（生物科技行业）分子生物学检验技术实验指
导
实验壹小鼠肝组织DNA的提取及鉴定
【实验目的】
1、掌握动物组织DNA提取的方法；
2、掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】
获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；
③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA和蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，且使组织蛋白变性沉淀，DNA 从核蛋白中游离分开；为控制组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去激动该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A260，可计算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸收峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】
1、动物
小白鼠
2、设备
移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂
（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技X公司）：包括BufferCL、
BufferPP、BufferGE、RNaseA、ProteinaseK
（7）生理盐水，4℃贮存
（8）无水乙醇、70%乙醇
【操作步骤】
1、制备肝匀浆
迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300μl BufferCL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5μl蛋白酶K，漩涡震荡10s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。
2、提取DNA
（1）加入1.5μl RNaseA，颠倒混匀，37℃孵育15-60min。
（2）冰上孵育1分钟使样品迅速冷却。
（3）加入1/3体积的BufferPP，涡旋震荡20s，12000rpm离心3min。
（4）将上清转移到—个新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液中析出。12000rpm离心1min，弃上清。
（5）加入300μl70％乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000rpm离心1min，弃上清，室温干燥15min。
（6）加入50μlBufferGE溶解DNA（如果DNA的量比较大，能够65℃孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。
3、DNA浓度和纯度的测定
取0.1mlDNA样品，加蒸馏水至1ml，在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。
计算：DNA浓度（μg/ml）=A260×50×10（请问系数50、10是如何得来的？）DNA纯度=A260nm/A280nm
【注意事项】
（1）由于DNA主要存在于细胞核内，为便于提取DNA，肝脏的破碎要严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60～70％的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因
组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。
（2）用氯仿除去组织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。
（3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应避免接触皮肤。
（4）室温下干燥时尽可能使残留的乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切酶的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hr。
（5）提取过程应尽量保持低温。
（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为20μg/ml。据此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度>0.25μg/ml的核酸溶液。
（7）A260nm/A280nm比值应介于1.8~2.0之间，若比值>2表示DNA样品中含有较多的RNA，如比值<1.8表明样品中有蛋白质污染。应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA，其比值介于1.8~2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。
【结果】
1、A260= ，A280= 。
2、小鼠肝组织中DNA浓度是μg/ml。
3、小鼠肝组织中DNA的A260nm/A280nm比值是。
【思考题】
1、提取和纯化的真核组织DNA有何用途？
2、你的A260nm/A280nm比值结果是否介于1.8~2.0之间？有何意义？
3、请结合你的实验结果和操作步骤，分析如何检测和保证DNA的质量？
实验二聚合酶链反应
【实验目的】
采用聚合酶链式反应技术扩增小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因
【实验原理】
聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于体外扩增位于俩段已知序列之间的DNA区段（靶序列）。其原理是通过耐热DNA聚合酶催化的DNA 合成反应达到对靶序列的扩增。反应中使用俩条化学合成的寡核苷酸作为引物，分别和模板DNA俩条单链互补，待扩增序列片段位于俩条引物之问。PCR扩增包括3个步骤，即变性、退火和延伸。反应需要模板、引物、DNA聚合酶和脱氧核糖三磷酸(dNTP)等的参和。反应混合液被加热以使模板DNA双链变性成为二条单链，随后将反应混合液冷却至引物的熔点温度(Tm)以下，使引物能和靶序列形成杂交双链（退火）。当温度升至72℃左右时，反应体系中的DNA聚合酶按照模板链的序列以碱基互补方式依次把dNTP加至引物的3’端，使互补链从5‘向3’方向不断延伸，直至形成新的DNA双链。通过变性、退火和延伸的壹个循环能够使靶序列的分子拷贝数增加壹倍。由于每次扩增的产物又作为下壹次扩增的模板，因此反应产物的量以指数形式增长，壹个分子的模板经过n个循环可得2n个分子拷贝产物。
本实验扩增的是小鼠肝组织平滑肌收缩蛋白（SM22α）基因，扩增产物片段大小为541bp。扩增所用的上游引物序列为：5’-AGTTATATTAATTTTGCATAGTGCCTGGTTG-3’，下游引物序列为：5’-GCGCTAGCTACAAGGCTTGGTCGTTTG-3’。
【实验器材和试剂】
1、设备
PCR仪、0.2mlPCR反应管、1.5ml离心管、移液器、吸嘴、旋涡混合器。
2、试剂（20μl体系）
PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技X公司）
【操作步骤】
1、分别在PCR反应管中加入2×PCRmix10μl、上游和下游引物各2μl、
DNA2μl和H2O4μl。
2、把PCR反应管放人PCR仪，按仪器操作要求启动扩增程序。本实验的扩
增程序为：94℃预变性5分钟后进入循环扩增，即94℃变性30s，58℃
退火30s，72℃延伸1min。重复35个循环后，于72℃再延伸10min，
最后4℃保温。
