青霉素发酵生产工艺

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染菌是发酵工业长期以来不能彻底解 决的问题，因此如何解决染菌问题就成了 发酵工业的工作重点之一。要解决染菌问 题首要问题就是要能检测出是否染菌。 染菌通常通过三个途径发现：无菌试 验，发酵液直接镜检，发酵液的生化分析。 其中无菌试验是判断染菌的主要依据。
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• 染菌在发酵过程的每个阶段都可能发生，下面就 各个不同的阶段的染菌情况和处理办法一一说明。
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菌种的扩大培养
• 通过自然育种、诱变育种等方法，挑选出高产、稳定、高效价菌种。
• 产黄青霉 → 斜面孢子（25°C，孢子培养，7d） → 大米孢子（26°C，孢子培养，56h） → 一级 种子培养液（27°C，种子培养，24h） → 二级 种子培养液（27~26°C，发酵，7d）。
• 种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的 生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。青霉 素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。 • 种子罐的目的是使接入有限的孢子迅速发芽、生长、繁殖成大量菌 体。 其中的培养基组分包括碳源（蔗糖）和氮源（玉米浆），及无机 盐（碳酸钙）等。 • 将一级培养中得到的生命力旺盛、染色深、菌丝粗壮，无杂菌及异常 的菌体接种至发酵罐进行二级种子培养。 接种量一般在10%～20%。
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（4）前体：
前体的加入是青霉素发酵的关键问题之一。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用， 将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度。 但 苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。也有采用苯 乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸 结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消 沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。 前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中 控制在50µg/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生 物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在
• 其对革兰阳性菌有效，由于革兰阴性菌缺 乏五肽交连桥而青霉素对其作用不大。
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青霉素的临床应用
• 青霉素临床上用于治疗葡萄球菌传染症如 脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，溶血性链球 菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、 淋病、梅毒和炭疽等。
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青霉素发酵生产工艺流程
贾希蒙 涂晨晓 冀振红
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青霉素发酵生产工艺
⒈种子培养期染菌 ⒉发酵前期染菌 ⒊发酵中期染菌 ⒋发酵后期染菌
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青霉素的发酵过程控制
1.基质浓度
2.培养基成分的控制 3.pH值、溶氧 4.温度 5.补料控制 6.泡沫的控制
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1.基质浓度 ： 在发酵过程中，常常因为前期基质量浓度过
高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生
0.1%为宜。
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3.pH ：
在青霉素发酵过程中，pH是通过下列手段控
制的：如pH过高，则添加糖、硫酸或无机氮源； 若pH过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素， 也可提高通气量。另外，也可利用自动加入酸或 碱的方法，使发酵液pH维持在6.8～7.2，以提高
青霉素产量。
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4.温度： 青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉 素的适宜温度是20℃左右，因此生产上采用变温 控制的方法，使之适合不同阶段的需要。一般一
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1940年，英国Florey和Chain进一步研 究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉 素制品。经实验和临床试验证明，它毒性 很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许 多疾病有卓越疗效。
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• 青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五 肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥 杀菌作用。青霉素的结构与细胞壁的成分 粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可 与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造 成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗 透屏障，对细菌起到杀灭作用。
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源自文库
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青霉素的发现
1928年，英国伦敦大学圣玛莉医学院 细菌学教授弗莱明在他一间简陋的实验 室里研究导致人体发热的葡萄球菌。由 于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的 琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的 一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来 的。使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌 的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶 然的发现深深吸引了他，他设法培养这 种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以 在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱 明据此发明了葡萄球菌的克星—青霉素。
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6.泡沫高度的控制： 在发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂来消泡。
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青霉素的工业提取方法
青霉素的工业提取常采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机 溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转 入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提 纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁 酯和戊酯。萃取2－3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择2.83.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8-7.2。为了避免pH波动， 采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。所得滤液多采用二次萃取，用 10%硫酸调pH2.8~3.0，加入醋酸丁酯。
抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制 , 苯乙酸的生长抑 制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合 成。 所以， 在青霉素发酵中通常采用补料分批操
作法 ，以维持一定的最适浓度 。
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2.培养基成分的控制 :
（1）碳源: 碳源的主要作用是为微生物菌种的生长繁殖提供
能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物
提供所需的碳成分。青霉素发酵中常用乳酸或葡萄
糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最为
便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。 目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流 加，以降低成本。
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（2）氮源:
氮源的作用是供应菌体合成氨基酸和三肽的原
料，以进一步合成青霉素。主要有机氮源为玉米
浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。
玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通 气及氧的传递，因而利用率较高。
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（3）无机盐： 碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵
液的pH值。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素 分子中所需的硫。由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵， 在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时间愈长， 则铁离子愈多。铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的 合成。因此青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重 金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。
级种子的培养温度控制在27±1℃左右；二级种
子的培养温度控制在25±1℃左右；发酵前期和 中期的温度控制在26℃左右；发酵后期的温度控 制在24℃左右。
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5.补料控制：
发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及pH外，补加 氮源也可提高发酵单位。经试验证实：若在发酵60～70h 开始分次补加硫酸铵，则在90h后菌丝含氮量几乎不下降， 维持在6%～7%，，且60%～70%的菌丝处于年幼阶段， 菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近30μl/（mg菌丝· h）， 抗生素产率为最高水平的30%～40%；而不加硫酸铵的对 照罐，在发酵中期菌丝含氮量为7%，以后逐级下降。至 发酵结束时为4%。发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量 为16μl/（mg菌丝· h），且抗生素产量下降至零，总产量 仅为试验罐的1/2。因此，为了延长发酵周期，提高青霉 素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。