设计了

一套微生物燃料电池体系［3］，利用生物燃料电池

模拟细胞表面电化学过程来研究微生物在矿物表

面传递电子的过程［4］.微生物电池体系不仅能克服Fe（OH）3还原

培养体系中的二次成矿等原因带来的干扰因素，

而且氧化还原速率可以直接通过外电路电流记

录，能准确、迅速地反应出微生物将电子传递给固

态的电子受体的过程.微生物电池能更详实地研

究直接接触方式和通过电子传递中间体方式对胞

外电子传递的影响［5］.

l实验材料与方法

微生物：Geobactermetallireducens，由中国

“大洋一号”考察船DY105-13航次在太平洋取得的沉积物中分离（大洋样品库提供），经多代培养驯化.培养基成分如下（1L）：KCl0.1g，NH4Cl0.2g，NaH2PO40.6g，NaHCO32.5g，Wolfe微量维生素混合液10mL，Wolfe微量矿物元素混合液

10mL，电子供体NaA （醋酸钠）10mmol，调

pH6.8!7.0.利用N2-CO2（80220，体积比）除去灭菌前培养基中的氧气后，分装入厌养培养管中，

121C灭菌15min，在厌养培养箱进行必要的转接等操作，整个过程严格厌养培养.电子受体

Fe（OH）3100mmol灭菌后加入，其他可选的最终

电子受体富马酸钠、Fe的螯合物Fe-NTA（氨三乙酸）须过滤灭菌后加入.培养温度为30C.微生物电池的构建：如图1所示，由阴极、阳极两个电极室构成，通过质子交换膜（Nafion-117，D pont）连接，每个电极室装入溶液体积

250mL.电极均为不抛光的高纯石墨电极.物理表面积75 m2，使用前用1molHCl浸泡去处杂质离子，使用完后再用1.0mol・L-1的NaOH浸泡以除去其表面吸附的细胞.阳极接种细菌，接种前通N2-CO2（80220，体积比）混合气除尽装入的培养基的氧气，接种后密封或者缓慢通混合气.阴极持续通空气，保持其内溶解氧的浓度.两极室均缓慢搅拌.Fe2+及Fe3+浓度的测定：Ferrozine法；电池阳极内细胞浓度测定：考马斯亮兰法（Bradford法）测细胞破碎后对应蛋白质浓度；电流采集：瑞博华生产的8201H型数据采集器，16位，32通第28卷第ll期2006年ll月北京科技大学学报JournalofuniversityofscienceandtechnologyBeijingVol.28No.ll

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Nov.2006道，采集精度0.1mV.

图1微生物燃料电池体系示意图Fig.1Schematicdiagramofthemicrobialfuelcellsystem

实验原理：实验体系中（图2），通过导线连在

一起的两个石墨电极，其中一个浸没在饱含氧气

的溶液中（阴极室），另一个在浸没在厌养环境下

的培养基中（阳极室）.这样连在一起的两个电极

和固态金属氧化物，对研究微生物利用固态电子

受体的问题来说有很强的相似性：两者都是固态

的最终电子受体，细胞失去电子传递给金属氧化

物和石墨电极，金属氧化物得到电子后被还原，两

个电极依次得到电子后，最终传递给阴极室内的

溶解氧，溶解氧被还原，与由质子交换膜传过来的

氢离子结合形成水.上述过程是细胞呼吸过程中

完整的电子传递链的最后环节，细胞从该呼吸过

程中获得生长、繁殖所需的能量［6-7］.

图2微生物电池工作原理Fig.2Principleofthemicrobefuelcell

2实验结果与讨论

2.1电子介体AODS对异化还原Fe（OH）3速率的影响分别在两个厌氧培养箱中加入培养基、10mmol醋酸、100mmolFe（OH）3灭菌，再接入

Geobactermetallireducens.一个加入50mmol电

子介体AODS（9，10-蒽醌-2，6-磺酸钠），另一个

不加.在培养箱中进行对照实验，考察AODS对

Fe（OH）3异化还原速率的影响，发生如下反应：

Fe（OH）3+CH3COOH-!微生物Fe2++CO2（慢）

（1）

AODS+CH3CHOOH-!微生物AHODS+CO2（快）

（2）

AHODS+Fe（OH）!3AODS+Fe2+（快）

（3）

如图3所示，接种后短时间内，电子传递中间

体AODS可以加速Fe（OH）3还原（如式（2）和

（3））；但长时间看，效果不明显.这是由于在

Fe（OH）3还原体系中，还原形成的Fe2+离子会与

Fe（OH）3二次成矿形成一种类似Fe3O4黑色有磁

性的物质，覆盖在Fe（OH）3颗粒表面，阻止细胞

对Fe（OH）3颗粒的进一步还原（式（1））.

