下载文档原格式
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
一. Odyssey红外成像系统技术特点一般的荧光染料的激发和检测波长都位于可见光谱区，在此波长范围内，化学高分子物质（膜、胶、微孔塑料板等）也会发出荧光，因此易产生高背景的荧光干扰，从而不能有效用于膜上蛋白或者核酸的直接荧光成像。
而在红外波长区这些大分子物质几乎不发出任何荧光信号，使得红外荧光染料在长波下检测时背景荧光很低，具有很好的信噪比，这一特点使得核酸和蛋白的膜上荧光检测成为可能。
LI-COR根据红外荧光的这一特点开发出Odyssey红外成像系统，独特的采用2个红外激光作为激发光源，以扫描成像方式对样品进行检测。
样品载体可以是膜、凝胶和微孔板。
该系统配置的2个红外激光激发光源，激发光波长分别为680nm和780nm，配置的2个高灵敏度光敏二极管可以分别检测720nm和820nm 的发射荧光，因而Odyssey可同时检测两种IRDyes染料的荧光信号。
IRDyes染料的最大吸收值与Odyssey的两个红外激光器680nm和780nm激发波长相匹配，其发射光波长又与Odyssey的两个光敏二极管检测波长相匹配，与同时IRDye700和IRDye800的发射波长峰值相隔100nm，因此Odyssey可以给出最大的灵敏度和最小的信号交叉。
同时由于采用二极管激光器和固态检测器，Odyssey具有很长的使用寿命（激光器使用寿命约4-6万小时），而系统维护的要求却很低。
该系统可广泛应用于信号传导，蛋白磷酸化分析，In-Cell-Western分析等蛋白领域研究。
主要特点1．高灵敏度,效果同于或者好于化学发光法，但不需信号放大步骤，信噪比高。
2．直接检测，无需曝光和显色底物，不需要X光片，不需要暗房，没有放射性废料产生。
3．双色检测，可以在一次杂交中同时检测两种目的分子，直观，省时。
4．宽广的线性范围，可用于高准确性定量。
5．背景低，图像清晰，激光强度可调，不会丢失弱的信号6．强有力的软件支持，结果分析如确定分子量和定量及图象处理编辑很容易7．系统操作和维护简单Odyssey的应用应用领域：蛋白质研究，核酸研究具体包括：Western分析，In-Gel Western分析，蛋白质定量分析，双色磷酸化分析，考马司亮兰胶的扫描，蛋白双向电泳，双色 EMSA，双色微孔板分析，BD PowerBlot Analysis，Northern Blot，Southern Blot等二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间及载重要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：80×70×80cm操作平台载重：40kg3.温度要求：15-25℃4.湿度要求：不超过60%5.电源：90-250V AC，47-63Hz。
全国免费服务热线：400-920-0120 EMAIL:*************专业的成像仪器制造商YOUR RELIABLE IMAGING PARTNER上海勤翔科学仪器有限公司成立于2006年，总部位于上海，是一家集研发、生产、销售、服务于一体的科技型企业，致力于为生命科学行业提供专业的数字成像产品和技术服务。
作为国内最早推出“化学发光成像系统”和“动植物活体成像系统”的企业之一，上海勤翔已为国内包括清华大学、北京大学、复旦大学、上海交通大学、同济大学、浙江大学、武汉大学、中科院、军科院等数百所高校、科研院所及企业用户提供成像系统的解决方案，产品更是远销至美国、日本、韩国等30多个国家和地区，受到了用户的广泛好评！使命 为客户提供超越期望的价值，为员工提供自我实现的舞台。
