Survivin基因沉默对结直肠癌PTTG mRNA的影响

Survivin 基因沉默对结直肠癌PTTG mRNA 的影响史美龙（吉林省人民医院基本外科，吉林长春130021）〔摘要〕目的探讨重组载体介导的Survivin 小干扰RNA （siRNA ）对人结肠癌细胞株Lovo 中PTTG mRNA 的影响。

方法前期成功构建的Survivin 特异性siRNA 真核表达载体转染结肠癌Lovo 细胞后，采用实时荧光定量PCR 检测PTTG mRNA 的表达水平。

结果Survivin 基因沉默后24 72h ，与正常对照组相比，Survivin mRNA 表达明显降低（P ＜0.05）；基因沉默24和48h 后，pGenesil -2-Survivin 1组和pGenesil-2-Survivin 2组PT-TG mRNA 表达显著低于正常对照组（P ＜0.05）。

结论Survivin 基因沉默后结直肠癌细胞PTTG mRNA 表达显著下调，提示Survivin 和PTTG 可能相互促进共同参与结直肠癌的发生发展。

〔关键词〕结直肠癌；实时荧光定量PCR ；RNA 干扰；垂体瘤转化基因〔中图分类号〕R657.1〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2301-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.041The expression of PTTG mRNA following Survivin gene silencing in colorectal cancerSHI Mei-Long.General Surgery Department of Jilin Provincial People's Hospital ，Changchun 130021，Jilin ，China【Abstract 】Objective To explore the expression of pituitary tumors transformed gene （PTTG ）mRNA following Survivin gene silen-cing in colorectal cancer cell line Lovo.Methods The Survivin siRNA expression vector and empty expression vector were transfected into Lovo cells by liposome 2000.After the transfection ，the Survivin and PTTG mRNA levels were detected using real-time PCR.Results Theexpression of Survivin mRNA was decreased significantly at 24，48，and 72h after Survivin gene silencing with siRNA.Similarly ，the PTTG mRNA level was decreased following the transfection with pGenesil-2-Survivin 1and pGenesil-2-Survivin 2（P ＜0.05）.Conclusions Theexpression of PTTG mRNA is decreased obviously following Survivin gene silencing in colorectal cancer cell line ，indicating Survivin-PTTGinteraction might contribute to the development of colorectal cancer.【Key words 】Colorectal cancer ；Real-time PCR ；siRNA ；Pituitary tumors transformed gene （PTTG ）基金项目：吉林省科技厅国际合作项目（No.20100753）第一作者：史美龙（1968-），男，主任医师，医学硕士，主要从事胃肠及肝胆肿瘤及相关疾病研究。

Survivin 基因属于凋亡抑制基因家族，Survivin 蛋白在人结肠癌组织以及细胞株中均显著高表达，与结直肠癌的发生发展、侵袭转移及血管形成有关，已成为具有潜在价值的肿瘤生物学标志物和肿瘤治疗的新靶点〔1，2〕。

本课题前期构建了靶向干扰Survivin 的小发卡RNA （shRNA ），并对Survivin 基因沉默后结直肠癌的生物学行为进行了评价，发现其能够明显抑制结直肠癌细胞增殖〔3，4〕。

在前期研究工作的基础上，本研究利用已经构建成功的重组载体，探讨Survivin 基因沉默后垂体瘤转化基因（PTTG ）mRNA 的表达，旨在为阐明Survivin 在结肠癌发生发展中的作用及基因治疗的应用方面提供理论依据。

1材料与方法1.1主要试剂结直肠癌Lovo细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所。

RPMI1640培养基购自Gibco公司，转染试剂脂质体lipo2000购自Invitrogen公司，质粒小提试剂盒购自Pro-mega公司。

重组质粒pGenesil-2-对照（非同源干扰序列插入pGenesil-2）和pGenesil-2-Survivin1（插入靶向Survivin基因5'-GGACCACCG CATCTCTACA-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体）以及pGenesil-2-Survivin2（插入靶向Survivin基因5'-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体）由本实验室构建。

1.2质粒抽提将本实验构建的重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin1和pGenesil-2-Survivin2接种于50ml LB 培养液中，37ħ、250r/min振摇培养16h。

运用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，按照试剂盒说明书进行。

1.3细胞转染运用含10%胎牛血清在37ħ、5%CO2培养箱中培养Lovo细胞。

将细胞接种于6孔板中，接种密度约为5ˑ105个/孔。

运用脂质体Lipo2000转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin1和pGenesil-2-Survivin2，转染方法按照Lipo2000说明书进行。

