袁媛-2010-牛血清白蛋白介导合成的金纳米簇用于活细胞荧光成像

Vol．31高等学校化学学报No．112010年11月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES2167～2172

牛血清白蛋白介导合成的金纳米簇用于活细胞荧光成像

袁媛1，2，4，何晓晓1，2，4，石慧2，3，4，王柯敏2，3，4，伍旭1，2，4，霍希琴2，3，4（1．湖南大学生物学院，2．化学生物传感与计量学国家重点实验室，3．化学化工学院，4．生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，长沙410082）

摘要以牛血清白蛋白介导合成金纳米簇，并利用荧光分光光度计、纳米粒度及zeta电位仪以及非变性聚丙烯酰胺蛋白质电泳对其进行了表征．结果表明，该金纳米簇不仅荧光信号较强，而且在不同pH值溶液中荧光稳定性好．在此基础上进一步考察了金纳米簇与宫颈癌细胞（HeLa）间的相互作用．结果表明，该金纳米簇可成功进入活细胞内，在最佳的培育时间和金纳米簇浓度条件下可达到较好的活细胞荧光标记效果，且在经过细胞固定化处理后仍保持其标记形态．关键词金纳米簇；活细胞；荧光标记中图分类号O657文献标识码A文章编号0251-0790（2010）11-2167-06

收稿日期：2010-04-16．基金项目：国家自然科学基金（批准号：90606003，20775021）、教育部创新研究群体项目、教育部科学技术重点项目（批准号：107084）、新世纪优秀人才支持计划（批准号：NCET-06-0697）和湖南省自然科学基金创新研究群体项目（批准号：10JJ7002）资助．联系人简介：王柯敏，男，博士，教授，博士生导师，主要从事化学生物传感技术及纳米尺度和分子水平上获取生物化学信息的研究．E-mail：kmwang@hnu．cn何晓晓，女，博士，教授，博士生导师，主要从事纳米尺寸上的生物分析化学研究．E-mail：xiaoxiaohe@hnu．cn

荧光标记技术是开展细胞生物学研究的重要手段之一，通过对目标物的标记并结合荧光显微成像技术可以实现细胞及亚细胞生命过程可视化的分析及监测［1～4］．近年来，荧光纳米颗粒由于具有高荧

光强度及强抗光漂白能力等特性而在细胞标记领域得到了广泛应用［5～8］．其中作为荧光纳米材料之一

的贵重金属纳米簇因具有粒径小及无毒性等特点而得到广泛关注．贵重金属纳米簇由几到几十个金属原子组成，其荧光性质随组成纳米簇的原子个数的增加而发生变化，最常见的为金和银纳米簇．在早期研究中，由于受到合成方法的限制，金属纳米簇量子产率普遍偏低，近年来已通过改进合成方法而使量子产率有了极大的提高［9～11］，并在细胞标记领域得到了一定应用．Yu等［12，13］利用银纳米簇开展了细胞表面荧光标记及细胞内荧光标记的相关工作；Lin等［14］将金纳米簇应用于固定细胞表面分子标记．然而金属纳米簇在细胞标记领域的应用还处于起步阶段，已有的报道多为固定细胞荧光标记，关于金纳米簇应用于活细胞荧光成像的研究报道还比较少．Xie等［15］报道了利用牛血清白蛋白介导合成红色荧光金纳米簇，合成过程温和无毒，且产物量子产率有较大提高．本文对该金纳米簇用于活细胞荧光成像的可行性进行了初步探讨．

1实验部分

1．1试剂与仪器

牛血清白蛋白组分五（BSA，Roche公司）；氯金酸（国药集团化学品有限公司）；无血清无酚红RPMI1640培养基（Gibco公司）；胰蛋白酶消化液（0.5%胰蛋白酶与0.02%EDTA等体积混合）；其它

试剂均为国产分析纯；人宫颈癌细胞（HeLa细胞，由生物纳米与分子工程湖南省重点实验室细胞中心提供）．FACScalibur型流式细胞仪（美国BD公司）；FV500-IX70型激光共聚焦显微镜（Olympus公司）；F4500型荧光分光光度计（日本Hitachi公司）；Imagescanner扫描仪（AmershamBioscience公司）；活体

影像系统（美国Maestro公司）；Nano-ZS型纳米粒度及zeta电位仪（英国Malvern公司）．1．2金纳米簇的合成

金纳米簇的合成参照文献［15］方法进行，具体步骤如下：将5mL氯金酸溶液（10mmol/L，37℃）加入到5mLBSA溶液（50mg/mL，37℃）中，混合均匀，加入0.5mL1mol/LNaOH溶液，将混合液置于37℃摇床温育60h后形成金纳米簇．1．3金纳米簇的表征

1．3．1金纳米簇的荧光光谱表征及其pH荧光稳定性考察在470nm光激发下扫描了BSA溶液，得

到BSA和氯金酸混合溶液及金纳米簇溶液的荧光发射光谱；并进一步对金纳米簇的激发光谱及发射光谱进行测量．利用HCl或NaOH配置不同pH值的水溶液，并用其配制等浓度金纳米簇溶液，在470nm光激发下记录其荧光发射光谱并进行比较以考察荧光稳定性．1．3．2金纳米簇动力学半径表征将金纳米簇或BSA分散于超纯水中，并用纳米粒度及zeta电位仪