价值观 诚信、协作、进取、分享企业经营理念 精于品质，专于服务愿景 成为生物医学领域全球领先品牌凝胶成像系统荧光及化学发光成像系统植物活体成像系统小动物活体成像系统蓝光切胶仪紫外切胶仪ChemiSignal™ ECL PLUS 化学发光试剂GelSignal™ Red/GelSignal™ Green 核酸染料0509131721222324企业文化COMPANY CULTURE02 010403系统特色SYSTEMCHARACTERISTIC 超薄蓝光及白光样品台运用磁吸顶针式接口设计，实现蓝光透射和白光透射之间的自由切换，且避免误操作；触摸式亮度调节，便于用户观察及切胶回收。
采用无灯影设计，与传统紫外透射台对比，其透射更均匀，背景更低，成像信噪比也更好。
可切换数据按钮满足客户使用触摸屏及外接电脑的两种操作方式的需求0605产品简介产品应用范围GenoSens系列凝胶成像采集分析系统主要用于对电泳凝胶图像、杂交膜等的分析研究。
高分辨率和高灵敏度的相机可以保证在低照度下不丢失条带。
全自动电脑控制，高程序化，做到操作简单、方便实用。
DNR凝胶成像系统应用一览在生物技术研究中，对核酸分离、蛋白质纯化等过程中，凝胶成像系统的应用广泛存在。
根据对样品染色使用的染料和技术的不同，初步有三方面的应用：1.Colorimetric 可见光成像：主要针对蛋白胶的染色后，分辨蛋白带的应用。
市场上常用的染料包括：Coomassie Brilliant Blue/考马斯亮蓝，silver/银染色或者Ponso 2.Fluorescent and Biofluorescent 萤光和生物萤光成像：例如核酸经溴化乙菲绽(EtBr)染色后，在UV/紫外光照射下成像。
常见萤光染料包括：EtBr，SYBER Green；Cy dyes，Qdots；GFP/YFP，Ds-Red等3.Chemiluminescent and Bioluminescent化学发光、生化反应后发光成像：例如Western Blot/蛋白印迹实验的ECL化学发光法成像，或者生化染料Luciferase/萤光素酶的应用。
MicroBIS 小巧型可见光、荧光成像提供DNR为实验室开发的一款小巧精致的成像仪，可用于广泛的萤光染色及可见光的成像。
技术特点：●Highly sensitive CMOS camera/灵敏的CMOS相机●16-Bit, 1.3 Mpixel camera/130万像素的解析度搭配500万像素的数字解像输出●High quality optics/高质量镜头●Unique illumination/独特暗箱一体化的成像体系●Real Time view and control/高保真成像及控制●Easy to operate/操作简便●Intuitive analysis software/提供可免费升级的Gel Capture软件●FOV – 9cm x 12cm/成像范围适合通用实验室的应用MiniBIS Pro 可见光、荧光成像系统Cost-effectiveHighly sensitive CMOS camera16-Bit, 1.3 Mpixel camera (5Mp images)High quality opticsUser friendly interfaceSmall footprintControlled by PCUnique D-Transilluminator/UV or WL 独具特点的抽屉式透射光源，方便白光、紫外光源间的切换Interchangeable drawers 标配白光、紫外光抽屉，可更换FOV – 12x15 (25mm) or 19x24 (16mm)可选应用范围：MiniLumi: Semi-automatic半自动多色萤光、可见光成像系统Manual Easy operation/适合偏向手动操作聚焦的操作者16-bit, High quality 1.4/2.0 Mpixel cameraZoom lens8 position filter wheel/滤光片轮Epi UV and WL illumination/直射紫外和白光光源Comfortable work spaceReal time image viewing and analysisComplete analysis Software packageLumiBIS 自动多色荧光、可见光成像系统16-Bit, 