1.4实时荧光定量PCR于转染后0、24、48和72h收集细胞，运用Trizol法按照操作说明书提取总RNA（购自北京百泰克生物科技有限公司），运用反转录试剂盒（购自Fermentas公司）逆转录为cDNA，－20ħ保存。

特异性引物用于实时荧光定量PCR检测Survivin和PTTG的表达。

Survivin引物：上游：5'-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3'；下游：5'-GCAGTGGAT-GAAGCCAGCCT-3'，产物片段长度为185bp。

PTTG引物：上游：5'-AGTTTCAACCACGTTTTGGC-3'；下游：5'-CTTTTCAAGCT CTCTCTCCT-3'，产物片段长度为352bp。

管家基因GAPDH引物，上游：5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3'；下游：5'-GAGAAGGCTGGGG CTCATTT-3'，产物片段长度为195bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。

20μl反应体系中含cDNA样品2.0μl，SYBR Premix Ex Taq TM（2ˑ）10.0μl，上、下游引物（20pmol/μl）各0.2μl，去离子水补足20μl。

Eppendorf实时荧光定量PCR仪上设置95ħ预变性10min，95ħ变性15s，60ħ延伸60s，共40个循环。

以GAPDH为内对照。

将cDNA液按101、102、103和104、105梯度稀释后，各取2μl进行实时荧光定量PCR反应，检测目的基因和GAPDH的扩增效率，Ct值为荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。

ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（GAP-DH）。

采用比较循环阈值法（2－ΔΔCt）分析样本中Survivin和PTTG的相对含量〔5〕。

具体计算方法如下：以加入Lipo2000转染试剂组作为正常对照，分别将转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin1和pGenesil-2-Survivin2与正常对照组做比较，得倍数为N（N=2－ΔΔCt），其中ΔΔCt=ΔCt（重组质粒）－ΔCt（正常对照）。

1.5统计学处理数据用xʃs表示，采用SPSS19.0统计软件包处理数据，各组之间的差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

2结果2.1实时荧光定量PCR标准曲线制作及Ct值测定实时荧光定量PCR扩增目的基因和内参基因cDNA片段，荧光量的增长曲线符合标准的“S”形荧光增长曲线，3个复孔实时荧光值曲线拟合良好，指数增长期的起始点即循环阈值（Cycle thresh-old，Ct）接近，阴性对照Ct值趋于0；熔解曲线集中，峰值高尖平滑，表明实验反应体系稳定，模板分配均匀，引物无二聚体形成，结果可靠。

以不同起始浓度模板（分别为101、102、103、104、105）制作标准曲线，线性关系大于98%，扩增效率均大于95%，可以用2－ΔΔCt法对比Survivin和PTTG mRNA在不同组的表达差异。

2.2Survivin和PTTG mRNA在不同组的表达Lovo细胞转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin1和pGenesil-2-Survivin2后，Survivin mRNA表达情况见表1，PTTG mRNA表达情况见表2。

Survivin基因沉默后24 72h，与正常对照组相比，Survivin mRNA表达明显降低（P＜0.05），表明干扰效果可以满足实验需要。

Survivin基因沉默后24 72h后，PTTG mR-NA表达较相同时间点正常对照组均呈现下调趋势，其中，24和48h后，pGenesil-2-Survivin1组和pGenesil-2-Survivin2组PTTG mRNA表达显著低于正常对照组（P＜0.05）。

表1各组转染后不同时间Survivin mRNA表达情况（xʃs，n=6）组别0h24h48h72h正常对照组 1.00 1.00 1.00 1.00 pGenesil-2-对照组 1.03ʃ0.17 1.01ʃ0.15 1.07ʃ0.20 1.01ʃ0.19 pGenesil-2-Survivin1组1.03ʃ0.070.15ʃ0.051）0.14ʃ0.071）0.28ʃ0.101）pGenesil-2-Survivin2组1.03ʃ0.040.16ʃ0.081）0.16ʃ0.051）0.28ʃ0.101）与正常对照组比较：1）P＜0.05；下表同表2各组转染后不同时间PTTG mRNA表达情况（xʃs，n=6）组别0h24h48h72h正常对照组 1.00 1.00 1.00 1.00 pGenesil-2-对照组 1.00ʃ0.130.94ʃ0.110.95ʃ0.100.97ʃ0.12 pGenesil-2-Survivin1组1.01ʃ0.120.45ʃ0.161）0.43ʃ0.151）0.72ʃ0.21 pGenesil-2-Survivin2组1.00ʃ0.120.53ʃ0.201）0.37ʃ0.171）0.71ʃ0.223讨论Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，是有丝分裂及程序性细胞死亡关键调节因子，其功能不仅局限于抑制细胞凋亡，而且能够调节有丝分裂的纺锤体关卡，参与肿瘤血管形成及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。