图3在厌氧培养箱中GeObactermetallireducens利用醋酸作电子供体还原Fe（OH）3Fig.3GeObactermetallireducenswithacetateaselectrondonortoreduceFe（OH）3inananaerobicincubator

如果反应初期加入AODS，会大量累积Fe2+离子，迅速在颗粒表面形成黑色顺磁性的物质，在

细胞完全吸附之前，大部分Fe（OH）3颗粒已被黑

色顺磁性物质包围，不能再被还原.而在不加入

AODS的培养基中，随着细胞的缓慢生长，Fe2+同步形成，虽然最后同样只能还原一部分Fe（OH）3，由图2看出，还是较加入AODS的体系还原量要多.Fe（OH）3颗粒较小，而且多了一个阻滞

Fe（OH）3还原的干扰因素，给进一步的研究

Fe（OH）3还原过程带来了困难.

2.2微生物直接吸附对微生物燃料电池的影响

微生物电池可以克服上述实验的干扰因素，・0101・北京科技大学学报2006年第11期通过检测电流判断微生物异化还原的过程.先用

Fe（OH）3作最终电子受体，让细胞适应固态的电

子受体，再将其转入富马酸钠作最终电子受体的

培养基中，最后转接入微生物电池中.电池环境

中惟一的电子受体就是石墨电极.细胞代谢醋酸

盐的过程中，细胞膜外累积的还原型细胞色素失

去电子给阳极石墨棒，电子再通过外电阻达到阴

极石墨，阴极的溶解氧最终得到电子，被还原生成

水［8］.电极反应如下：

阳极，

CH3COOH-+H2O!微生物CO2+H++e-（4）

阴极，

O2+e-+H!+H2O（5）

其中，阳极室产生的H+通过质子交换膜可以达

到阴极室，与还原的氧反应生成水.实验表明阳

极反应中，作为电子供体的醋酸盐，可能是因为还

参与了体内其他的代谢过程，或者反应不完全，只

有约70%的电子可通过外电路回收.由图4可知，从零时刻接种到电流达到一个

稳定的平台，需要一个很长的时间.而如图5所

示，若电池长时间反应后，用新的培养基替换阳极

溶液，保留原来的电极，不仅不需要再接种细胞，

而且可迅速达到原来的电子传递速率.图6表

明，若电池长时间反应后醋酸盐消耗完了，注入醋

酸盐溶液后，也能迅速回到原来的电子传递水平.这些现象表明，Geobactermetallireducens在利用

固体的石墨电极作最终的电子受体时，真正起主

导作用的是长时间反应后逐渐生长、吸附在电极

上的细胞，这些细胞通过自身的分泌物相互连接，

形成致密的生物膜，如图7和图8.

图4利用Geobactermetallireducens构建的生物电池产生电流情况Fig.4GenerationelectricitysituationoftheGeobactermetal-lireducensfuelcell

由图5和图6可知，达到稳定电流平台的时图5微生物燃料电池运行一段时间后，更换培养基和加入lmmol醋酸盐电流恢复情况Fig.5Currentrecoveryofthemicrobefuelcellafterafewminutesoperationwhenmediumwasremovedandreplacedandwhenlmmolacetatewasadded

图6醋酸盐消耗完后补充lmmol醋酸盐微生物燃料电池电流恢复情况Fig.6Currentrecoveryofthemicrobefuelcellafteracetatewasexhaustedandwhenlmmolacetatewasadded

图7微生物燃料电池阳极表面生物膜形成的扫描电镜图Fig.7SEMofbio-filmontheanodesurfaceofthemicrobefuelcell

间是微生物吸附在电极上逐渐形成成熟生物膜所需的时间，电流的大小受生物膜的影响.同样，微生物还原金属氧化物时，开始时速度很慢，是因为微生物还处在慢慢生长、吸附的过程中，一旦生物膜成熟，还原速度会达到一个稳定的较高值.当一个微生物电池长时间运转后，阳极室内代谢副产物大量累积，悬浮细胞的密度变得相当大，一个・ll0l・Vol.28No.ll冯雅丽等：利用微生物电池研究微生物在矿物表面电子传递过程