1.4/2.0 Mpixels CCD camera/可选140万或200万像素CCD相机Motorized zoom lens ( F/1.2, 8-48 mm)/机动化聚焦Smart Dark Chamber with UV protection mechanism /人性化暗箱带紫外防护机制Motorized Emission filters –6 position filter wheel/机动化控制滤光片轮Easy to use and with rapid Real time image viewingAdvanced analysis software package / 标配可免费升级的Gel Capture分析软件MicroChemi 化学发光、可见光成像系统Cost effectiveSmall footprintEasy to useHigh quality optics for high sensitivity 高灵敏度2.0 M pixel camera, 8Mp Images / 200万像素的相机解析度结合软件数据输出可达800万像素的解析能力Cooled to delta -60°C相机冷却系统可将成像温度降低60度Epi illumination for standard imaging 标准仰角光源ECL standard capture and documentationMF-ChemiBIS 化学发光、多色荧光和可见光成像系统Breakthrough, CCD robotic camera 强大的CCD全自动相机Novel Deep Liquid Cooling System for minimum dark noise 结合液体冷却系统，最大极限地降低成像杂色背景cooling delta of -70°C 相机冷却系统可将成像温度降低70度10 types of illumination sources 10种不同的光源F#0.95 super bright lens 广角镜头Eight binning optionsFast , easy fully automated and motorized operationPrecise quantization - no data manipulation。
项目编号:中大招（特）[2011]023号 项目名称：中山大学公卫学院激光共聚焦扫描显微镜采购项目 附件: 激光共聚焦扫描显微镜，1套，要求如下： （一）光学共聚焦扫描系统： 1) 检测成像通道：物理通道数5个，其中荧光通道4个，透射光DIC通道不少于1个。 2) 荧光检测通道均可使用狭缝光谱扫描技术，可进行400～800nm连续无极的光谱扫描； 3) 荧光检测器的要求：有1个荧光通道采用磷砷化镓（GaAsP）超高灵敏度探测器；对极弱荧光信号或者单分子荧光信号可进行检测。另外，荧光检测器提供2个的大靶面探测器（PMT）。 4) 采用单针孔, 各通道扫描图像无错位问题； 5) 激光能快速的双向来回扫描，在扫描完的回程中可进行图象采集，便于快速的FRAP试验； 6) 自动焦面控制系统，通过850nm的LED光对焦面进行实时自动校准； 7) 扫描图像分辨率（不管是二维还是三维图象）均可达到8192X8192以上，线扫描速度可达2800线/秒； 8) 扫描镜：扫描镜采用X2Y三镜扫描； 9) 扫描旋转：自由旋转200°，可在扫描过程中任意旋转； 10) 扫描视场：22mm； 11) 扫描速度: 5帧/秒(512x512 象素)； 12) 共聚焦分析软件系统能控制快速制冷CCD，在不开激光的情况下，共焦软件系统能与CCD、显微镜、快速外置滤块转盘、荧光光源、CO2系统组成完整的活细胞观察系统；
（二）激光器及相关配置： 由AOTF声光调制器控制所有激光谱线: Ar：458/476/488/514 nm 65mW，有4条谱线； HeNe: 543 nm 1mW， HeNe: 633 nm 10mW。 近紫外激光器：405nm 50mW
