单克隆抗体的制备及其应用

单克隆抗体的制备及其应用

生物21001班 赵梦莹 1014151004

摘要：单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着重要的作用，同时，在人类和动植物的免疫学诊断方面至今仍有着无可代替的重要作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,单克隆抗体的制备技术,包括嵌合抗体、噬菌体展示技术、核糖体展示技术、基因工程抗体等,这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。

关键词：单克隆抗体 制备 应用

引言：1975年德国科学家Kohler和英国科学家Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术。由于单克隆抗体在生命科学领域的巨大贡献，此技术获得1984年的诺贝尔医学和生理学奖。此后单克隆抗体迅速广泛地应用于生物学和医学的各个领域。

1 单克隆抗体的种类及制备

1.1 鼠源性抗体

1975 年，Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵阳红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。由免疫B细胞-浆细胞、瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞系可分泌单一、特异性、纯化的抗体，且能在选择培养基中生长、无限增值、分裂，同时在选择培养基作用下，利用代谢缺陷补救机理筛选出同时具有两种细胞特征的细胞克隆。这种经过反复克隆而挑选出来的融合细胞所产生的抗体称为单克隆抗体。它在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。至今，科学家们已经建立众多鼠源性mAbs 来诊断和治疗多种人类疾病。然而作为在人体内的应用，鼠源单抗尚存在一些问题。鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs不能与人类抗体FcRn结合。为了克服以上这些问题，近年，随着分子生物学的发展，人们已有可能通过抗体工程技术制备人-鼠嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。

1.2 人-鼠嵌合抗体

嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。Jones等在20世纪80年代中期首次成功构建了小鼠抗半抗原-4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸的免疫球蛋白VH基因， 并最终获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体， 再通过定点突变法进行单纯的CDR移植构建，形成第一代人源化抗体。随后还相继研发了阿昔单抗、美罗华等嵌合抗体，现均已被广泛应用于科学研究与疾病诊断之中。CDR 移植抗体，又称改型抗体，它是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR 代替鼠FR，形成的只剩3个鼠源CDR 的更为完全的人源化抗体。由于具有支持作用的FR 不仅为CDR 的构想提供了环境，还参与抗体结合位点正确构像的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力。

1.3 人源性抗体

为了能使单克隆抗体大量的应用于疾病治疗、临床试验和科研中，我们不仅要降低其免疫原性，还要对其亲和力质量、治疗能力强弱等方面提更高的要求。目前，研究人员已建立多种方法生产完全人源性抗体，主要有噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。

1.3.1 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来，从而得到全套的噬菌体库。噬菌体展示首先是通过大肠杆菌特异性的噬菌体发展起来。迄今为止，已建立的噬菌体展示系统，如丝状噬菌体、l噬菌体、T4噬菌体、T7 噬菌体和真核病毒系统等。此外多肽还被展示在细菌及酵母的表面。虽然这些不同展示系统的优点在特殊应用中得到了证明，但都是基于丝状噬菌体M13和噬菌粒相互作用之上。噬菌体展示的基本原理是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体。在噬菌体表面所展示的是随机肽段或蛋白质的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体，它的最大特点是实现了直接将基因型和表型完美的结合在一起，可以快速而高效地从大量克隆筛选出表达特异性的抗体。至今，由这一技术产生的抗体至少有14个已用于临床试验中。然而，它还存在着如未经免疫获得的抗体亲和力相对较弱，抗体库的库容无法涵盖一些动物的抗体多样性等缺点，因此，大容量抗体库的亲和力和抗体多样性问题将是我们今后研究抗体库技术所必须考虑的关键。

1.3.2 转基因小鼠技术

该技术是将人抗体基因微位点转入小鼠体内，产生能分泌人抗体的转基因小鼠。1998年，Green等将人抗体轻重链基因构建成酵母人工染色体，通过基因打靶技术将其转入自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，通过繁殖筛选，建立分泌高亲和力人抗体的小鼠品系，Mendez等采用细胞融合法，将YAC的酵母细胞与鼠胚干细胞融合，将整合有目的基因的ES 细胞导入小鼠囊胚，形成嵌合体小鼠，通过反复筛选，最后获得分泌完全人抗体的转基因小鼠。再用传统的杂交瘤技术，将产生人抗体转基因鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生高亲和力的人源抗体。由转基因小鼠产生的单克隆抗体，是由多个同源V基因片段编码而成的，因此在很大的程度上，此抗体的活性能够大大的增强。至目前为止，大约有33个是由转基因小鼠制备而来的抗体已投于临床实验中。虽然如此，但是该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生相应的抗体。

1.3.3 核糖体展示技术

核糖体展示是一种完全在体外合成并筛选蛋白质的有力工具。该技术的基本原理是利用PCR扩增含目的基因的cDNA文库，再加上启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，用相应抗原对反复筛选复合物，分离mRNA，通过RT-PCR富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。核糖体展示技术与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统，无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。此外，核糖体展示技术无需进行体内外系统转化，全程只需通过PCR 技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR 技术还可引入突变，增加分子多样性，从而获得高亲和力抗体。目前还有多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性，而核糖体展示技术的最大缺点就是mRNA易降解。

2. 单克隆抗体临床应用

从鼠源单抗开始，已通过多种技术制备了具有高度亲和性的完全人源化抗体，作为靶向治疗多种疾病的新型药物。其中由杂交瘤技术制备的单克隆抗体不仅结果均一、纯度高、特异性强、血清交叉反应弱，而且制备成本低，而基因工程抗体既保持单抗的均一性、特异性强等优点，又能克服其为鼠源性的不足，因此，拓展mAbs的广泛应用，是研究开发治疗性抗体药物最理想的途径。近三十年来，在基因工程抗体方面的研究成果振兴了整个生物制药行业。目前，全球约有500多种治疗性药物正处于临床前研究，100多种已处于临床试验中。其中，已被FDA 批准的有治疗抗肿瘤坏死因子的嵌合mAb对克隆病等自生免疫性疾病方面的治疗应用。另外，还有一些抗体药物在抑制器官移植术后排斥反应和病毒感染性疾病等方面也显示了较好的应用前景。

3. 单克隆抗体展望

单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。在过去的三十年里,从鼠源性单抗到全人源性抗体,单抗在制备技术上取得了较大的进展。鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应,使药物的功效降低。全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。它减少了鼠基因序列,减少了抗抗体反应,提高了单克隆抗体的功效和安全性。而且,当前全人源性单克隆抗体技术的灵活性,可以选择发挥单抗最优的药动学和药效学特性。在未来的几年里, 全人源性单抗将作为一种新的产物更多地用于疾病的诊断、治疗及研究。

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