《微生物综合实验》报告册
专业 2013级生物科学（生物学基地班）
学号
姓名
生命科学学院
二O一六年六月
实验一、细菌的分离与纯化
一、实验目的
1、掌握培养基的作用和NA培养基的配制
2、熟练掌握无菌操作技术（灭菌锅和超净工作台）
3、掌握分离纯化菌种（涂布平板法和划线分离法）
4、了解菌种保种的方法
二、实验原理
1、培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。NA培养基主要成分为：牛肉膏、蛋白胨和NaCl。蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压并提供微生物生长所需的矿物元素之一——钠离子；需要时可以使用琼脂作为培养基的凝固剂。
2、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。试验中通过选用某种分离的方法在平板上进行操作，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。
三、实验材料
1、菌种：待分离纯化的菌
2、实验药品：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，去离子水，琼脂（或琼脂粉）
3、实验器材：电子天平，超净工作台，恒温培养箱，摇床，灭菌锅，试管，试管塞，锥形瓶，玻璃棒，封口膜，烧杯，培养皿，接种环，酒精灯，移液枪，枪头，1.5mL离心管
四、实验步骤
1.制备培养基
NA培养基配方（g/L）：牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
（固体培养基需要加入琼脂15g/L，pH=7.3±0.1）
依次称取蛋白胨、牛肉膏和NaCl到烧杯中，取所需水量的一半放入烧杯中溶解，用NaOH调节pH至7.3，最后补足水量（若配固体培养基则另加琼脂粉），培养基经分装包扎之后，立即进行高压蒸汽灭菌，12l℃灭菌20 min。
2、目的菌株的分离、纯化
（1）摇床培养：用接种环从长有未知菌的培养基中刮取未知菌到5ml NA液体培养基试管，摇床培养8-12小时以获得菌液。
（2）梯度稀释：吸取100ul上述菌液和900ulLB液体培养基在1.5ml离心管中震荡混匀后获得终浓度为10-1的菌液；再将此菌液作为母液用上述方法进行稀释，震荡混匀后获得终浓度为10-2的菌液；此后都将新稀释的菌液作为母液，用上述方法进行稀释，震荡混匀后依次获得终浓度为10-1、10-2、10-3和10-4的菌液，同时将这四个菌液作为待纯化的菌液进行平板划线接种。
（3）倒平板：将NA固体培养基融化后，倒10～12mL于灭过菌的培养皿中，待凝固。
（4）涂板分离：将不同浓度的菌液各自取150μL于NA固体培养基中，用涂布器涂匀至干，正置5min，放入28度培养箱培养16-24h。
（5）划线分离：用接菌环去不同浓度的菌液分别于相对应的NA无菌平板上进行划线分离，左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按四个分区进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。
（6）挑取菌株：从培养皿中刮取单菌落到5ml NA液体培养基试管中，培养8-12小时以获得菌液。
五、注意事项
1、配好的培养基应立即高压灭菌，防止杂菌生长，改变培养基的成分。
2、划线分离时及前后，接菌环要灼烧干净，防止杂菌污染。
3、由于放线菌菌丝致密不易挑起，故应连带培养基一起挑起于液态培养基培养，再进行划线分离或是涂布分离。
六、实验结果与讨论
1、实验结果
分离纯化：纯化培养：
2、讨论分析
从实验的结果上来看，基于实验所用的待测放线菌，划线分离的效率和获得单菌落的可能性都较大于涂布平板方法，仅有划线分离的平板上成功生长出单菌落。原因可能是由于放线菌在液体培养基中的菌丝抱团形成菌丝球在涂布过程中难以被打开导致较难生成单菌落。而在平板培养过程中可以发现待测放线菌菌丝较细，生长缓慢，相互缠绕，形成的菌落质地致密、表面呈较紧密，菌落坚实较小而不蔓延。纯化培养如图，培养基澄清，细菌以菌丝球形式存在，都符合放线菌的特征，说明该步骤的分离和纯化是成功的。
实验二、细菌显微形态观察
一、实验目的
1、掌握革兰氏染色法鉴别细菌的原理及操作方法；
2、学会使用油镜观察细菌的形态，初步鉴定待测菌；
二、实验原理
革兰氏染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
三、实验材料
1、菌种：在平板上生长16小时的待测菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
2、试剂：无菌水，草酸铵结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，液体石蜡。
3、实验器材：普通光学显微镜，超净工作台，灭菌载玻片，吸水纸，擦镜纸，接种环，酒精灯，打火机，计时器。
四、实验步骤
1.革兰氏染色确定待测菌的阴阳性
（1）涂片：取灭过菌的载玻片于超净工作台上，并滴一小滴无菌水在载玻片的中央，再用烧红冷却后的接种环挑取单菌落至无菌水滴中，并涂抹成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
（2）干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