（三）智能型倒置显微镜主机配置： 1) 采用全自动研究级倒置荧光显微镜。由计算机的激光共聚焦扫描软件系统全自动控制；含明场、荧光、DIC、等基本功能 2) 显微镜通过一个智能外置控制器控制，快速方便，无需接触显微镜，减少样品的污染机会和显微镜震动。 3) 液晶板显示显微镜的当前工作状态，如所用物镜数据、荧光透射光状态、视场光栏和孔径光栏等； 4) 6位电动控制转换的物镜转换台； 5) 配平场半复消色差长工作距离物镜：20X/N.A=0.40；40X/N.A=0.65 6) 共聚焦专用物镜： （1）10× 平场全复消色差荧光物镜，N.A.=0.40； （2）20× 平场全复消色差荧光物镜，N.A.=0.70； （3）40× 平场全复消色差荧光物镜，N.A.=1.30； （4）100× 平场全复消色差荧光物镜，N.A.=1.40，油镜； 7) 电动显微镜调焦精度≤15nm； 8) 三板载物台； 9) 显微镜除了荧光和透射光之外，配全自动微分干涉，从明场到微分干涉一键操作。 10) 目镜系统符合人体功能学的设计，观察角度10º～45º垂直可调。采用大视野的10X目镜，FOV=25mm，； 11) 显微镜透射光源：100卤素灯箱及集光器和灯座，12V 100W 卤素灯。 12) 电动长工作距离聚光器,工作距离28mm，7孔位电动转盘，电动孔径光阑，N.A.=0.55。 13) 荧光光源：应采用长寿命金属卤化物做光源，使用寿命不低于2000小时，光源应为光纤导入式的冷光源； 14) 6位电动荧光滤块转盘，置换方便，配紫外、蓝、绿三块荧光激发滤块，其中紫外激发：BP340-380,400,LP425、蓝色激发BP470/40,500,BP500~550、绿色激发：BP515-560,580,LP590； 15) Fura 2滤片组包括: Fura 2 滤片给外置滤片转轮插片, 滤光块 Fura 2 340nm/380nm；
（四）计算机及软件部分 1、计算机：高性能的世界知名品牌原装机，各种硬件配置（图像象、数据储存介质）齐全，可靠和稳定，配置应不低于： P Ⅳ 3.2G CPU； 2.0G DDR2内存； 200GB硬盘； 16X HP DVD-Writer 配两台大屏幕的19寸LCD显示器或1台30寸液晶显示器，更加方便使用者对采集图象的观察，分析和处理。 2、分析软件：一般要求 建立在windows 7系统上，使用先进程序语言，程序执行效率高，快，稳定。整个系统程序，包括控制，检测、分析功能设计合理，操作界面友好，操作简便。扫描后图象以及数据输出转换快捷，多样，容易。能进行三维重组分析，时间扫描分析。提供生理学软件模块，可用于离子测量、PH测量等应用，包括各种离子测量用荧光染料的数据库，可直接计算离子浓度，实时获得离子浓度信号和图象。可编程的 Time course 功能，复杂扫描程序的预先编程。执行过程中的互动调整。适合活细胞研究，如FRAP, FLIP, FRET等应用。也可标记出ROI进行特定区域荧光信号变化的跟踪，如钙离子测定的研究。能对样品发射荧光，进行从400-800纳米光谱扫描，及光谱解混分析软件功能,包含dye finder 软件。 1）生理学分析软件 活细胞图像时间变化记录 快速同步双扫描点漂白实验 离子浓度测量 有强大的BestFocus功能，使共焦在长期观察时能始终处于最佳焦面。 2）三维软件 各种重组和表达功能 立体显示，三维动画，3D过滤等 多种表达方式：平均法，最大点法 3）能对样品发射荧光，进行从400-800纳米光谱扫描，及光谱解混分析软件功能,包含dye finder 软件 多染色区分 染料分离 相似发射波长的光谱分离 4）专用的FRET及FRAP,FLIP软件包
5）共聚焦分析软件系统能控制快速制冷CCD，在不开激光的情况下，共焦软件系统能与CCD、显微镜、荧光光源、CO2系统组成完整的活细胞观察系统；
