电子显微镜简介及操作

成实际光学系统与理想光学系统成像的差别，
这种差别叫做像差（Aberration）。像差的大
小标志光学系统成像的质量，是影响电镜提
高分辨能力的重要因素。像差包括以下几种：
（1）、球差 (Spherical Aberration)
电磁透镜的近轴磁场对电子的偏转能力比远 轴磁场弱，也就是说通过透镜中央近轴的电子束 成像交点离透镜远；通过透镜边缘即远轴的电子 束成像交点离透镜近，于是在原来理想的像点附 近形成一个弥散小球，这种现象叫球差。球差是 影响EM分辨率的主要因素之一。对EM来说， 球差只能减小，不能消除。
7、电子束与样品的相互作用 电子束在加速电压的作用下，以极
高的速度入射样品，与样品物质中的原子、
核外电子发生碰撞产生弹性散射和非弹性 散射，并产生带有样品信息的各种信号。 根据不同的研究利用这些信号形成不同的 图象。
第二章 医学电子显微学研究方法 1、超薄切片技术（ TEM 样品制 备技术） Ultrathin Section Techniques
第三节、与电镜有关的几个基本概念
1、电镜的度量单位
（1）光镜观察内容 一般小于0、1mm、大于1um的结构，包括 细胞、细胞核和其它一些大的细胞器、细菌 。 （2）电镜观察的内容 小于1um大于数纳米的结构，包括细胞内成
分、病毒和大分子等的结构。
电镜用的度量单位是微米（um）和纳米（nm）。相 互关系为 电 镜 长 度 的 剂 量 单 位
像。 电镜图像的分辨率，取决于电镜的分辨率也取决 于样品的结构和反差，而样品的结构和反差在很大程
度上受到样品制备技术的限制。电镜分辨率0、2nm ，
生物样品最佳制备仅能达到20－30nm ，这样远远不能 发挥电镜的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结 构细节还没有被发现和认识。
超薄切片制备程序 Preparetion procecture of ultrathin section
焦点深度 浅（500倍时2um） 图像色彩 有 样品种类 切片、涂片等 样品厚度 厚（数微米） 样品环境 空气 显像方式 直接观察
80~100万 散射为主
中等（ 500倍时500um）
30万左右 二次电子数量
深（ 500倍时1000um）
无 超薄切片 极薄（＜100nm） 真空 荧光屏
无 各种实体 不限 真空 显像管
生物材料在离开机体正常的生长环境
后，其结构在水解酶的作用下，易发生自
溶。为了保持生物材料的原生活状态，取 材时应遵守以下原则。
（2）、取材的要求
A、 准确 根据研究的目的和要求，准确确 定取材的部位。
B、 快速 为了保持样品的活体状态，取材速
度在1－2分钟之内，将样品放入固定液中。
C、样品体积要小 固定液的渗透能力弱，四
B、特点
具有透射电镜和扫描电镜性能，可对样品微 区内（几个um）的元素，进行定性、定量总 体分析。
（4）、超高压电镜（HVEM）
A、概念
加速电压在500KV以上的电镜，世界上超高压电 镜的最高加速电压为3000KV,全世界有50余台。 B、特点
（b1）、分辨率高 损伤小 加速电压高，穿透力强，对样品
得到了广泛的应用。电子显微学和电子理论以及 晶体缺陷称之为近代科学的三大支柱
1、电镜在生物医学中的应用 在40年代，电镜在病毒学、细胞生物学、 组织学、病理学、分子生物学、分子病理学等 方面都发挥了重要作用，使生物医学和生命科 学的研究水平更进一步。近几十年来，电镜技 术从医学基础理论的研究逐渐扩大到临床医学
菌、细胞培养中的动力学观察开辟了新途径。
但此类电镜造价很高，难于普及。
各种显微镜性能及特点比较
种 类 特征 照明源 透镜 分辨率 光学显微镜 OLM 可见光 玻璃透镜 0.1~0.2um 透射电子显微镜 TEM 电子束 电磁透镜 0.2 nm 扫描电子显微镜 SEM 电子束 电磁透镜 3nm
放大倍率 1000左右 成像反差 吸收为主
取材 — 细切 — 预固定 — 冲洗 — 后固
定 — 冲洗 — 脱 水 — 浸透 — 包埋聚合 —
包埋块修整 — 半薄切片 — 复红和次甲基
蓝染色 —光 镜定位 —超薄切片 — 电子染
色 — TEM观察
一、取材 Materail
（1）、取材概念 从动植物机体上，细胞及微生物的培
养物中，取得所需材料的过程叫取材。
照观察，避免电镜的局限性，人工损伤导致的错
误结论。
第二节、电 子 显 微 镜
1、 电镜的基本类型和特点
（1） 透射电子显微镜 Transmission electron micrscope，TEM
A、概念
以电子束作为照明光源，照射并穿透样品
而直接成像。电子束的加速电压一般为50100KV.
