Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术教学内容

灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义

C(t) value
Threshold line
18.12 +/- 0.04
C(t) value
Ct值的重现性
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
Ct值极具重现性
CT
• 基线代表背景信号，一般前3～15循环所产生的信号 被背景掩盖，这些循环的荧光信号可用基线信号表示。 • 一般选定基线信号标准偏差的10倍作为荧光信号的阈 值，荧光信号到达阈值时的循环数为CT值，该值和初 始DNA模板数目的对数成反比。
Cycle number
Ck
104
Log模板起始浓度与Ct 值呈线性关系。
Lg of DNA concentration
★
荧光标记原理
非特异性荧光标记：SYBR Green
只与双链DNA结合后发光
信号强度与双链DNA分子数 目成正比 便宜、灵敏、使用便捷 对DNA模板没有选择性，容 易产生假阳性结果，对模板 纯度、PCR引物的特异性要 求很高
解链后不能结合发光
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： 此如 也将 SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因
果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，
同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
SYBR Green I染料法——融解曲线
PCR扩增实际过程
PCR扩增的理论模式
PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Xn=Xn-1· (1+E) = Xn-2· (1+E)2=…= X0· (1+E)n 其中E表示扩增效率，指一条单链变成一条双链DNA分子的几率，通常0≤E≤1。 如果将1+E看成整体作为扩增效率，则其值为1-2。Xn表示在n个周期后PCR 产物的分子数量，Xn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。 等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数， 扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.

pcr放大与荧光放大的结合与dna结合时发光游离时不发光sybrgreeni染料法sybrgreeni是一种dna小沟结合染料在pcr过程中染料与dna结合发光聚合完成聚合开始sybrgreeni荧光染料熔解曲线dissociationcurve导数图谱原始数据只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要成本低不需要探针适合初步筛查先用sybr筛查再用探针法精确定量少数关键样品熔解曲线鉴定pcr有无杂带引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低适合于5000拷贝以上的基因定量多重荧光定量原理同一样本多对引物分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针) Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye:
ROX
- passive internal reference for signal normalisation - allows relative (not absolute) fluorescence to be measured - critical for precision
Q
R
Q
AGGCCTTGAGAGATAT MGB
(minor groove binder)
R
提高探针Tm值
AGGCCTTGAQGAGATAT |||||||||||||||| GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC
R 报告荧光 NFQ 无荧光淬灭基团 MGB 小沟结合物
27
3'
5'
典型的PCR分4个阶段
平台期 线性增长期 指数增长期 基线期

实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR，简称RT-QPCR, 属于Q-PCR的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。

荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。

本视频使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂盒介绍SYBR Green I 的非特异性方法。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料，可与所有的各种序列的双链DNA 分子结合。

在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，嵌入至dsDNA，荧光大大增强。

因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，PCR 扩增不同时期中，dsDNA 含量不同，SYBR Green I 荧光信号强度不同。

可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量，并可根据对照进行相关的计算和分析。

实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。

试剂包括：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA。

使用的试剂盒有：用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。

配套LightCycler® 480使用的试剂盒LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了PCR所需的各种实验组分，如1号管中包含热启动Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液，dNTP mix，SYBR Green I染料和MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。

注意：SYBR Green I Master需避光放置。