(五)CO2孵育观察装置 1）双通道温度控制器，双通道可独立调节，温度使用线性的 PID 控制；温度控制范围：高于环境3 至 60 度, 0.1 度调节； 2）CO2控制器：温度范围：高于环境3至 40 度，控制精度：±0.1℃； CO2检测范围：0~10%，控制范围：0~7.5%；控制精度：0.1%； 3）配两个培养箱，一个专用于培养皿或灌流培养装置，一个专用于多孔板； 4）热插件P：温度控制范围：高于环境3至 40 度，高26mm，顶开口80X90mm，外径220X180X50mm； 5）6孔板热插件和96孔板热插件：高于环境3至 40 度，高29mm，顶开口135X123mm，外径245X210X50mm；
(六)活细胞系统： 1.核心应用软件,其功能如下: 1) 界面友好直观, 优化数据处理和快速采集和大数据量显示. 2) 应用: 多维度采图, 图象叠加. Z轴 对叠(需电动 Z 调焦装备). 3) 时间顺序采图. 4) 定标,寻找和拼图(需备电动物台). 5) 完整控制数码相机,如曝光, 增益, binning, 黑的, 白的, 伽玛值,区域采集等. 6) 完全控制电动显微镜. 7) 自动实验条件保存和恢复. 8) 大图象视窗, 自动的显示时间顺序和 Z轴对叠. 9) 实验结构数据管理费储存, 重命名, 拷贝, 删除, 输出为 tif, avi, jpeg 等格式. 10) 图象处理:调节反差, 亮度和伽玛, 图象剪裁. 11) 测量: 强度, 长度和面积. 整个图象堆叠区域强度测量. 在活图上在线测量. 比率测量. 可添加应用模块选项. 在线帮助, 用户手册 12) 用光密度发测量荧光强度. 13) 高速套装: 照相机高速控制, 高速控制外置滤片转轮,
2.3D软件: 建立多通道 3D 电影, 硬件狗保护. 能够象共聚焦显微镜一样采集各个焦平 面的图像，根据需要能够分析特定焦平面图像，并可以把含有不同Z轴信息 的图像输出成一张包含3D信息的2D图像。
3. 动态生理学软件模块,其功能如下: 1) 实时改变参数设置 2) 用图形宏语言连接不同时间序列: 不同时间序列的设置; 不同时间序列 3) 的连接( 设置暂停时间; 设置循环; 设置触发模式),可依实验条件不同如施加处理因素(前、中、后)预设多个时间序列,不同序列的采图条件可相同或不同，多个序列之间可用图形宏语言通过不同方式连接，包括：直接连接或设置一定暂停时间；设置循环；通过 TTL 控制, 触发功能可结合外围器件如显微注射器, 药物灌流装置和电生理器件, 电极,膜片钳等, 与外接装置的信号记录同步化,要求外部设备的信号采集能够同步化或延迟特定时间。实现多通道3D图像采集,对活细胞进行动态观察并快速高清晰成像，活细胞图像处理、活细胞动态成像示踪，可实现分子水平的研究 4) 实时及离线定量: 感兴趣区域荧光强度的实时在线定量; 不同通道荧光 5) 强度比值计算; Ca2+比值或浓度计算; 相对荧光强度改变分析; 6) 自动聚焦跟踪. 4. FRET敏感发射. 一步接一步提示来在活样品中做一个容易的过程给 FRET 测量, 记录在活细胞中分子交互作用发生的荧光能量转移事件. 用 户导引做背景修正和串色移除. 在线和离线定量 FRET 效率在用户定义 区域内和该结果将会为一个 FRET 效率地图来显示. 输出数据为 *.xml 格式.
5.数码成像器: 1. 0.70x图象接口 2. 半导体制冷显微数码相机: 制冷温度低于环境-20℃。 3. 物理分辨率1392×1040，Pixel Size = 6.45µm×6.45 µm，Sensor Size = 9.0 mm×6.7 mm。 4. 动态范围1:2000 5. 像素尺寸：6.45 µm x 6.45 µm 6. 芯片尺寸：2/3"CCD 7. 最大采集速度: 20 frames/sec（1392×1040）。 8. 曝光时间：4 µs to 600 s 9. 数字化范围：14Bit 10. 具有BINNING模式，2X2,3X3,4X4,5X5, 11. 传输方式：IEEE 1394b。 12. 信噪比：1250:1。 售后服务：自验收合格之日起，由乙方提供不少于2年的免费保修服务（另有特别说明的，按其要求执行），该项为不可偏离条款。保修期有不同提供方的，需说明提供方的顺序和各自期限。保修提供方最多不得超过两个。
