细菌培养基的制备
一、实验设计思想
1春季传染病菌大多数为细菌，因此我们设计了细菌的培养基制备方案。
2通过制备的培养基可以对细菌进行鉴定。
3要对细菌进行药物研发，要了解细菌的生长条件，所以要设计制备培养基。
二、实验目的
1、明确培养基配制的原理及方法，了解培养基中各成分的作用；
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法；
3、学会包扎吸管、培养皿，制作棉塞；
4、了解细菌适宜的理化环境。
三、实验流程
按培养基配方称量----加热融化----调节pH到细菌最适值----分装与包装----高压灭菌----检查灭菌与否
四、实验原理
（一）培养基制备原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
微生物的六类营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水
碳源：一切能满足微生物生长繁殖所需碳元素的营养源。
氮源：凡能提供微生物生长繁殖所需氮元素的营养源。
能源：能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物质，或辐射能称为能源。
生长因子：是一类对调节微生物正常代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的微量有机物。
无机盐：无机盐或矿质元素主要可为微生物提供碳源、氮源以外的各种元素。
水：同一切生物一样，微生物的营养中不可缺少水。水是微生物细胞的主要化学组成之一。
微生物的营养类型：
光能无机营养型（光能自养型），光能有机营养型（光能异养型），化能无机营养型（化能自养型），化能有机营养（化能异养型）
（二）高压蒸汽灭菌原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅的隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
五、实验药品与器材
1、药品
琼脂，NaCl，水，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品；
2、仪器
具刻度1000毫升搪瓷量杯或小铝锅，电子天平，试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，药匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿，高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉，等
六、实验步骤
1.实验药品称量
牛肉膏,1.5g，蛋白胨5g，Nacl2.5g，琼脂10g，水500mL。
2.溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
3.调节pH值
借磷酸缓冲液进行调节----调节K2HPO4和KH2PO4两者的浓度比即可获得pH值在7.0~8.0之间的一系列稳定的pH值。
4.过滤与分装
先将过滤装置安装好，在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。固体分装装量为管高的1/5；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
5.高压灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：
（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端都不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121.3℃，20分钟灭菌。
（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱中培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
