土牛膝中齐墩果酸的正交提取工艺研究【摘要】目的正交优化土牛膝中齐墩果酸的提取工艺。方法采用单因素考察实验、正
交试验设计和高效液相色谱法，色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈：水=61：39；检测波长为10nm；流速为1ml/min；柱温为35℃的条件下对土牛膝中齐墩果酸的提取工艺进行研究。结果齐墩果酸在0.382-7.64μg范围内线性有良好线性关系，齐墩果酸标准曲线方程为：Y=530.76 X，r =1.0000。土牛膝中齐墩果酸最佳提取工艺为每1.0克土牛膝粉末用20ml的50%乙醇超声提取30min。结论该提取工艺简便、合理，可为土牛膝中齐墩果酸的制备及土牛膝的进一步开发利用提供参考。
【关键词】土牛膝；齐墩果酸；正交设计；HPLC；提取工艺
Study on orthogonal extraction technology of oleanolic acid from Achyranthes aspera L
Yanqiu Deng Sheng gao Yin* Lu Ying Huan Zhang
（1. Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi 530001）
Abstract：objective to optimize the extraction process of oleanolic acid from Achyranthes bidentata. Methods single factor investigation experiment，orthogonal design and high performance liquid chromatography were used. The extraction process of oleanolic acid from Achyranthes bidentata was studied at the column temperature of 35 ℃，the chromatographic column was Agilent Eclipse XDB-C18（250 × 4.6 mm，the mobile phase was acetonitrile：water 61：39，the detection wavelength was 10 nm，the flow rate was 1 ml / min，and the column temperature was 35 ℃. Results the linear range of oleanolic acid was 0.382-7.64 μ g，and the standard of oleanolic acid was obtained. The curve equation is 1. 0000. The optimum extraction process of oleanolic acid from Achyranthes bidentata is as follows：1. 0 g of Achyranthes bidentata powder is extracted with 50% ethanol of 20ml for 30 min. Conclusion the extraction technology is simple and reasonable and can be used as reference for the preparation of oleanolic acid in Achyranthes bidentata and the further development and utilization of Achyranthes bidentata.
Keywords：Achyranthes bidentata；oleanolic acid；orthogonal design HPLC；extraction process
土牛膝出自《本草图经》，别名杜牛膝。本文研究的土牛膝为苋科植物粗毛牛膝（Achyranthes aspera L．）的干燥根和根茎[1]。其具有活血散瘀，祛湿利尿，清热解毒之功效，主要用于淋病，血尿，经闭，风湿关节痛，脚气，水肿，痢疾，疟疾，白喉，痈肿，跌打损伤[2-3]。现代医学研究证明，土牛膝具有改善机体微循环，调整新陈代谢，改善免疫功能等作用；且具有明显的抗炎抗菌作用、镇痛作用、抗衰老等作用[4-6]。本文拟对土牛膝中的齐墩果酸进行正交提取工艺研究，具体如下：
1 实验试药与仪器
1.1 实验材料
本实验所用的土牛膝根和根茎于2015年采集于重庆樟县，经广西中医药大学药学院廖月葵高级实验师鉴定为苋科植物粗毛土牛膝Achyranthes aspera L．的根和根茎；齐墩果酸对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130425，纯度：HPLC≥98%）。
1.2 实验仪器
L600台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科
学仪器有限公司）；HWS-2l电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司），Agilent-No.7（1260）（Agilent美国安捷伦）；等等。
1.3 试剂与溶剂
乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限
公司）；去离子水（实验室自制），其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称取干燥恒重的齐墩果酸19.1mg，转移至25mL容量瓶中，加适量水溶解，加水稀
释至刻度，摇匀，配成浓度为0.764mg/mL的齐墩果酸标准溶液，备用。
2.2 供试品溶液制备
取土牛膝药材粉末约1.0g（过50目筛），精密称定，置锥形烧瓶中，加入30%乙醇
20ml，称定重量，静置0.5h后超声处理1.5小时，用乙醇补足重量，移入离心管中离心
30min，上清液以乙醇定容至25ml，取1ml，加入20%盐酸10ml，称定重量，超声处理1小时，以乙醇补足重量，离心，上清液水浴烘干，以甲醇定容至10ml，摇匀，取1ml试液离心15min（转速13000rpm），即得供试品溶液。
2.3色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈：水=61：39 检测
波长：210nm；进量体积：10μl；流速：1ml/min；柱温：35℃。
2.4 系统适应性试验
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如
图1至图2所示。结果表明：齐墩果对照品出峰处无干扰。
图2 土牛膝样品高效液相色谱图
2.5 标准曲线绘制
分别精密吸取齐墩果酸对照品溶液（0.764mg/mL）0.5、1、2、3、5、10μl，注入液相色谱仪，按上述2.3项下的色谱条件测定峰面积，以峰面积 Y 对进样量X（μg）进行回归，得
标准曲线方程：Y = 530.76X，r =1.0000。表明齐墩果酸在0.382-7.64μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6提取溶液的考察
取1g土牛膝药材粉末（过24目筛），精密称定，分别置50ml的具塞锥形瓶中，分别
精密加入100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、30%乙醇、20%
乙醇、10%乙醇、纯水20ml，各提取溶剂均一式两份，称定重量，超声1小时，补足重量，
将上清液倒入离心管中离心30min，上清液移至25ml容量瓶中定容，精密吸取10ml置入锥
形瓶中，加入20%盐酸溶液10ml，称定重量，超声1小时，补足重量，摇匀，置入蒸发皿中，水浴烘干，以甲醇定容至10ml容量瓶中，摇匀，静置，取1ml，离心15min，即得供试品溶液。
实验数据表明30%、50%、80%三个浓度的乙醇提取土牛膝中齐墩果酸的效果较好，因
此选用这三种溶剂进行正交实验。