B、特点
2、电镜的局限性 观察微观世界，生物之谜正在被解开，电镜 有不可取代的优点，但它不是一种万能仪器，有
一定的局限性、人工损伤的缺陷、样品制备的繁
琐、价格昂贵、样品定位性和图象分析困难、观
察视野小尤为显著。要注意光镜与电镜的结合减
少盲目性。学会分析判断三维构思的能力，把平
面图象予以立体定向的理解与解释。要有严格对
（b2） 制样技术
以表面观察法为主，还有冷
冻割断内部观察法，高分辨样品制备法及管道 铸型法等，可观察大、厚的样品，制备方法简 单。 （b3）图像特点 景深长，图像层次丰富，立 体感强，为三维结构图像。 C、应用范围 广泛应用于生物样品表面及其断面立体形 貌的观察，具有多种分析功能。
(3) 分析型电镜 A、概念 为装有扫描附件，能谱仪（EDX）和波 谱仪（WDX）的透射电镜。
的实际应用，对疾病病因的探索，病情的转归；
肿瘤的早期诊断，血液病和肾脏病的分型诊断
已经取得了显著的成效。
电镜在确定肿瘤细胞的组织发生，类型和分化
程度上起着重要作用。根据各种肿瘤细胞的超 微结构特点来协助区别分化差的癌和肉瘤、各 种梭形细胞恶性肿瘤、各种恶性小园细胞肿瘤 、各种神经内分泌肿瘤及恶性黑色素瘤。并与 免疫组织化学技术起着互补和印证的作用.
球 差 形 成 图
（2）、像散（Astigmatism）
电磁透镜在加工过程中，加工材料不均匀、加工 精度有限而形成的误差。透镜合轴不好、污染等，都 会使透镜磁场强度分布不均匀，表现为相互垂直方向 上的电子束聚焦能力不同，造成像点的像模糊 电磁透镜磁场分布不是轴对称的，因而引起的图 像像差称为像散。消除办法：外加一个人为磁场来进
病毒、原核和真核细胞及其细胞器。因此在20
世纪30年代，德国科学家Knoll和Ruska，
在电子光学的基础上发明了电子显微镜。研制出 世界上第一台电镜，用电子束和电子透镜组成的 电子光学系统，像光学显微镜一样将物体放大成 像。从而使医学、生物学的研究，从细胞学水平 提高到分子细胞学亚细胞结构水平。 电子显微镜具有高分辨，高放大倍率、直观
电 子 显 微 镜 技 术
Electron microscope technique
緒
论 光学显微镜的发明，突破了人类的生理限
制，看清了细菌与细胞，对微观Fra Baidu bibliotek界的认识产
生了飞跃。随着科学技术的深入人们认识到，
生物界中还有无数的“谜”要解开这些谜就必
须研究生物的超微结构。但是光的波长影响了
人们观察细胞内微小结构，包括生物大分子、
子），在高真空的环境下，大量自由电子向下发射，形成
电子束。电子束相当于光鏡的可见光源。
5、电镜的透镜系统
电镜透镜是电磁透镜，形成磁场。电子束通过透镜改
变方向进行会聚，相当于可见光通过玻璃透镜折射聚焦。
透镜为缠绕的线圈。通过线圈的电流越大磁场越强，放大
倍数越大。
6、电磁透镜的像差
EM在成像过程中受多种因素的影响，造
是最基本的常规制备技术。它是通过一系 列化学方法把组织和细胞制备成树脂包埋块， 进行超薄切片，观察细胞内的微细结构。这种 切片具有以下性能： （1）、最大限度的保持组织和细胞在生活状态 下的结构及形态，保持抗原和酶的活性。
（2）、切片厚度50－100nm，透光度好，耐电子束
轰击
（3）、经电子染色后具有良好的反差并可获得清晰图
1mm (毫米) = 1000um（微米）=10-3m（米）
1um（微米）=1000nm (毫微米) =10-6 m（米）
1nm (纳米) =10 Ǻ （埃，分毫微米）=10-9 m（ 米）
人体细胞膜的厚度约为7-10nm
微绒毛的直径约为 100nm
纤毛的直径约为400nm 根据国际单位制的规定，目前均采用 nm 而不用Ǻ
（2） 扫瞄式电子显微镜
Scanning electron microscope，SEM
A、概念
