壳聚糖及其衍生物的抗菌性

福建农林大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｕｊｉａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）　第３９卷第２期　２０１０年３月　

壳聚糖及其衍生物的抗菌性　

夏葵，曾虹燕，孟娟，廖晓珊，郭强　（湘潭大学化工学院生物技术研究所，湖南湘潭４１１１０５）　

摘要：测定了壳聚糖及其衍生物对细菌和真菌的最低抑制浓度（ＭＩＣ），并研究了不同浓度壳聚糖及其衍生物对抑菌活性的　影响；同时，以壳聚糖为主剂，双乙酸钠为助剂制成复合保鲜剂，以不同浓度的复合保鲜剂水溶液涂膜处理蕨菜表面，室温　存放进行保鲜试验．结果表明：壳聚糖及其衍生物对这２类微生物均有较强的抑制作用，且其抑菌活性高于双乙酸钠和苯　甲酸钠；其中，壳聚糖一硫脲一Ａｇ　的抑菌作用最强，在Ｏ．００２５％的浓度下就可抑制细菌．此外，保鲜过的蕨菜基本上保持了　原有风味和营养成分，仍为绿色，无霉变．　关键词：壳聚糖；抗菌性；蕨菜　中图分类号：ＴＳ２０２．３　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１－５４７０（２０１０）０２－０１２３－０５　

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　

ＸＩＡ　Ｋｕｉ，ＺＥＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｙａｎ，ＭＥＮＧ　Ｊｕａｎ，ＬＩＡＯ　Ｘｉａｏ—ｓｈａｎ，ＧＵＯ　Ｑｉａｎｇ　（Ｂｉｏｔｅｃｌｍｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉａｎｇｔａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｎｇｔａｎ，Ｈｕｎａｎ　４１１１０５，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｍｉｎｉｍｕｍ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｆｕｎｇｉ　ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ，ｅｆｆｅｃｍ　０ｆ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ．ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｐｒｅｓｅｒｖａ－　ｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｄｅ　ｗｉｔｈ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｓ　ｍａｉｎ　ｒｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｕｘｉｌｉａｒｙ，ｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ￣ａｆｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｆｉｌｍｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒａｃｋｅｎ，ｔｈｅｎ　ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ａｔ　ｒｏｏｍ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓ￣ｏｎｇｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｈｉｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｆｕｎｇｉ．ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇａｅｒ　ｔｈａｎ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｉａｃｃｔａｔｅ　ａｎｄ　ｓｏｄｉｕｍ　ｂｅｎｚｏａｔｅ，ｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｃｈｉｔｏｓａｎ—ｔｈｉｏｕｒｅａ—Ａｇ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　０．００２５％．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｂｒａｃｋｅｎ　ｍａｉｎｌｙ　ｋｅｐｔ　ｉｔｓ　ｏｒｉｇｉｎａｌ　ｔａｓｔｅ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｕｓ　ｖａｌｕｅ，ａｎｄ　ｒｅｍａｉｎｅｄ　ｇｒｅｅｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｍｉｌｄｅｗ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈｉｔｏｓａｎ；ａｎｔｉｍｉｃｒｅｂｉａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；ｂｒａｃｋｅｎ　

壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化后得到的一种生物高分子物质，是生物界中唯一大量存在的碱性多糖，　

具有良好的生物相容性、生物可降解性以及抗菌、防腐、止血和促进伤口愈合等优良性能．壳聚糖大分子链　上分布着许多羟基和氨基，性质比较活泼，通过化学改性，能得到各种具有特殊性质及用途的壳聚糖衍生　

物．壳聚糖及其衍生物有良好的抑菌性、保湿性和成膜性，故作为纯天然无毒防腐剂和保湿剂广泛用于食　品等工业¨　．　迄今为止，在大多使用壳聚糖及其他涂膜材料来保鲜蔬菜的研究中，没有添加相应的防腐材料＿４　Ｊ．而　