表征其动力学半径．1．3．3金纳米簇的蛋白质电泳表征非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤如下：凝胶由7.5%分离

胶（凝胶储备液2.5mL，4×分离胶缓冲液2.5mL，超纯水5mL，10%过硫酸铵50μL，TEMED10μL）及4%浓缩胶（凝胶储备液0.53mL，4×浓缩胶缓冲液1mL，超纯水2.44mL，10%过硫酸铵

30μL，TEMED5μL）组成，待凝胶完成后，每孔上样量为10μg蛋白（BSA或金纳米簇）．电泳时，浓

缩胶电压为80V，分离胶电压为120V．电泳完成后进行荧光扫描成像和考马斯亮蓝染色成像．1．4金纳米簇在活细胞荧光成像中的应用

1．4．1金纳米簇浓度、培育时间及细胞固定化处理对细胞荧光成像效果的影响将HeLa细胞接种于

细胞培养皿或24孔板中，待其融合率达到70%～80%时，将HeLa细胞用含有不同浓度金纳米簇（40，60和80mg/mL）的无血清RPMI1640培养基于37℃，5%CO2细胞培养箱中培育3h，用激光共聚焦

显微镜观察（488nm激光激发，收集560nm以后荧光信号），或将细胞消化后分散于PBS中用流式细胞仪分析．将HeLa细胞在含有80mg/mL金纳米簇的无血清RPMI1640培养基中分别培育1，2和3h，用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪分析其荧光信号．固定化处理对金纳米簇成像效果影响的考察：将细胞与80mg/mL金纳米簇共同培育3h后，吸去多余金纳米簇，并用冷PBS洗涤3次，加入2%多聚甲醛于冰上固定15min，用激光共聚焦显微镜分析其荧光信号．1．4．2金纳米簇在活细胞中荧光强度随时间的变化情况将HeLa细胞与80mg/mL金纳米簇共同培

育3h，吸去含金纳米簇的培养基并用PBS洗涤2次，加入含12%小牛血清的新鲜培养基继续培育1，2，3和6h，用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪分析其荧光信号．1．4．3金纳米簇在蛋白酶溶液中的荧光稳定性将一定量的金纳米簇分散于胰酶溶液中，于37℃培

育不同时间后取出部分溶液，在470nm光激发下记录荧光发射光谱并进行比较，考察蛋白酶的存在对金纳米簇稳定性的影响．

2结果与讨论

2．1牛血清白蛋白介导合成金纳米簇的表征

2．1．1荧光光谱特性测定了BSA溶液、BSA与氯金酸混合溶液和金纳米簇溶液的荧光发射光谱，结果显示，在470nm光激发下，金纳米簇有明显的荧光发射峰，而单纯的BSA溶液及BSA与氯金酸混合溶液均没有荧光发射［图1（A）］，表明已成功地合成了金纳米簇．激发及发射光谱［图1（B）］显示，金纳米簇具有2个荧光激发峰，分别位于370及490nm，最大发射峰为610nm．进一步考察了金纳米簇在不同pH值下的荧光发射情况，结果见图1（C）．由图可见，在pH=3～9之间，金纳米簇的荧

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Vol．31光发射光谱及荧光强度没有明显变化，因此金纳米簇适于在不同pH值条件下应用．

Fig．1FluorescentspectraofBSA（a），mixtureofBSAandchlorauricacid（b）andgoldnanoclusters（c）（A），excitation（a）andemission（b）spectraofgoldnanoclusters（B）andfluorescenceintensitiesofgoldnanoclustersatpH=3—9（C）2．1．2动力学半径及蛋白质电泳表征纳米粒度及zeta电位仪表征结果（图2）显示，BSA动力学半

径为（1.553±0.305）nm，金纳米簇动力学半径为（4.742±1.389）nm，与单纯BSA相比明显增大．非

Fig．2SizedistributionofBSA（A）andgoldnanoclusters（B）Fig．3CharacterizedofPAGEofgoldnanoclustersbythecoomassiebrilliantbluestaining（A）andfluorescentimage（B）

变性聚丙烯酰胺蛋白质电泳结果显示，BSA有多条不同分子量的蛋白条带，最前端为BSA的主带，其它条带为BSA多聚体，金纳米簇条带则相对滞后，这是由于金纳米簇嵌合在BSA分子内使产物整体分子量与BSA相比有所增加所致［图3（A）］；在荧光成像条件下，BSA分子本身不发荧光，只观察到嵌合有金纳米簇的BSA分子［图3（B）］．由图3可见，金纳米簇经考马斯亮蓝染色后所显现的条带都具有荧光，表明合成过程中蛋白质发生聚集，产物中存在BSA多聚体稳定的金纳米簇，其分子量不单一．2．2金纳米簇用于活细胞荧光标记成像

Fig．4EffectsoftheconcentrationsofgoldnanoclustersonHeLacelluptakecharacterizedbyconfocalmicroscopyConcentrationofgoldnanoclusters/（mg·mL－1）：（A）0；（B）40；（C）60；（D）80．

2．2．1用于活细胞荧光标记成像的可行性金纳米簇能够进入细胞是进行细胞成像的先决条件，因

此考察了金纳米簇浓度及与细胞共培育时间对细胞吞噬的影响，结果如图4～图7所示．可见，细胞中

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