类黄酮激活根瘤菌在油菜上结瘤和固氮的研究初报

类黄酮激活根瘤菌在油菜上结瘤和固氮的研究初报*

胡小加**󰀁张学江󰀁(中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062)EdwardC.Cocking󰀁GordonS.Webster󰀁(诺丁汉大学生命科学系,诺丁汉NG72RD英国)Nodulationofflavonoid-stimulatedrhizobiaonoilseedrapeandnitrogenfixation.HuXiaojia,ZhangXuejiang(InstituteofOilCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences.Wuhan,430062),EdwardC.CockingandGordonS.Webster(DepartmentofLifeScience,UniversityofNottingham,NG7,2RD,UK).-Chin.J.Ap-pl.Ecol.,1999,10(1):127~128.Flavonoid-stimulatedrhizobiawereusedtoinoculatetheseedlingrootsofoilseedrape,makingtherhizobiaintrudeintotheroots,formpara-nodulesandfixnitrogen.Theresultsshowthatrhizobiastimulatedbyflavonoidcouldef-fectivelyinvaderootcellsandformpara-nodulescontainingrhizobia,withnodulationrateof100%.Thestrainsiso-latedfrompara-nodulesofoilseedrapecouldsuccessfullyre-inoculatedtooriginalhost.Thedeterminationofant-iserumshowthatthestrainscouldagglutinatewithtestrhizobia.Electronmicroscopicobservationshowsthatthecellsofpara-nodulewerefullofbacteria.TheactivityofN-fixingenzymeinpara-nodulesdeterminedbyacetylenereductionmethodwas142.01nmolC2H4󰀁g-1󰀁h-1.Keywords󰀁Flavonoid,Rhizobium,Oilseedrape.

󰀁󰀁*国家自然科学基金资助项目(39470016).󰀁󰀁**通讯联系人.󰀁󰀁1996-07-16收稿,1996-12-28接受.1󰀁引󰀁󰀁言󰀁󰀁自然界大多数植物不具备共生固氮系统.在非豆科中除Parasponia[8]外,至今还未发现其它非豆科植物能像豆科植物一样与根瘤菌形成共生.聂延富报道了2.4-D能使小麦根系诱导结瘤的作用[2].A-lMallen等研究了根瘤菌在水稻和油菜幼苗根系上形成的根瘤结构[4,5],这些根瘤的形成是由于利用酶降解了根细胞壁,去掉了根瘤菌进入植物根部细胞的障碍而发生的.Tchan等[6]通过固氮螺菌进一步证实2.4-D对小麦结瘤的作用,并称这种根瘤菌结构为󰀁类根瘤󰀁.曹燕珍等[3]用协助细菌法来促进固氮徽生物和非豆科植物形成类根瘤.胡小加[1]采用果胶细菌法诱导根瘤菌进入油菜根系结瘤.类黄酮是豆科植物所产生的一类活性物质.本研究是采用类黄酮激活根瘤菌的结瘤基因,使被激活的根瘤菌侵入油菜根系结瘤并固氮.2󰀁材料与方法2.1󰀁生物材料󰀁󰀁试验用油菜品种为甘蓝型油菜Alaska,根瘤菌为田菁(Sesbaniarostrata)根瘤菌株AzorhizobiumcaulinodansORS571.以上生物材料均由英国诺丁汉大学生命科学系植物基因操纵实验室提供.2.2󰀁类黄酮(Naringenin)󰀁󰀁苷配基,4󰀁.5.7-三羟黄烷酮(SigmachemicalCoSt.Louis,USA).2.3󰀁种子处理和幼苗的培养󰀁󰀁种子用0.1%HgCl2进行常规表面灭菌,在28󰀁下催芽.待种子萌发后,将胚根放置在含有半固体无氧培养基试管中.26󰀁黑暗条件下培养24h.同时加入2󰀁10-5(M)的类黄酮和根瘤菌(1󰀁108细胞ml-1).再将幼苗置于24󰀁光照室培养,光照强度为400󰀁Em-2󰀁S-1.2.4󰀁油菜类根瘤内含菌的分离、回接、抗血清制备和抗血清凝集反应󰀁󰀁当油菜生长至30d,选择较大的类根瘤,按常规表面灭菌后,作平板分离,取单菌落纯化.用纯分离物作回接试验.抗血清制备和抗血清凝集反应按文献[9]描述的方法进行.2.5󰀁固氮酶活性测定󰀁󰀁取生长在试管中的类根瘤,用乙炔还源法测定其固氮活性[1].2.6󰀁透射电镜观察󰀁󰀁将培养30d的类根瘤固定在2.5%三戊二醛/25mmol󰀁L-1磷酸氢二钾溶液中,pH为6.8.然后再以1%锇酸固定.E-pon812环氧树脂包埋,超薄切片.作醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色.电镜观察.3󰀁结󰀁󰀁果3.1󰀁类黄酮激活根瘤菌在油菜上形成类根瘤󰀁󰀁类黄酮在适合的浓度下(2󰀁10-5M)能有效地激活根瘤菌的结瘤基因,使根瘤菌侵入油菜根部,并使其发生变异.接种15d后,根部形成类根瘤(图版1),结瘤率为100%.而空白对照、类黄酮对照和根瘤菌对照根部均无变异出现.3.2󰀁类根瘤内含菌的分离回接及抗血清反应󰀁󰀁从油菜类根瘤中分离出的细菌,经纯化后回接到原寄主植物田菁上.在接种14d后能在其上结瘤,并能与ORS571产应用生态学报󰀁1999年2月󰀁第10卷󰀁第1期󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁CHINESEJOURNALOFAPPLIEDECOLOGY,Feb.1999,10(1)󰀁127~128生抗血清反应.证明所分离的菌为原接种的根瘤菌ORS571.3.3󰀁固氮酶活性测定󰀁󰀁经类黄酮激活的根瘤菌接种的油菜,生长25d均能形成类根瘤.生长30d后用乙炔还源法测定了180株油菜苗的固氮酶活性.结果表明类黄酮加根瘤菌ORS571形成的类根瘤具有明显的乙炔还原作用(表1),但和田菁根瘤固氮酶活性相差甚远,仅为它的6.24%.表1󰀁油菜类根瘤的固氮酶活性Table1Nitrogenaseactivityofoilseedrapepara-nodules处理Treatments试验重复Replications固氮酶活性Nitrogenaseactivity(nmolC2H4󰀁g-1󰀁h-1󰀁SE)空白对照Blankcontrol1800类黄酮对照Flavonoidcontrol1800ORS571对照ORS571control1800类黄酮加ORS571Flavonoid+ORS571180142.01󰀁11.76