壳聚糖作为食品防腐剂，由于水溶性差，限制了它的工业应用．因此，本试验对其进行化学修饰，生成水溶　性的壳聚糖衍生物，研究其对细菌和真菌的抑制作用及对蕨菜的保鲜效果，以期为开发天然防腐剂和保湿　剂提供依据．　

１材料与方法　

１．１材料与仪器　一　

细菌包括Ｇ　菌［金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕａ　ａｕｒｅｕｓ）、枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）］和Ｇ一菌［大肠　

杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、绿脓杆菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）］，真菌包括霉菌［青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．）、黄曲霉　

（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｏｕｓ）、根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｓｐ．）、毛霉（Ｍｕｃｏｒ　ｓｐ．）］和啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），均由湘　

收稿日期：２００９—０６—１２　修回日期：２００９—１０—０８　基金项目：湘潭大学教育部第一届大学生创新基金（０８１０５３０１３）．　作者简介：夏葵（１９８５一），女，硕士．研究方向：生物催化合成手性化合物．Ｅｍａｉｌ：ｋｋｃａｔ１２２＠１２６．ｃｏｍ．通讯作者曾虹燕（１９６３一），女，教授，博　士生导师．Ｅｍａｉｌ：ｈｙｚｅｎｇ＠ｘｔｕ．ｅｄｕ．ｃａ．

　・１２４・　福建农林大学学报（自然科学版）　第３９卷　

潭大学食品与生物工程系提供．壳聚糖购于青岛百成海洋资源公司，脱乙酰度为９４％以上，平均分子量　

２．６×１０　．蕨菜采自湘潭市市郊．双乙酸钠为食品级（纯度ｉ＞９８％）；苯甲酸钠（食品级）和其他试剂均为分　析纯．Ｕ－２００１型紫外分光光度计（日本，日立）．　

１．２试验方法　

１．２．１　菌株的培养（１）细菌培养：将菌种活化后，接种到蛋白胨培养液中，在３７℃摇床（１２０　ｒ・ｍｉｎ　）　

培养２４　ｈ．　（２）真菌培养：将菌种活化后，接种到ＰＤＡ琼脂培养基上，置２８℃恒温培养箱中培养至菌种生长良　

好．用无菌水将孢子洗出，配成孢子种子液（Ｄ锄　为０．７７）．　１．２．２不同壳聚糖衍生物的制备（１）磺化壳聚糖的制备：将１０　ｍＬ甲酰胺加入三１：３烧瓶，置于冰盐浴　

中，在搅拌条件下，滴加一定量氯磺酸，控制滴加速度，使反应温度保持在５℃以下．滴加完毕后，得到白色　粘稠液体．将上述三口烧瓶移人恒温水浴中，加入１　ｇ壳聚糖．开始搅拌，逐步升温，反应一定时间后，向反　应体系中加入适量去离子水，使产物充分溶解．过滤除去未反应物质．滤液移入透析袋，用去离子水透析　

２　ｄ，以充分清除小分子物质．透析后的溶液在５Ｏ一６０℃浓缩至干，即得磺化壳聚糖．　

（２）壳聚糖一硫脲的制备：壳聚糖与硫氰酸铵在乙醇中回流１２　ｈ，过滤，用乙醇洗涤，烘干得到壳聚　糖一硫脲．　（３）壳聚糖—硫脲一Ａｇ　的制备：壳聚糖一硫脲乙醇液于搅拌下加人ＡｇＮＯ　（１：０．４，ｗ／ｗ），在磁力搅　

拌器上反应１　ｈ，过滤，用乙醇洗涤，烘干得到壳聚糖一硫脲一Ａｇ　．　

１．２．３最低抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定称取壳聚糖及其衍生物各２　ｇ，分别溶解在１００　ｍＬ　１％醋酸（ＨＡｃ）　溶液中，制成浓度为２％的溶液．用琼脂培养基配成不同浓度的平板（ｐＨ为６．０），使其浓度分别为１．０％、　０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％和０．０２５％（仅将壳聚糖一硫脲一Ａｇ　加制０．０１％、０．００５％、０．００２５％和　０．０００１％的培养基），然后涂布接种０．２　ｍＬ微生物种子液（Ｄ鳓　为０．７７）．将平板置于恒温箱（细菌３７　ｃ【＝、　