电子束照射在样品上，产生二次电子等信 息，用二次电子接收器将电子信息收集放大成 像。扫瞄电镜图像为间接成像，其加速电压在 5-30KV之间。 B、特点 （b1） 分辨率高 一般为3nm，放大倍率在 30万倍， 可以连续调节。
（b1）、 分辨率极高 100万倍。 点分辨率0.2-0.3nm，
晶格分辨率0.1-0.2nm。放大倍率可以达到80（b2）、图像特点 C、应用范围
细胞内的微细结构、大分子结构、生物膜的超 微结构等。
视野小、二维结构的平面
图形。超低倍图像，视野大。
广泛用于以生物样品局部切面的微细结构、
JEM-1200
2、分辨率
分辨率（Resolution) 是将邻近两点清晰区 分辨认的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表 示。能辩认的两点距离越小，表示分辨本领越大。
3、反差 眼睛分辨能力与物体观察时环境的照明有 关，与物体和背景间黑白对比度有关，称之为反 差。当反差高时，能从背景上很容易辨认物体， 如果反差低就不能把物体从背景上分辨出来。
行补偿矫正。通常把这个外加磁场叫做消像散器。
（3）、色差(Color Aberration)
光镜的光源是可见光，由不同颜色的光组 成。经过玻璃透镜时，由于波长不同，折射不 同，在光轴上的焦点不一致而发生色差。 EM的照射源是电子束，其波长随加速电 压的波动而变化。当加速电压不稳定时，电子 束波长随之变异，因而发生类似的像差。这种 由电子束波长波动引起的像差叫色差。
氧化锇的穿透深度为0.25mm，戊二醛的穿透
—
深度0.5mm，所以取材时0.5-1.0mm³ 是理想
的尺寸。
D、低温取材
4℃条件下取材，防止细胞自溶
E、防止损伤：取材前作好准备，用铅笔写
好实验标号。取材器具要锋利，动作轻巧 ，防止挤压造成细胞的损伤
样 品 取 材 示 意 图
（b2）、可观察厚样品（小于100nm)和含水的样品， 用特殊“压力样品室”，研究生活状态的细菌和培养 细胞等。
（b3）图像特点
观察细胞表面、内部及细胞骨架结构，可以通过 叠加法，对图像进行立体化处理。 C、应用范围 广泛应用于医学生物学研究中厚样品，含水量大
样品的超微结构观察，还可用于观察活体样品，为细
0.2 nm，比光学显微镜分辨率（250 nm）提高1000倍，
比人眼分辨率（0.25mm)高100万倍。
电镜的分辨率受组织切片厚度的影响，薄片分辨 率可以达到1-1.25nm，厚片分辨率为5-10nm.
4、电镜的照明光源
电镜的照明光源为电子束，由电子枪内钨丝所发射。
给钨丝加上电流，使其加热，放出大量自由电子（热电
性的优点，作为观察微观世界的眼睛是其他科学
仪器所不能取代的。
第一节、电子显微学
电子显微镜（简称电镜）被人们誉为微观世
界的眼睛。掲示了许多生物细胞深层微细结构。
今天，从电镜成像理论到实验技术和分析方法，
都已形成了十分完善的体系，成为一门新的学科
——电子显微学。电镜技术在生物医学、地质、
矿物、材料科学、物理、化学以及晶体学领域，
（1）眼睛分辨率
物体在眼视网膜上成像的大小和物体与眼睛之间
距离有关，眼睛正常工作距离在25cm为明视距离。当
物体和眼睛的明视距离相等时，可以分辨出0.25mm的
两点距离，为眼睛的分辨率。
（2）光学显微镜分辨率
光学显微镜放大物体时，由于可见光波的平均波
长为500nm，当物体两点间距离小于250nm时，光波
产生衍射现象，两点不能辨认。因此光学显微镜的两
点间的小距离是250nm.称之为光学显微镜的极限分辨
率，比眼睛分辨率高1000倍.
(3) 电子显微镜的分辨率
为提高分辨率，用波长较短的电子射线作光源。 电子射线的波长是随加速电压变化的，电压越高波长 越短，分辨率越大。电镜存在球差限制了分辨率，不
能达到其波长之半的程度。较好电镜的分辨率一般为