图版说明ExplanationofPlate1.油菜类生根瘤.类生根瘤的形状大小与根瘤相同.标尺:0.05cm.根瘤(N).根(R).Thepara-noduleofoilseedrape.Thepara-noduleshowedthesamesizeandshapeasitsrootcounterparts.Nodule(N).Root(R).2.类生根瘤透射电镜切片.植物细胞内充满根瘤菌(3000󰀁).植物细胞(PC).植物细胞壁(PCW).根瘤菌(A).Transversesectionofthepara-nodule.Theplantcellfullofrhizobia(3000󰀁).Plantcell(PC).Plantcellwall(PCW).Rhizobia(A).3.4󰀁电子显徽镜观察󰀁󰀁电镜观察可明显地看到类根瘤细胞内有感染细菌的分布(图版).4󰀁讨󰀁󰀁论󰀁󰀁功能瘤的形成是一个复杂的过程,包含有不同表型的阶段[9],而每个阶段既决定于细菌基因,又依赖于寄主植物的基因.Truchet[8]等报道了在紫花苜蓿根系自发形成的无根瘤菌的瘤子是有组织的结构而不是变态的肿瘤.在豆科中,有结瘤的遗传信息,而根瘤菌的基因仅仅作为起动植物的结瘤过程.在非豆科植物中,可能也有类似豆科植物的全部结瘤遗传信息,或者有部分有关的遗传信息.所以有些植物,像油菜可能有部分基因与豆科植物中结瘤基因DNA是同源的.研究表明,根瘤菌和非豆科不但可以形成类根瘤,而且这种根瘤具有乙炔还原作用.为了构建一个新的共生体,不但要选择根瘤菌和植物的适当组合,也需要对二者进行遗传改造,使它们相互适配.要实现像根瘤菌-豆科植物共生体系的高固氮功能,并扩大到油菜、小麦、水稻等许多非豆科植物,尚需深入研究.致谢󰀁本研究的部分工作是在英国诺丁汉大学生命科学系受英国皇家学会资助完成的.参考文献1󰀁胡小加、张学江.1993.诱发油菜结瘤固氮的研究.中国油料,4:42~44.2󰀁聂延富.1986.用化学方法将两种细菌引入小麦根部皮层细胞的报告.微生物学杂志,6(4):35~38.3󰀁曹燕珍、李阜棣.1994.非豆科作物和固氮微生物在协助菌影响下形成类根瘤.华中农业大学学报,13(4):313~317.4󰀁A-lMallen,M.K.andDavey,M.R.1989.Formationofnodularstructuresonriceseedlingsbyrhizobia.J.Exp.Bot.,40:473~478.5Cocking,E.C.andA-lMallen,M.K.1990.AchievementandOb-jective.In:Gresshoff,P.M.eds.NitrogenFixation.ChapmanandHall.813~823.6Tchan,Y.T.andKennedy,I.R.1990.Biologicalnitrogenfixa-tionandprospectsforyieldincreasesinwheat.Trans.14thInt.Congr.SoilSci.,146~151.7󰀁Trinick,M.J.andHadobas,P.A.1988.Biologyoftheparasponia-Bradyrhizobiumsymbiosis.PlantandSoil.,110:177~185.8󰀁Truchet,G.andBarker,D.G.1989.Alfalfanodulationintheab-senceofRhizobium.Mol.Gen.Grnet.,219:65~68.9Vincent,J.M.1980.Factorscontrollingthelegume-Rhizobiumsymbiosis.In:Newton,W.E.etal.eds.NitrogenFixation.Un-iversityParkPress.103~129.作者简介󰀁胡小加,男,1960年生,副研究员,从事非豆科植物结瘤固氮研究,发表文章10余篇.128应󰀁用󰀁生󰀁态󰀁学󰀁报󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁󰀁10卷