真菌２８　ｃＩ二）中培养，观察菌的生长情况，每个质量浓度做５组平行试验，以完全没有菌生长的最低浓度为　ＭＩＣ．以双乙酸钠、苯甲酸钠和１．０％乙酸为参比对照，同时做空白对照．　

１．２．４抑制微生物活性试验观察上述已接种菌的平板分别在ｌ２、２４、３６、４８、６Ｏ、７２、８４　ｈ时微生物的生　长情况，以平板上长出微生物所需时间长短判断抑菌活性的强弱．用“一”表示无抑制微生物活性（在１２　ｈ　

时长出细菌和酵母，在２４　ｈ时长出霉菌被视为无抑制微生物活性），“＋”表示完全抑制微生物活性（在　８４　ｈ时未长出微生物被视为完全抑制微生物活性）．　１．２．５　ｐＨ对壳聚糖抑菌活性的影响在能产生抑菌效果的最低壳聚糖和壳聚糖一硫脲一Ａｇ　浓度的液　体细菌培养液中，用０．１　ｍｏｌ・Ｌ　ＨＣＩ或ＮａＯＨ的无菌溶液调节其培养液的ｐＨ分别为４．５、５．５、６．０、６．５　和７．０（以未加壳聚糖和壳聚糖一硫脲一Ａｇ　的培养液为空白对照）．分别将ｌ％（ｖ／ｖ）金黄色葡萄球菌菌　悬液（　６３。　为０．７７）接人液体细菌培养液中，在３７℃摇床（１２０　ｒ・ｒａｉｎ　）培养４８　ｈ．将０．２　ｍＬ微生物种　

子液涂布接种于细菌琼脂培养基乎板上，培养４８　ｈ．重复３次，取平均值，计数并计算抑菌率．　抑菌率／％＝（空白对照的平均菌落数一受试样品的平均菌落数）／空白对照的平均菌落数×１００．　１．２．６壳聚糖涂膜液的制备和蕨菜涂膜预处理（１）壳聚糖涂膜液的制备：将一定量的壳聚糖和双乙酸　钠加入ｌ％（ｖ／ｖ）冰醋酸溶液中，再加入甘油，使其最终浓度为ｌ　ｇ・Ｌ～，ｐＨ为６．０．　（２）蕨菜涂膜预处理：切去蕨菜褐变的根部，浸于涂膜液中２　ｍｉｎ，自然风干．将已成膜的蕨菜放入保　

鲜袋内于室温下贮藏，１２　ｄ后测其失重率和褐变指数．　（３）褐变指数：采用目测观察法，以蕨菜褐变程度作为分级标准．０级——蕨菜完好，梗为绿色或紫色；　ｌ级——褐变面积不超过总面积的１／３；２级——褐变面积不超过总面积的Ｉ／＇２；３级——褐变面积占总面　

积的１／２—３／４；４级——褐变面积大于总面积的３／＇４；５级——出现腐烂．　

褐变指数／％　∑（数量×级数）　

失重率／％＝　×１０。。　×１００；

　第２期　夏葵等：壳聚糖及其衍生物的抗菌性　・ｌ２５・　

１．２．７　Ｖ　含量的测定采用碘量法　测定蕨菜中的Ｖｃ含量．　

２结果与分析　

２．１　壳聚糖及其衍生物的ＭＩＣ　从表１可知，０．０５％壳聚糖、０．１％壳聚糖一硫脲、０。１％磺化壳聚糖、０．２５％双乙酸钠，均会对金黄色葡　萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌产生抑制作用；０．５％苯甲酸钠会对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌产生抑制作　

用，抑菌时间分别为６０和４８　ｈ，当其浓度为１。０％时，对大肠杆菌产生抑制作用，抑菌时间为４８　ｈ．所有受　

试样品对细菌都有不同程度的抑制活性，其中，壳聚糖一硫脲一Ａｇ　的抑细菌活性大大高于壳聚糖，壳聚