遗传信息传递 (2)
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第五章 遗传信息的传递
第五节 外源基因表达体系
包涵体
概念：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞
内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。
形成原因：
1：目的蛋白表达量太高
2： 重组蛋白含硫氨基酸太多
3：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体
4：大肠杆菌异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累
降低包涵体形成的策略
降低诱导温度
降低诱导剂的剂量，延长表达时间
融合可溶标签
添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应，添加低分子
量的巯基或二硫化合物，添加NaCl
伴侣分子和折叠酶共表达
选择适宜表达的宿主和载体
使用基本培养基
融合蛋白的分离纯化——亲和层析
亲和层析--金属螯合层析介质
原理是蛋白质表面的组氨酸、色氨酸中的N能与过渡金属如Cu2+、Ni2+、 Zn2+、Co2+、Fe
3+
发生作用
上样时注意的问题：
样品溶解在pH5.5-8.5的缓冲液中
常用缓冲液有10-20mM磷酸钠盐缓冲液和50mM 醋酸钠缓冲液
提高缓冲液pH,可以增加载量,最大载量40mg/ml填料
缓冲液中不能含有EDTA、柠檬酸盐、也最好不含巯基乙醇等还原剂
缓冲液需要加入0.15-0.5M的NaCl,消除离子交换作用
如果不了解蛋白质的结合特性，建议先选用Zn2+
缓冲液中存在的去污剂不会影响蛋白吸附
洗脱时应注意的问题
pH洗脱：洗脱pH不能低于4
竞争洗脱：使用与金属离子有亲和力的物质，如0-0.5M咪唑，0-50mM组氨酸，0-2M NH4Cl
洗脱时缓冲液中应当带有0.15-0.5M NaCl以消除离子交换作用
脱落洗脱
EDTA、EGTA等金属螯合剂：能使所有蛋白洗脱下来，对蛋白没有纯化作用，使用完毕后
填料要再生。
填料在位清洗
去除因离子交换吸附的蛋白：用2-3倍柱床体积的2M NaCl淋洗柱子，
去除蛋白沉淀、疏水性蛋白：用2-3倍柱床体积的1M NaOH淋洗
去除疏水蛋白和脂质：用4倍柱床体积的70% 乙醇或30%异丙醇淋洗
在位清洗时可先反向再正向
填料再生
5-10倍柱床体积的50mM EDTA淋洗柱子
2-3倍柱床体积的0.5M的NaCl洗掉残留的EDTA
用2-3倍柱床体积的蒸馏水平衡柱子
选择合适的金属离子，用中性或弱酸性溶液配制成0.1-0.3M浓度，（如果是Fe3+必须在低pH
下螯合pH3，以防止Fe3+沉淀）
溶液过滤
用2-5倍体积的溶液上柱
用5-10倍体积的蒸馏水淋洗，去除未结合的金属离子
螯合Fe3+的色谱柱不能长时间在中性溶液中保存，建议每次用完后用EDTA除掉，下次使用
时重新螯合。
Glutathione-sepharose：耦合了谷胱甘肽，纯化带有GST（s-转移酶）标签的蛋白
Dextrin sepharose：纯化带有MBP标签的蛋白
Strep Tactin sepharose：纯化带有step（II）标签的蛋白
Chelating-sepharose：耦合亚氨双乙酸，可结合不同的金属离子
Protein A-sepharose, ProteinG-sepharose：抗体纯化
各种亲和层析标签的比较-His标签
分子量小，只有~0.84KD，一般不影响目标蛋白功能；
可在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，适于纯化疏水性强的蛋白和包涵
体蛋白
可用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；
His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。
可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；
可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
各种亲和层析介质的比较-GST标签
GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它
的天然大小为26KD。
高度可溶，可以利用它增加外源蛋白的可溶性。
它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。
GST融合表达可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。
结合的融合蛋白在温和、非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱，保留了蛋白的抗原
性和生物活性
标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。
GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变
性剂如：盐酸胍或尿素等。
PreScission protease切除GST
各种亲和层析介质的比较-MBP标签
MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为42.5kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码，主
要用于原核表达系统
通常放在目的蛋白N端
MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。
融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓
冲液中进行洗脱。
一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋
白则不受影响。
缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。
如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶Factor Xa, Genease, Enterokinase切除。
各种亲和层析介质的比较-FLAG标签
FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功
能、性质。
纯化为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。
FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA
等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK）。
8个氨基酸，大小1kD，不会影响蛋白折叠、功能，一般不需要切除标签
可用于真核生物表达
不结合抗生物素蛋白，可加入抗生物素封闭生物素的结合
洗脱条件为2.5mM脱硫生物素
在pH>7稳定
可以耐受500mM咪唑，His标签蛋白洗脱液可以直接上柱进行二次纯化
抗体亲和填料
选择合适的启动子和载体系统
1 带IPTG诱导启动子的表达载体
例如tac trc lac 启动子 (pUC,pTZ,pSK,pGEM等）
2 含T7噬菌体启动子的表达载体（例如pET系列载体）
外源基因表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控，具有氨苄或者卡那抗性
多克隆位点置于T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后。
3 带有噬菌体PL 启动子的表达载体（ pPLc系列 pKC30 等）
受温度敏感性阻抑物cIts857调控，低温时能抑制PL
驱动的转录，高温不能。
4 用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列
酶的诱导和阻遏操纵子模型
大肠杆菌乳糖操纵子模型
乳糖操纵子的降解物阻遏
pET系统
诱导剂：IPTG或乳糖
载体：pET系列
14b: Amp抗性，T7启动子，带有信号肽能被thrombin切除
24 a-d：Kan抗性，T7lac启动子，C端His-Tag
32a：Amp抗性，T7lac启动子， N 端Trx-Tag能增强蛋白的可溶性,中间和C端His标签，
蛋白酶thrombin ,enterokinase
思考：利用pET表达体系表达条斑紫菜的褐藻胶裂合酶
序列分析
载体选择
引物设计
基本流程
涉及方法的原理
BL21(DE)3: λ DE3 溶原菌
B834:为 BL21 的亲本菌株,甲硫氨酸营养缺陷型
AD494:硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确
折迭的活性蛋白的潜力。
Origami: 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶
( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。
Rosetta:从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。
BLR: 为 BL21 的 recA– 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或
其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的目标质粒。
HMS174 ： K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能
够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因
含pLysS 和 pLysE ：带有编码 T7 溶菌酶
（七）阿拉伯糖诱导系统
载体：pBAD/gIII(A,B,C)
宿主：TOP10
诱导剂：阿拉伯糖
N端带有信号肽，有His标签 和myc标签
